林木转基因工作研究进展

生物技术自 70 年代崛起以来, 发展非常迅猛, 现已成为世界新技术革命的重要组成部分。生物技 术将为人类的未来带来极大的社 会效益和经济效 益, 尤其对未来的农林业生产将带来一场新的绿色 革命。植物基因工程技术是植物生物技术的核心内 容之一, 它是将带有一些特有性状的基因克隆, 并 通过生物、物 理、化学等 方法, 导入受 体植物细 胞, 得到具有外源基因表达的转基因植物。外源基 因导入植物受体包括目的基因的分离, 外源基因与 载体分子的体外连 接, 基因转 化, 转基 因植株培 养, 外源基因的鉴别等步骤。林木转基因研究工作 与农作物等其他草本植物相比, 一直处于相对比较
完成, 肉桂醇脱氢酶 ( CAD) 是催化木质素前体生 成的最后一步反 应。Baucher 等[ 34] 1996 年利 用反 义 DNA 和共抑制策略, 使转基因杨树植株的 CAD 活性 减 少 70% 。 另 一 种 咖 啡 酸 羟 基 转 移 酶 ( COMT ) 催化 木质 素单 体形 成。Doorsselaere JV 在 1995 年构建了反义和有义的 COMT 基因, 并导 入欧洲山杨和银白杨中, 反义构建的四个转基因植 株中, 有 2 株 COM T 活性减少 70% , 另外两株减 少 95% 。 3 5 生产药物
( 4) 原生 质体的转化。Gupta 等[ 26] 将荧 光素 酶基因转入北美黄杉及火炬松原生质体中, 并在培 养过程中存活的原生质体及再生细胞中测到了外源 基因的表达, 但木本植物原生质体培养周期长, 难 度大, 再生频率很低, 多数培养仅能形成细胞团和 愈伤组织, 真正得到转化的报道很少。
( 5) 附体腋芽转化。李卫等[ 27] 利 用沙田柚一 年抽梢三四次及自然出芽的特点, 采用农杆菌直接 感染附体叶腋并辅以打顶、生芽培养基促芽生长的 方法, 选择从芽诱导生根得到表达 GUS 基因的完 整转基因植株, 转化有效率为常规农杆菌介导法的 3~ 6 倍。
( 3) 受 体 细 胞胚 或 胚 性 细 胞转 化。1988 年 M cG ranna han 等[ 20] 首次报道了美国西部核桃体细 胞胚转化 NPT - 等基因获得成功。近年来用体
细胞胚作为外植体已在核桃、山核桃、木瓜、桃上 得到转化[ 21~ 24] 。Wenck 等[ 25] 最近报道用快 速分 裂的胚发生悬浮培养细胞与农杆菌共培养, 得到高 效表达报告基因的挪威云杉和火炬松。
( 2) 蛋白酶抑制剂基因。蛋白酶抑制剂也是一 类抗虫小分子蛋白, 可以使害虫消化不良, 延长其 发育时间, 减少每年的繁殖代数, 降低害虫的种群 数量。蛋白酶 抑制剂一般不会引 起害虫的彻底死 亡, 这就避免产生较高的选择压力, 害虫的抗性不 至很快提高。目前已获得苹果、杨树、桦树[ 33] 等
树种的转基因植株。
( 1 ) 受 伤 植 物 器 官 的 直 接 转 染。 1985 年, Horsh[ 6] 等首创根癌逐杆菌介导的烟草叶盘转化法 获得转基因植株, 使人们考虑直接用木本植物的组 织块进行转化。最常用的木本植物外植体为受伤叶 片、茎段和叶柄, 已在欧洲黑杨、毛白杨、杨树、黑刺 槐、苹果、李、桃、杏、猕猴桃、柑桔[ 7~ 17] 等树种上得 到成功。冯勤等[ 18] 以小粒种咖啡幼小胚苗的下胚 轴及子叶为转化受体, 用野生型根癌农杆菌感染, 得 到了可继续生长的畸胎小芽并测到了 GUS 基因的 表达, 进一步扩大了叶盘法的应用范围。
第 28 卷第 4 期 2001 年 12 月
湖南林 业科技
Hunan Forest ry Science & T echnolog y
文章编号: 1003- 5710 ( 2001) 04- 0019- 07
Vol. 28 No. 4 Dec. 2001
林木转基因工作研究进展
贺晶, 谭晓风, 杨伟
