2012本科实验和答案

2,6-d的注意事项：1，整个操作过程要迅速，防止还原性抗坏血酸的氧化2，干扰物的反应进行较快，本实验必须在酸性条件下进行

蛋白质电泳

一、实验原理

1.简述醋酸纤维薄膜电泳分离人血清蛋白基本原理。

2.如果样品液中含有三种蛋白质A、B、C，它们的等电点和分子量分别是MrA：36KD，pI A：5.2；Mr B：60KD，pI B：6.5；Mr C：28KD，pI C：4.7。在pH8.6，静电场80V条件下，经过40min钟电泳，染色脱色后，从阳极到阴极的排列顺序如何？

3.PAGE是现代生物科学研究中主要用来分离分析蛋白质、酶等生物大分子的核心技术之一，该技术分辨率较高的主要因素有哪几种？简要说明。

4.PAGE技术方法中，凝胶的聚合原理及凝胶的结构特点如何？

5.简要说明SDS-PAGE技术方法原理及在科研中的应用？分离pr，测定其压机的相对分子质量或者选下面的（看一下然后自己感觉重要的记三四点就行）

1. 蛋白质纯度分析；

2. 蛋白质分析量的测定，根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量；

3. 蛋白质浓度的测定；

4. 蛋白质水解的分析；

5. 免疫沉淀蛋白的鉴定；

6. 免疫印迹的第一步；

7. 蛋白质修饰的鉴定；

8. 分离和浓缩用于产生抗体的抗原；

9. 分离放射性标记的蛋白质；

10. 显示小分子多肽。

6.影响电泳分离效果的主要因素有哪些？

7.琼脂糖凝胶电泳技术方法一般常用来分离分析何种生物大分子？、核酸（及其片段的分离）

8.常见的凝胶电泳还有那些介质或支持物？

二、操作技能

1.电泳技术涉及其主要仪器或设备有哪些？电泳槽烘干机

2.电泳试验中，点样量的多少对分离结果可能会产生怎样的影响？

3.电极缓冲液及载体（醋酸纤维膜或凝胶）的pH值与缓冲能力对蛋白质分离是否会产生影响？简单讨论。

4.商用的醋酸纤维薄膜（2×6cm）在点样之前应该进行怎样的前处理？

5.醋酸纤维膜电泳分离人血清蛋白过程中所用的电极缓冲液是什么？该缓冲液的pH值是多大？如果该缓冲液的pH如果是12.0或者是4.0，可能会对人血清蛋白质电泳结果产生怎样的影响？

6.普通电泳技术方法和高压电泳技术方法中的电压控制范围各是多大？

7.根据已有知识如何解析蛋白质电泳图谱（指纹）可能涉及到的生产与科研中的问题？

（鉴定疾病科学家已经确定了各种疾病的特殊标志分子，发现一个蛋白不同片段变异是不同类型肿瘤或其他疾病的标志。因此，这一技术有望为疾病的诊断、治疗和药物开发带来突破性进展）

8.醋酸纤维薄膜电泳分离人血清实验方法中，透明液成分是什么？

9.醋酸纤维薄膜电泳分离人血清实验方法中，染色液成分是什么？

染色液：氨基黑10B 0.5g, 甲醇50ml, 冰醋酸10ml，蒸馏水40ml，混匀。

10. 醋酸纤维薄膜电泳分离人血清实验方法中，电压正常范围是多大？电压过大会造成什么

样的结果？电泳电压大小，时间长短与缓冲液的离子强度都有一定的关系。一般电流约0.4—0.6mA/cm,电压110—160V，通电时间40—60min。电压高，电流大，电泳速度加快，时间可缩短，但薄膜上蒸发严重，因此不能无限增大电流。

