腺病毒载体构建分析
TIMP-3N端结构域重组腺病毒载体的构建与鉴定的开题报告
TIMP-3N端结构域重组腺病毒载体的构建与鉴定的开题报告1.研究背景组织金属蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）是一种重要的蛋白质, 在细胞外基质的代谢中起到关键调节作用。
TIMP-3通过抑制细胞外基质蛋白酶的活性, 可以防止血管增生、细胞迁移和肿瘤形成等多种疾病的发生。
因此, TIMP-3的研究在生物医药领域有着广泛的应用价值。
为了更有效地研究TIMP-3的功能和机制, 研究人员通常会采用基因工程方法构建TIMP-3基因的合成载体, 并进行表达和纯化。
近年来, 利用腺病毒作为载体的基因转染技术已经成为常用的基因转移方法, 因为腺病毒具有高效的基因转染能力、针对性强以及易于操作等优点。
2.研究目的本研究旨在构建一种TIMP-3N端结构域重组腺病毒载体, 并通过激光共聚焦显微镜、Western blot等方法对其进行鉴定, 为后续TIMP-3的功能研究提供支持。
3.研究内容和方法3.1 构建TIMP-3N端结构域重组腺病毒载体根据TIMP-3的序列, 合成TIMP-3N端结构域的cDNA, 并将其克隆到经过修饰的腺病毒载体中。
然后, 将构建好的载体转染到HEK 293FT细胞中, 并筛选出稳定的重组腺病毒载体。
3.2 鉴定TIMP-3N端结构域重组腺病毒载体通过激光共聚焦显微镜观察TIMP-3N端结构域的表达情况, 并使用Western blot 方法检测TIMP-3N端结构域的蛋白表达水平和纯度。
同时, 通过对重组腺病毒载体传染其他细胞系, 检测其基因转染效率和稳定性。
4.预期结果本研究将构建出一种TIMP-3N端结构域重组腺病毒载体, 并通过激光共聚焦显微镜、Western blot等方法对其进行鉴定, 验证其表达能力、纯度以及基因转染效率和稳定性等参数。
这将为后续TIMP-3的功能研究提供重要的实验支持, 具有重要的理论和应用价值。
腺病毒载体的构建和应用
腺病毒载体的构建和应用随着生物工程技术的不断发展，越来越多的生物医学研究领域开始趋向于基因治疗和基因编辑等方向。
这些技术的实现需要一种特殊的工具——腺病毒载体。
腺病毒（Adenovirus）是一种不包含RNA病毒的DNA病毒，其表面包裹着许多蛋白质，使其具有较好的基因导入能力。
这使得腺病毒成为一种常用的基因载体，被广泛应用于细胞遗传学、基因治疗等领域。
腺病毒的构成腺病毒包含一个大小为36 kb的线性双链DNA，这条DNA上编码了丰富的基因信息，其中大约包含40个基因左右。
腺病毒分为革兰氏正染色体和非冠状病毒两种类型，目前在研究中应用最多的是非冠状病毒型腺病毒。
腺病毒载体构建的两种方法目前有两种主要的构建腺病毒载体的方法，分别是端到端的法和质粒基因重组的法。
端到端的法端到端的法在构建腺病毒载体时需要把目标基因全长克隆进腺病毒的基因组中。
这种方法在基因克隆、重组和转染等方面比较复杂，对实验人员的操作技能要求较高。
同时，这种方法的构建产物相对来说比较容易受到细胞内DNA修饰和限制性酶的影响。
质粒基因重组的法对比之下，质粒基因重组的法相对来说较为容易，需要构建的重组质粒包括表示目标基因的转录单元以及与腺病毒DNA重组所需的旁路序列等。
通过将质粒DNA转染至腺病毒蛋白质、酶和基因表达产物等组分共同构成的细胞核中，将质粒DNA与腺病毒DNA进行重组，从而构建出目标腺病毒载体。
质粒基因重组法不仅可以有效克服端到端法受到限制性酶和DNA修饰的影响，而且富于设计灵活度，从而满足更多的实验需求。
腺病毒载体的应用腺病毒载体广泛应用于人类和动物细胞体内的基因传递、基因治疗和基因工程方面。
通过腺病毒载体可进行基因敲除、基因转录和基因转译等一系列基因编辑操作。
基因敲除基因敲除是研究腺病毒载体理解生命过程和信号转导途径的重要手段之一。
通过基因敲除的方法可以对特定基因进行敲除，从而寻找与该基因相关联的复杂的生物学催化剂。
目前腺病毒载体敲除方法尤其得到广泛应用，对于生命科学研究者来说具有重要的意义。
腺病毒体的结构和功能研究
腺病毒体的结构和功能研究腺病毒是一类广泛存在于自然界中的病毒，其细胞寄主包括哺乳动物、鸟类、爬行动物和昆虫等各种生物。
腺病毒体的结构和功能研究一直是生物学研究的热点之一，因为深入了解腺病毒的结构和功能，可以为病毒学、基因工程和疾病治疗等领域的研究提供基础和前提。
一、腺病毒体结构的主要组成部分1. 外壳层腺病毒体的外壳层主要由两种蛋白质组成：纤维蛋白和六角蛋白。
纤维蛋白是一种长而纤细的蛋白物，具有良好的粘附能力，因此可以有效地与宿主细胞结合。
六角蛋白则是形成整个外壳层的基础构件，它们排列成六边形网络，使其具有较高的结构稳定性。
2. 蛋白质盖层和核酸外壳蛋白质盖层和核酸外壳位于外壳层的内部，是构成腺病毒体的另两个重要组成部分。
蛋白质盖层是由三种不同的蛋白质分别组成，其含量分别为30%、7%和2%。
这些蛋白质主要负责调节腺病毒的复制和感染能力。