农杆菌 ( Ag robat erium) 介导的遗传转化是外 源 DNA 导入植物最成功和应用最为广泛的方法。 自 1976 年 D Cleene 和 D. LEY [ 4] 首次报导用根癌 农杆菌 B6 ( LM G18) 也能感染裸子植物受伤组织 并产生冠瘿瘤 ( crow n g all) 后, 许多学者开始利 用农杆菌进行木本植物的基因转移。农杆菌转化植 物细胞是通过将其体内的一段 T - DNA 转移到被 侵染植物细胞而实现的。农杆菌介导的基因转化具 有转化频率高, 导入细胞片段确切, 遗传物质扩散 危险低, 导入基因拷贝数低, 表达效果好的特点。 其因转化受体系统及方法主要有下面 5 种。
2 转基因植物的鉴别
获得转基因植株后, 鉴定外源基因是否转入的 方法一般 包括: 报 告基因 检测、DNA 分 子鉴 定、 RNA 分子鉴定、蛋白质分子鉴定等。检测报告基 因 ( Gus, Nos, Gat 等) 是较为方便的鉴定手 段, 可以确定外源基因的存在和表达, 主要用以筛选转 化植株; DNA 分子鉴定包括点杂交、Sout hern 杂 交和 PCR 扩增等。Southern 杂 交应 用较 为普 遍, 其特点是可信度高, 可以获得外源基因整合位点、 整合特性和拷贝数等大量信息, 但操作程序复杂, 鉴定的 样品数量 有限。而 P CR 扩增 由于其快 速、 简捷, 只需少量 DNA 样品, 且能鉴定大量样品的 优点, 目前应用最为普遍。RNA 分子鉴定一般采 用点杂交和 Northern 杂交, 用以了解 外源基因的 转录情况。DNA 和 RNA 分子鉴定依赖于碱基因互 补配对的原理, 而蛋白质分子鉴定的基础是抗原抗 体反应, 主要有 Western 杂交和酶联免疫技术, 但 在林木转基因植株鉴定中较少用到[ 28~ 31] 。
3 2 林木的抗病性研究 林木病毒病害是造成损失最大的病害之一。通
常有 5 种方法, 它们是分别借助于病毒的外壳蛋白 基因、病毒的卫星 RNA、病毒的反义 RNA、植物 本身编码的抗病基因、病毒的其他基因。最常用的 是用病毒外壳蛋白基因培养抗病毒植株。目前这一
技术已用于柑桔上。
3 3 林木的抗除草剂研究 林木抗除草剂基因工程中, 目前导入木本植物
3 4 改善材质 木质素是维管植物细胞壁的组成成分, 在木本
植物中, 木质素的含量在 15% ~ 36% 干重, 在制 浆造纸工业中必须除去, 这需要消耗大量能源, 并 产生大量的有害物质, 降低林木中木质素的含量和 改良木质素的组成, 对于改善环境, 提高经济效益 都有积极的意义。木质素的形成由一系列酶促反应
直接 DNA 转化法是将外源基因 ( DNA) 直接 转化植物原生质体或植物细胞, 由此获得转基因植 物。这些方法包括以原生质体为受体的 PEG 转化 法、电激法、脂质体介导转化法、显微注射法、激 光微束法、超声波法、花粉管通道法以及基因枪技
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术等。 基 因枪 技 术 又 称 粒 子 轰 击 技 术 ( Part icle bombardment) 、生 物发 射 技术 ( Biolist ic process) 或高速微粒 子发射技术 ( hig h- velocit y micropro jectile) , 它是借高速度运动的金属微粒将附着于其 表面的核酸分子引入到受体细胞中的一种遗传物质 导入技术[ 2] 。基因 枪大体可以分为 火药式、放电 式、和气动式三种类型。它具有无宿主限制, 受体 类型广泛, 操作简便, 快速等特点。目前, 在林木 上基因枪成功应用的例子有杨树、云杉、蔓越桔、 番木瓜等。 1 2 农杆菌介导植物转化
Zhuzhou 412006, Hunan, China)
Abstract: T he prog ress of gene transformation in forest t rees w as summarized in t he paper. T he met hods, the ident ification and applicat ion w ere major discussed in t he paper. T he internal and ex ternal st udy achievements w ere sum med up in t wo charts. At t he end of the paper, t he existing problems and out look of the gene t rans f orm at ion in trees w ere point ed out. Key words: forest t ree; gene transformation; prog ress