维生素C的测定

一、实验理论

1.指出本实验采用的定量测定维生素C的方法有何优缺点？

优点：它具有简便易行、快速、比较准确等优点，

缺点：易受其他还原物质的干扰；滴定终点难以确定

2. 2,6-D的作用是什么？

1，氧化剂的作用。还原抗坏血酸

2，作为指示剂，判断滴定终点，以计算样品含量。

3.用2%草酸提取样品的目的是什么？

4.本实验中设计的空白试验的目的？

二、操作技能

1．滴定管的使用

（1）洗涤：（2）装液：（3）读数：（4）滴定：

纸层析分离氨基酸

一、实验理论

1．为什么苯丙氨酸的Rf值大于赖氨酸

2．为什么脯氨酸和茚三酮加热后是黄色斑点

3．说明纸层析和离子交换层析分离氨基酸混合物的方法是根据氨基酸的什么性质?疏水性质4．什么是分配系数？

5.氨基酸纸层析系统的成分？

6. 氨基酸纸层析喷茚三酮显色时应注意些什么？均匀少量

二操作技能

1．纸层析和柱层析的一般操作步骤

纸：点样-层析-标记前沿-烘干-显色-得到层析图谱-标记色斑

柱：装柱-平衡-上样-洗脱-收集，检测，测定-

双缩脲法测定蛋白质的含量

一、实验理论

1．双缩脲法定量测生物材料中蛋白质是否适合所有样品，如植物块茎等

不是，在生物实验中双缩脲试剂是用来检测蛋白质的，现象是出现紫色，选材要选蛋白质含量高，颜色为白色的或接近白色的材料，并非适用所有生物样品

2．试验中加入四氯化碳的作用？

3．72型分光光度计的原理及使用时的注意事项是什么？

4．比色测定时为什么要设计空白管？通过溶液的光主要被吸光物质吸收，但同时溶液、溶剂及比色杯对光也有少量吸收和反射，从而引起误差，此时，测定时常采用空白试验作参比

5.比值法——双缩脲法定量测定蛋白质含量的优缺点？

优：快速，蛋白质特异性影响小

缺：准确度差，蛋白样品被破坏，干扰因素不易消除

二、操作技能

1．普通离心机使用时正常操作程序如何，使用时应注意什么

2．可见分光光度计的使用操作

3．振荡器的操作

淀粉酶活力的测定

一、实验理论

1．如何正确绘制和使用标准曲线?

在制备标准曲线时，标准液浓一般可选择5种浓度梯度，测其吸光值，以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制曲线，需要至少有三个点在标准曲线上才可用，绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用，

2．将淀粉酶原液置70℃水浴中保温的作用

3．淀粉酶原液和1%的淀粉溶液置于40℃水浴中保温的作用

2．酶反应需要适当的温度，只有在一定的温度条件下才表现出最大活性，40℃是淀粉酶的最适温度，所以应将酶液和底物（淀粉液）先分别保温至最适温度，然后再进行酶反应，这样才能使测得

的数据更加准确。

4．若要测定β淀粉酶活性需把淀粉酶原液置于什么条件？

5．设计β淀粉酶活性测定流程并写在实验报告上。

6. DNS试剂在淀粉酶活性测定中的作用？

7. 淀粉酶的最适PH值是多少？

二、操作技能

1.如何操作能减小标准曲线结果误差？

标准曲线的作法

(1)标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。

(2)标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。

(3)标准曲线图的绘制：一般常用的是光密度一浓度标准曲线。

①用普通方格纸作图。图纸最好是正方形(长：宽=l：1)或长方形(长：宽=3 ：2)，以横轴为浓度，纵轴为光密度，一般浓度的全距占用了多少格，光密度的全距也应占用相同的格数。

在适当范围内配制各种不同浓度的标准液，求其光密度，绘制标准曲线，以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点即为此座标标点。然后，将各座标点和原点联成一条线，若符合Lambert-Beer氏定律，则系通过原点的直线。

②若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。

③标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温。

④绘制标准曲线：一般应作二次或三次以上的平行测定，重复性良好曲线方可应用。

⑤绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。当更换仪器、移动仪器位置、调换试剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新绘制。

⑥标准曲线横坐标的标度：从标准液的含量换算成待测液的浓度。