核酸外壳则是由蛋白质盖层包围的一个空间，其中嵌入了腺病毒的基因组。
二、腺病毒体的功能及研究意义1. 作为病毒的载体腺病毒体是一种病毒载体，可以在转导的过程中将外源基因导入到宿主细胞中，从而达到进行基因治疗的目的。
因为腺病毒具有易于操控、稳定性高、容纳大量基因等优点，所以在医学研究领域中被广泛应用。
2. 感染宿主细胞腺病毒可以通过接触宿主细胞表面的受体，从而逐步感染宿主细胞。
为了实现优良的感染效果，腺病毒会根据细胞表面的特定受体选择适当的结构。
3. 克隆表达载体腺病毒在研究领域中广泛应用。
一方面用于研究蛋白质的表达、分泌与功能；另一方面，腺病毒也常用于拷贝特定目标序列（如DNA或RNA），并将这些序列导入到人工选定的宿主细胞中进行表达。
因此，腺病毒被称为是分子生物学研究和基因工程研究中一种最为常见的表达载体。
总之，腺病毒体的结构和功能的研究，是理解这种病毒如何感染和繁殖的重要途径，也是人类探索病毒与宿主相互作用的重要契机。
在未来的研究中，我们有理由相信，随着新一代高分辨率成像技术和生物化学工具的引入，对于腺病毒体结构和功能研究的深化，必将为基因治疗、疾病预防和治疗开辟更为广阔的道路。
TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建-最新文档
TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建能够特异识别抗原肽-MHC复合物的T 细胞受体(T cell antigen receptor ,TCR)，在肿瘤抗原的识别及杀伤过程中具有重要作用[1,2]，将肿瘤抗原特异性识别的TCR基因转染T细胞用于杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的方法之一[3]。
在以往实验中发现转染TCRVβ7.1基因的T细胞对肝癌细胞株BEL-7402[4]杀伤活性明显提高，由于脂质体的转染率较低和毒性较大，现构建重组腺病毒载体Ad.TCRVβ7.1，以提高转染率和降低毒性。
1材料与方法1.1质粒、菌株和细胞AdMaxTM 腺病毒包装系统(腺病毒骨架质粒、腺病毒穿梭质粒pDC315、HEK293细胞)购自加拿大Microbix公司；PBMC从人血分离；质粒pcDNA3.1- TCRVβ7.1、Hela（宫颈癌细胞）及大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。
1.2试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、反转录试剂盒及DNA Mark购自Takara公司。
Lipofectamine2000和Trizol购自Invetrogen公司。
质粒提取及胶回收试剂盒均购自Omega公司。
淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技XX公司。
1.3穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1的构建穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1构建过程如（图1）。
设计一对带有EcoRⅠ和XhoⅠ的TCRVβ7.1引物，PCR产物双酶切后连接到穿梭质粒pDC315中，得到腺病毒穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1。
图1 穿梭质粒pDC315Vβ7.1的构建1.4重组腺病毒Ad.TCRVβ7.1的包装接种4×105个低代的HEK293细胞于六孔板中，约24h后细胞密度达到60%～80%时，用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒和骨架质粒共转染293细胞。
待细胞长满培养板时，将其消化转移至10cm细胞培养皿中继续培养。
腺病毒载体的构建与基因治疗的研究
腺病毒载体的构建与基因治疗的研究在现代医学中，基因治疗作为一种新型的治疗手段，已经逐渐受到人们的关注。
而腺病毒载体的构建是基因治疗研究中不可避免的部分。
本文将围绕腺病毒载体的构建和基因治疗的研究展开论述。
一、腺病毒及其载体的特点腺病毒(Adenovirus)是一类非常常见的病毒，其特点是具有两种形态：圆形和20面体。
腺病毒可以感染人类、猴子、猪、牛和小鼠等动物，可能引起感染后的发热、呼吸困难等症状。
然而，腺病毒毒株相对较多，结构和生命周期也非常适合于基因搭载和转导。
因此，腺病毒载体成为一种被广泛使用的基因治疗载体。
腺病毒载体的特点是将外源基因插入到其某些基因区域内，通过腺病毒本身的生命周期，将基因表达的信使RNA传递到细胞内，实现基因治疗。
二、腺病毒载体的构建针对腺病毒载体的构建，一般可分为以下几个关键步骤：1.选择腺病毒毒株目前，已经有大量的腺病毒毒株被发现和鉴定。
选择恰当的腺病毒毒株，可以针对不同治疗疾病的目的，选择合适的载体来完成基因治疗。