( 3) 蝎神经毒素基因。资料表明, 昆虫特异性 蝎神经毒素 AalT 具有较高的选择性, 对哺乳动物 和其他动物无害, 安全性好, 对许多鳞翅目害虫具 有较高的毒性, 是十分理想的 抗虫基因源[ 34] 。伍 宁丰等[ 32] 通过农杆菌介导法, 利用优化了的密码 子的 AalT 基因转化杨树杂种 NL- 80106 获得转基 因植株。
( 中南林学院经济林育种与栽培国家林业局重点实验室, 湖南 株洲 412006)
摘 要: wenku.baidu.com合论述了近年来国内国外林木转基因工作研究进展, 其中主要就林木转基因的方法、
转基因植株鉴别、转基因在林木上的应用几方面进行了探讨, 并将国内外林木转基因工作列表加
以综合, 最后指出了林木转基因工作中尚存在的问题及对未来转基因工作的展望。
关键词: 林木; 转基因; 研究进展
中图分类号: Q813
文献标识码: A
The progress of gene transformation in trees
H E Jin, TA N Xiao- feng, YA NG Wei
( National Forestr y Bureau Key L aboratory of No n- timber Product For est ry Br eeding and Cultiv ation, Central South Forestry U niv ersity,
( 2) 整体植株接种共感染。一般采用种子实生 苗或试管苗作为外植体, 人为地在整体植株上造成 创伤, 然后把农杆菌接种在创伤面上, 或用针头把 农杆菌注射到植株体内使其进行侵染转化。目前此 方法主要针对针叶树 叶形细小, 韧皮部粗厚的特 点, 在部分针叶树种上得到成功。如欧洲落叶松、 杂种 落 叶松 和 挪威 云 杉上 得到 稳 定 的再 生 转化 株[ 19] 。
翅目的害虫抗虫效果显著。伍宁丰等[ 32] 1991 年首 次报道了用 Bt 基因转化欧洲黑杨, 得到转基因植 株。田 颖 川 等[ 6] 1993 年 用 含 Bt 基 因 的 农 杆 菌 LBA4404 转化 欧洲 黑杨, 共获 得 54 株 转基 因植 株。此外, 一些研究者还获得转 Bt 基因美洲黑杨、 胡桃等。
3 林木转基因的应用
3 1 林木的抗虫性研究 林木虫害严重, 抗虫基因工程为解决这一难题
提供了一个有效手段。 ( 1) Bt 毒蛋白基因。Bt 毒素对许多害虫都有
抑制和杀伤作用, 作为生物杀虫剂被广泛应用于林 木的害虫防治。Bt 毒素对某些森林害 虫尤其对鳞
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的外源基因主要有: 来自沙门氏菌的 aroA 基因和 来自吸水链霉菌的 bar 基因, F illat li J 等[ 37] 用农杆 菌介导突变的 EP SP 合成酶基因 aroA, 转入银白杨
大齿杨中, 转基因植株获得了对除草剂草甘磷的 抗性。De Block M 等[ 38] 在 1990 年, 用 bar 基因转 化银白杨 美洲黑杨, 转基因植株与对照相比, 明 显抗草甘磷。
收稿日期: 2001- 09- 03 修订日期: 2001- 10- 28
落后的位置, 近几年来, 随着分子生物学研究技术 不断成熟, 木本植物在这一方面也取得了长足的进 步, 本文旨在对林木转基因 研究工作现状做 一综 述。
1 林木转基因方法
基因转移方法大致可以分为两类: 一类是基因 的直接转化法; 另一类是通过一种可以使植物致瘤 的土壤农杆菌的质粒来转化植物[ 1] 。 1 1 直接 DNA 转化法