2.构建质粒在选择了合适的腺病毒毒株后，需要构建质粒，以便将外源基因并入腺病毒的基因组。
质粒中除了外源基因外，还包括其他辅助基因，比如腺病毒毒衣壳外衣和细胞克隆等。
而且，对于外源基因的选择，需要考虑到其表达效率和拓扑结构等方面。
3.转染细胞和腺病毒表达质粒构建完成后，通过转染细胞并带入质粒中的外源基因，使细胞“表达”出腺病毒。
随着腺病毒的制备，将腺病毒载体大量表达出来。
三、基因治疗的研究基因治疗是一种针对遗传病和非遗传病的新型治疗方法，它通过人工调控异常基因的表达，达到基因治疗的效果。
具体来说，是针对某些致病基因的缺失或突变，通过腺病毒载体的插入溶液，传递外源基因到受体细胞中，使外源基因代替致病基因，达到基因治疗的效果。
研究表明，基因治疗可以在癌症、神经系统疾病、血液系统疾病、因人类免疫缺陷病毒感染引起的疾病、代谢性疾病等方面发挥重要作用。
四、展望尽管基因治疗在现在处于起步阶段，但在未来，随着载体、技术的不断改进和完善，它在医学领域的应用将会越来越广泛，并会为治疗一些顽疾带来新的突破。
MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及表达的开题报告
CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及表达的开
题报告
一、研究背景和意义：
癌症是世界公认的重大疾病之一，在其中恶性黑色素瘤的死亡率也非常高。
通过疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症的方法已经成为重要的研究方向，包括恶性黑色素瘤。
而MAGE-A3和CRT是在恶性黑色素瘤中表达的抗原，且它们的表达在癌细胞和正常细胞中有明显的差异。
因而它们被认为是恶性黑色素瘤的潜在免疫治疗靶点。
二、研究内容和方案
本研究通过将MAGE-A3和CRT基因插入到腺病毒载体中，构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体，并在细胞水平表达融合蛋白。
具体步骤如下：
1. 通过RT-PCR方法从恶性黑色素瘤组织中提取MAGE-A3和CRT 基因。
2. 将MAGE-A3和CRT基因克隆到腺病毒载体中，形成CRT/MAGE-A3重组载体。
3. 利用PCR进行扩增，通过酶切和测序进行CRT/MAGE-A3重组载体的鉴定。
4. 将CRT/MAGE-A3重组载体转染到恶性黑色素瘤细胞株中，通过Western Blotting方法检测融合蛋白CRT/MAGE-A3的表达和纯度。
三、研究预期结果
1. 成功构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体。
2. 观察到CRT/MAGE-A3的表达并在细胞中得到验证。
3. 为下一步开展体内实验打下坚实基础，为疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症奠定理论基础。
四、研究意义
本研究有望为恶性黑色素瘤的免疫治疗提供新的方法和思路，也有望开展潜在的抗癌疫苗研究。
同时还有望在癌症免疫治疗的新技术方面提供一定的探索，为癌症的预防和治疗提供新的思路和方法。
〖医学〗重组腺病毒载体的构建
BTEB2简介
基本转录元件结合蛋白2－转录因子 功能：促进VSMC增殖和表型转化
外源性基因的制备
VSMC中提取总RNA RT－PCR得到BTEB2 cDNA 体会：从目的基因丰度高的组织或细胞
中提取。
重组穿梭质粒的构建－－将 PCR产物克隆到穿梭质粒
用BamH I 和 EcoR I 双酶切穿梭质粒 pDC315及BTEB2 cDNA
用T4连接酶将BTEB2 cDNA反向连接到 穿梭质粒 定向克隆
体会：设计引物时引入需要的酶切位点 可使基因定向克隆的程序简化
重组穿梭质粒的鉴定
酶切鉴定：用BamH I 和 EcoR I 双酶切 重组穿梭质粒pDC315ASBTET2，电泳
目的片段测序
重组腺病毒的制备
脂质体介导重组穿梭质粒和腺病毒基因组质粒 共转染293细胞
腺病毒载体的包装细胞
HEK293细胞的培养 高糖型DMEM 10%FBS（构建），10%NBS（扩增）
HEK293细胞的传代次数与腺病毒载体构 建和扩增 构建：＜20代－－构建成功的关键 扩增：无特殊要求
重组原理
重组腺病毒载体构建
以反义BTEB2腺病毒表达载体为例 介绍重组腺病毒载体的构建过程
重组腺病毒的鉴定
病变293细胞于液氮、37°C反复冻融， 离心
取上清提取重组病毒DNA 用目的片段引物和病毒基因组特征片段
引物作PCR
病毒滴度测定
24孔培养板每孔接种1×105个293细胞 培养24小时后，取病毒转染液0.2ml加
PBS至总量2ml，混匀后作10倍比稀释至 第8管，每孔加入不同稀释度的病毒液 0.2ml。 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加 1.5ml培养液，继续培养36－48小时
腺病毒载体工艺平台介绍
腺病毒载体工艺平台介绍腺病毒载体是一种常用的基因传递工具，被广泛应用于基因治疗和基因工程研究领域。
为了应对不同研究需求和提高载体表达效率，许多研究人员和企业建立了腺病毒载体工艺平台，以帮助加速基因传递和基因治疗的研究进展。
腺病毒载体工艺平台是一种综合的研究和生产系统，主要包括以下几个方面：1. 载体构建：利用分子生物学技术，将感兴趣的基因序列插入腺病毒基因组的合适位点。
在载体构建过程中，可以根据需要选择不同的载体类型、启动子、响应元件等，以调控基因的表达水平和时机。
2. 载体包装：通过与辅助质粒（helper plasmid）共转染细胞，使细胞内形成完整的腺病毒基因组，并通过细胞内重组事件来复制和包装腺病毒颗粒。
载体包装的过程中，通常需要参考文献中的方法和优化步骤，以获得高效的包装效率。
3. 病毒扩增：将包装好的腺病毒载体接种到适宜的宿主细胞中，通过培养和扩增过程，使腺病毒繁殖并增加至足够的浓度。
扩增过程中要注意控制细胞的生长状态、感染剂量和细胞培养条件，以获得高产量和活性的腺病毒。
4. 病毒纯化：通过离心、超滤和柱层析等技术手段，从扩增培养物中纯化腺病毒颗粒。
纯化过程中，可以采用单步或多步骤的方法来去除杂质、浓缩和提纯腺病毒。
5. 固定化：对腺病毒进行固定化处理，可用于获得更稳定、可储存和长期使用的腺病毒制剂。
常用的固定化方法包括酶解固定化、化学固定化、冻干固定化等。
6. 质量检测：对纯化的腺病毒产品进行质量鉴定，包括病毒滴度测定、细胞感染测定、基因表达水平测定等。
同时，还可以进行病毒颗粒观察、基因序列测定、重组蛋白表达等验证实验。
腺病毒载体工艺平台的建立有助于提高基因治疗和基因工程研究的效率和可靠性。
通过系统、规范和高效的工艺流程，可以大幅度减少研究人员在载体构建、病毒包装和纯化等环节上的工作量，同时提高腺病毒的产量和纯度。
这为基因治疗的临床应用以及基因工程研究提供了可靠的技术支持。
腺病毒载体工艺平台是基因治疗和基因工程研究中不可或缺的一部分。
人HCN4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定
人HCN4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定作者：蔡军，林国生，江洪，王腾，曾彬，罗浩，郭军，李俊，汪蕾【关键词】腺病毒科Construction and identification of human HCN4 gene recombinant adenovirus【Abstract】AIM: To construct the recombinant adenovirus of human HCN4 gene. METHODS: HCN4 gene fragment was cloned into the shuttle plasmid pAdTrackCMV to form the transfer vector by the methods of homogeneous recombination in bacteria and the recombinant adenovirus was then transfected into 293 cells using Lipofectamine 2000. The target gene was detected by polymerase chain reaction (PCR) and the titer and its infection rate were determined using the green fluorescent protein (GFP) expression in the shuttle plasmid. RESULTS: Restriction enzyme digestion analysis and the sequence analysis confirmed that the HCN4 gene was successfully inserted into the adenovirus vector. The titer of the recombinant adenovirus was ×1015 pfu/L. GFP was observed in thetransfected 293 cells under a fluorescent microscope. CONCLUSION: The recombinant adenovirus containing human HCN4 gene is successfully constructed by the method of homogeneous recombination in bacteria.【Keywords】 HCN gene; adenoviridae; recombination, genetic【摘要】目的：构建超极化激活环核苷酸门控通道基因（HCN4）重组腺病毒载体. 方法：采用基因工程技术，将HCN4 cDNA 定向克隆至穿梭载体pAdTrackCMV中，利用pAdeasy1系统进行细菌内同源重组后，脂质体转染293T细胞包装、扩增，CsC1密度梯度超速离心纯化. 采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定，利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因，对病毒滴度和感染效率进行监测. 结果：测序结果证明成功构建了HCN4基因重组腺病毒载体，病毒滴度达×1015pfu/L. 结论：应用细菌内同源重组法成功构建了含人HCN4基因的重组腺病毒载体.【关键词】 HCN基因；腺病毒科；重组，遗传0引言起搏电流（If）在窦房结生理性起搏机制中担当重要角色，同时也是自主神经调节心脏节律的主要靶点，其编码基因为超极化激活环核苷酸门控通道基因（HCN）［1-4］. HCN超家族包括HCN1～HCN4型，其中HCN4占窦房结HCN总mRNA的80%［5］. 最近研究发现，在家族性或遗传性窦房结功能障碍家系中存在HCN4 D553N或1613delC位点突变［6,7］. 为了进一步深入研究HCN4的通道动力学及其在起搏活动中的功能角色，积极开展窦房结功能障碍的基因治疗，我们构建了表达HCN4的重组腺病毒载体.1材料和方法1．1材料腺病毒细菌内同源重组系统包括Bj5183、穿梭质粒pAdTrackCMV及腺病毒骨架质粒pAdeasy1（美国Johns Hopkins大学Dr. He TC惠赠）；293细胞系（武汉大学细胞典藏中心）；各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、RNase A（TaKaRa公司）；转染试剂Lipofectamine 2000（Gibco BRL）；PCR产物回收纯化试剂盒（Promega公司）；质粒提取试剂盒（Hispeed Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司）；氯化铯（Sigma公司）. 其余各种试剂均为进口或国产分析纯试剂.1．2方法1．2．1穿梭载体pAdTrackCMV HCN4的构建和鉴定1．2．1．1pAdTrackCMVHCN4的构建质粒用HindⅢ和XbaⅠ双酶切后回收 kb的HCN片段. 穿梭质粒pTrackCMV用HindⅢ和Xba Ⅰ双酶切后回收载体骨架，T4 DNA连接酶连接载体骨架与目的基因片段得到重组质粒pTrackCMVHCN4. 转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，质粒提取试剂盒提取质粒.1．2．1．2pAdTrackCMVHCN4的酶切鉴定取 mL离心管，依次加入酶切缓冲液2 μL，内切酶HindⅢμL，内切酶XbaⅠμL, 重组质粒μL，去离子水μL，充分混匀，37℃水浴2 h，酶切后10 g/L琼脂糖凝胶电泳，分析电泳条带.1．2．2细菌内同源重组产生腺病毒质粒用100 mL/L的冰冷的无菌甘油制备 BJ 5183及 DH5α电穿孔感受态菌，将穿梭质粒pAdTrackCMVHCN4用PmeⅠ线性化，纯化回收酶切产物. 分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy1等浓度比混合，在2500 V, 200 Ω, 25 μF 条件下，电转化BJ5183感受态菌，卡那霉素（50 mg/L）固体LB培养基筛选，16 h后挑取10个克隆，提取质粒. PacⅠ酶切鉴定阳性克隆得到重组腺病毒质粒pAdHCN4. 重组腺病毒质粒pAdHCN4的序列测定：以质粒提取试剂盒提取的高纯度质粒为模板，双脱氧核苷酸终止法测序，以SP6Promter Primer为测序引物，采用ABI PRISM B DyeTM测序试剂盒在ABI PRISMTM377XL DNA sequncer序列分析仪上对插入片段进行序列测定.1．2．3293细胞中包装产生重组腺病毒利用HEK293细胞可稳定表达复制缺陷病毒Ad5 E1基因的特性，将重组病毒质粒包装成有完整功能的重组病毒颗粒. 转染前24 h于每个T25 cm2培养瓶中接种1×106细胞，转染时细胞密度为50%～70%. 转染当日，将4 μg pAdHCN4质粒用PacⅠ酶切线性化，用20 μL Lipofectamine 2000按说明转染293细胞，2 d后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，2 wk后收集细胞. -70℃/37℃/Vortex反复冻融4次，取1/5病毒提取上清再感染293细胞扩增，3~4 d后收集细胞，PBS重悬，反复冻融，离心收集病毒上清，保存于-80℃.1．2．4重组腺病毒大规模扩增及CsC1密度梯度超速离心纯化按照上述方法连续扩增病毒5~6轮，最后共感染了大约3×108个293细胞，3~4 d后收集病毒上清，制备CsC1低密度母液（1200 g/L）和高密度母液（1460 g/L）. 将高、低密度母液以及病毒上清加至超速离心管中，以10 000 g于4℃离心3~4 h，侧向穿刺小心吸出病毒条带，加入透析袋中透析12 h，其间更换透析缓冲液（10 mmol/L TrisHC1 pH , 1 mmol/L MgC12, 10 mL/L甘油）3次，透析完全后，用2×病毒储存液（19 mmol/L TrisHC1 pH , 100 mmol/L NaC1, 1 mL/L BSA, 50 mL/L甘油）按1∶1稀释病毒，μm滤膜过滤，分装后放-80℃保存，得到纯化好的病毒AdHCN4.1．2．5病毒滴度测定先用A值初步估算：取15 μL纯化好的病毒用 mL H2O稀释15 μL高密度CsC1母液作为空白对照，测A260 nm值，按1012/VP/A260 nm进行换算. 再以GFP法进行测定：将病毒储存液作不同比例的稀释，取500 μL稀释液加至T25 cm2培养瓶培养的293细胞中，于37℃吸附30 min换新鲜培养基继续培养36 h，在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数，按病毒滴度（pfu/mL）=GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数/ mL计算.1．2．6重组腺病毒的鉴定目的基因的PCR鉴定，根据HCN4 cDNA的碱基序列，设计了HCN4的寡聚核苷酸引物：正向引物： 5′GGCATGTCCGACGTCTGGCTCA3′；反向引物：5′TCACGAAGTTGGGGTCCGCATT GG3′. 提取病毒基因组DNA： 2 mL PBS 收集2种病毒感染后发生病变的293细胞，冻融4次，于4℃ 600 g 离心10 min取上清，加入200 μL蛋白酶K （5 g/L），并加入2 mL SET裂解液（10 mL/L SDS, 10 mmol/L EDTA, 20 mmol/L Tris HCl pH ），56℃消化2 h, 3000 g离心10 min取上清，等体积的酚/氯仿抽提一次，无水乙醇沉淀，20 μL TE溶解，以上述病毒基因组DNA为模板，进行PCR: 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸90 s，共35个循环，最后于72℃延伸10 min，产物用10 g/L琼脂糖电泳进行鉴定. 2结果2．1穿梭载体pAdTrackCMVHCN4的鉴定重组质粒被切成的片段与理论预期一致，表明HCN4 cDNA序列已成功插入pAdTrackCMV 载体中，且连接正确（Fig 1）.2．2重组腺病毒质粒pAdHCN4的序列测定用一条PCR鉴定引物进行测序，测定序列结果与GenBank报道的序列完全一致（Fig 2）.2．3重组腺病毒在293细胞中包装、扩增及纯化将腺病毒质粒pAdHCN4用PacⅠ酶切线性化后转染293细胞，2~3 d后荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白的表达，说明有感染力的病毒颗粒包装成功（Fig 3）. 将大规模扩增所得到的病毒液经过CsC1密度梯度超速离心的方法进行纯化，并经过透析得到可以直接用于在体实验的重组腺病毒AdHCN4.2．4病毒滴度的测定应用A值和GFP法测得AdHCN4最终的滴度为×1015pfu/L.2．5重组腺病毒AdHCN4中HCN4基因的PCR鉴定提取AdHCN4病毒基因组DNA，以HCN4基因的引物进行PCR鉴定，结果AdHCN4可见353 bp的阳性扩增条带，而AdGFP没有条带（Fig 4）.3讨论心律失常是影响人们健康威胁人们生命的疾病. 心律失常遗传基因的发现以及突变监测的进展促进了心律失常基因治疗的研究. 最近的研究结果都提示HCN4基因是具有很大潜力的基因治疗的靶基因：①在遗传性窦房结功能障碍患者存在HCN4 D553N或1613delC位点突变［6,7］；②在HCN4基因敲除的鼠胚胎心脏记录不到具有4期自动除极特征的起搏细胞动作电位，胚胎不能发育成熟［8］；③胚胎心室肌细胞在早期阶段（）具有自发除极能力，晚期（）则丧失起搏能力，其机制在于HCN4表达持续性下调及If进行性减少［9］. 因此，HCN4转染的心肌细胞将过度表达If从而具备4期自动除极能力，这将可能构建建立在基因工程基础上的生物起搏器. 我们成功的构建了重组腺病毒载体AdHCN4，可以通过腺病毒载体将HCN4导入体外培养的细胞深入研究HCN4通道动力学及其在起搏活动中的功能角色，也可以心肌内注射开展窦房结功能障碍的基因治疗，为今后的临床应用奠定坚实的基础.由于腺病毒载体的病毒滴度高、容量大、转导效率高、感染范围广以及稳定性好，因此被广泛应用于各种基因治疗中. He等［10］首次介绍细菌内同源重组法，此方法简便快捷，实验周期短，极大地方便了构建重组腺病毒. 目前美国Johns Hopkins Oncology Center 制备了含腺病毒核心基因组pAdEasy1的BJ5183细菌，即AdEasy1（亦称作BJAEasy或AdEasier细菌），与pAdTrack或pAdTrackCMV等穿梭质粒共同组成一个高效重组腺病毒构建系统，只需将含目的基因的穿梭质粒线性化后转化AdEasy1获得重组腺病毒质粒，再经293细胞包装、扩增便可获得所需重组腺病毒，因此选用该系统进行目的基因的修饰在时效上有很大优势.我们希望能够以腺病毒载体为介导，进一步研究HCN4基因在生理性起搏中的功能角色及其分子机制，探索HCN4基因作为基因治疗靶基因的价值，为窦房结功能障碍和重度房室传导阻滞的基因治疗提供候选基因，并为临床前研究提供实验依据. 我们在前一阶段的研究中曾通过窦房结细胞移植来修复或重建心脏优势起搏点以完全或部分代替窦房结功能［11，12］. 但由于人的胚胎心肌细胞移植受到伦理学争议，限制了其在临床上的应用. 由于建立在基因工程基础上的“生物起搏器”可以进行大规模生产，有望成为比电子起搏器更便宜、更安全、更灵敏、创伤更小、更适宜于儿童治疗的新选择，具有广阔的临床应用前景和巨大的社会经济效益.【参考文献】［1］ DiFrancesco D, Ferroni A, Mazzanti M, et al. Properties of the hyperpolarizingactivated current in cells isolated from the rabbit sinoatrial node ［J］. J Physiol, 1986;377(5):61-67.［2］ Moonsmang S, Stieber J, Zong X, et al. Cellular expression and function characterization of four hyperpolarizationactivated pacemaker channels in cardiac and neuronal tissues ［J］. 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Ad-IRE1α腺病毒载体的构建及对软骨细胞分化与凋亡的效应研究的开题报告
Ad-IRE1α腺病毒载体的构建及对软骨细胞分化与凋亡的效应研究的开题报告题目：Ad-IRE1α腺病毒载体的构建及对软骨细胞分化与凋亡的效应研究研究背景及意义：软骨组织是一种特殊的结缔组织，具有一定的韧性和弹性，在机体内具有很重要的功能，如支持身体结构、吸收冲击力、减轻摩擦等。
但软骨缺乏血管和神经的供应，且细胞数量较少，修复能力较差，因此软骨损伤的治疗一直是一个难题。
最近的研究表明，内质网应激（ER stress）与软骨细胞的分化和凋亡密切相关。
IRE1α作为内质网应激信号通路中最重要的分子之一，在细胞凋亡和分化过程中具有重要作用。
因此，研究IRE1α信号通路在软骨细胞分化和凋亡中的作用，对于开发软骨组织再生治疗策略具有重要的理论和实际意义。
本研究拟通过构建Ad-IRE1α腺病毒载体，实现IRE1α的特异性表达，进一步研究IRE1α在软骨细胞分化和凋亡中的作用，以期为软骨组织再生治疗策略的开发提供新的思路和实验依据。
研究内容及方法：1.构建Ad-IRE1α腺病毒载体。
采用腺病毒载体设计软件，设计IRE1α基因的重组腺病毒载体，采用常规的腺病毒包装技术，构建Ad-IRE1α腺病毒载体。
2.体外软骨细胞培养。
从小鼠软骨中分离并培养软骨细胞。
用不同浓度的Ad-IRE1α腺病毒感染软骨细胞，分别培养24h、48h和72h，采用Western blotting检测IRE1α的表达情况，并进一步观察IRE1α表达对软骨细胞的形态学改变和细胞增殖的影响。
3.研究IRE1α在软骨细胞分化和凋亡中的作用机制。
对不同浓度的Ad-IRE1α腺病毒感染的软骨细胞进行Alcian blue染色和碱性磷酸酶染色，检测软骨细胞分化的能力，同时采用TUNEL检测IRE1α表达对软骨细胞凋亡的影响。
预期效果：本研究将构建IRE1α基因的重组腺病毒载体，实现IRE1α的特异性表达，进一步研究IRE1α在软骨细胞分化和凋亡中的作用。
CRTl80基因重组腺病毒载体的构建与鉴定
ｅｐｅｓ ｎｖ ｃ ｒ（ＡｄＣ ／ 一 Ｓ ）ａｄｔ ｅ ｅ ｔ ｒ ・ Ｒ １０ｏ ｐｅｓ ｎｖ ｃ ｒｐａｍｉ． ｆ ｒ ｘｒｓｉ ｅｔ ｐ －ＭＶ Ｖ５ＤＥ Ｔ ｎ ｇｎｒ ｅ ＡｄＣ Ｔ ８ ｆ ｘ ｒｓｉ ｅｔ ｌｓ ｄ Ａ ｅ ｏ ｏ ｏ ａ ｅ ｏ ｏ ｔ
中 图分 类 号 ：Ｒ ３３ ７ ．４ 文 献 标 识 码 ：Ａ
Ｃｏ ｓ ｒ ｔｏ ｏ ｎ ｔ ｕｃ ｉ ｎ ｆ ＣＲＴ１ ０ ｇ ｎｅ ｒ ｃ ｍ ｂｉ ｎ ｄｅ ｖｉｕｓｖｅ ｏ ｎ ｉｓ ｅ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｉ ｉｒ ８ ｅ ｅｏ ｎａ ｔ ａ ｎｏ ｒ ｔ ｒ ａ ｄ ｔ ｘ ｅ ｓｏ ｎ ｖ ｔｏ
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马春 玲 ，孙 运 芳 ，姚 伟 ， 马永 臻 ，于 立玲
摘要 ：目的 构建表达 Ｃ Ｔ１０基 因重组的腺病毒载体 ，为肿瘤 的基 因治疗奠定实验基础。方法 Ｒ ８
采用
腺 病毒表达系 统 （ ｉ Ｐ ｗｅ Ｍ Ａｄｎ ｖｒｌＥ ｐｅｓ ｎ Ｓ ｓ ｍ）构建 重组腺病 毒表达载体 。首先利用 Ｖ ｒ ｏ ｒ ｅｏ ｉ ｘ ｒｓｉ ｙｔ ａ ａ ｏ ｅ Ｒ －Ｃ 的方法在人肺腺癌细胞系 Ａ ４ ＴＰ Ｒ ５ ９细胞 中扩增 Ｃ Ｔ１０基 因，以连接、转化等方 法克 隆入载体 Ｒ ８ ｐ ＮＴ ／ Ｔ Ｐ 以获得重组的入 门克隆， Ｅ ＲＤ．Ｏ Ｏ 经测序及 Ｐ Ｒ鉴定正确后 ， Ｃ 用重组酶（ ＲＣｏ ａｅ Ｉ Ｅ ｚ ｍｅ Ｌ ｌｎｓ… Ｉ ｎｙ Ｍｉ ｘ）进行 入 门克 隆 与腺 病 毒表 达 载 体 （ Ａ ．ＭＶ／ 一 Ｓ ｐ ｄＣ Ｖ５ＤＥ Ｔ）问 的重 组 反 应 ， 以获 得 表 达 克 隆 （ＡｄＣ Ｔ ８ ）质 粒。重组表达克隆鉴定后，用 限制性 内切 酶 Ｐ ｃ 是使之线性化后转染 Ｈ Ｋ２ ３ ｒ ． Ｒ １０ ａＩ Ｅ ９Ａ包 装细胞得到重组腺病毒。用极 限稀释法检 测病毒 滴度用 Ｗｅｔｒ Ｂｌ 法检测 ｒ ． Ｒ ８ ｓｎ ｏ ｅ ｔ ＡｄＣ Ｔ１０载体 是否能正
腺病毒载体的构建
腺病毒载体的构建第四章SOCS2腺病毒载体的构建 1腺病毒载体的构建由第三章结果可知，基础状态下SOCS2在脂肪细胞中的表达⽔平较低，但是GH 可以诱导SOCS2稳定⾼表达。
SOCS2⾼表达的同时，GH诱导的脂肪细胞分化因⼦和脂质代谢基因表达发⽣了变化。
为了研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响，需要通过⼀种途径实现SOCS2在脂肪细胞中持续⾼表达。
细胞导⼊外源基因是⽬前常⽤的⽅法，但是保证外源基因的⾼效表达需要合适的表达系统。
⽬前常⽤的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。
质粒载体可以导⼊外源基因，但是质粒的转染效率很低，如何把⽬标基因导⼊靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。
逆转录病毒可以把⽬标基因整合到靶细胞基因组永久表达，但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。
蔓病毒本⾝对脂肪细胞的感染率⼜⽐较低。
⽽腺病毒滴度⾼，适合外源基因⼤量表达，并且可插⼊较⼤的⽬的⽚段，对细胞类型限制较⼩，可感染⾮分裂期的细胞(V orburger SA and Hunt KK 2002)。
另外腺病毒载体系统中pAdEasy系统操作⽐较简单(Luo JY et al. 2007)。
本章克隆SOCS2基因，采⽤pAdEasy系统构建pAd-SOCS2载体，为SOCS2在脂肪细胞中⾼效表达，研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。
4.1材料4.1.1 样品、菌株、质粒及细胞株脂肪组织取⾃6周龄昆⽩⼩⿏，⼩⿏购⾃第四军医⼤；E.coli DH5α菌株由本实验室保存；pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒，E.coli BJ5183菌株由猪脂肪沉积与肌⾁发育实验室赠送；⼈胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中⼼。
4.1.2 主要试剂限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋⽩Marker购⾃Fermentas公司；内切酶PmeI和PacI购⾃NEB公司；pMD TM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购⾃Takara公司；穿梭质粒⼩提试剂盒购⾃Omega公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购⾃Bioflux公司；λ/Hin dIII Marker购⾃天根公司；OptiMem优化培养液购⾃Gibico公司；脂质体Lipofectamine TM 2000购⾃Invitrogen公司。
医学：重组腺病毒载体的构建
02
重组腺病毒载体的构建涉及多个步骤，包括选择合适的腺 病毒血清型、设计外源基因的插入位点、构建重组质粒、 转染腺病毒生产细胞等。这些步骤需要精确的操作和严格 的质量控制，以确保重组腺病毒载体的安全性和有效性。
03
重组腺病毒载体的构建过程中，需要注意选择适当的腺病 毒血清型，以确保与宿主细胞的良好亲和力和低免疫原性 。同时，需要对外源基因进行适当的修饰和优化，以提高 其在重组腺病毒载体中的表达效率和稳定性。
医学重组腺病毒载体的构建
目录
• 重组腺病毒载体概述 • 重组腺病毒载体的构建过程 • 重组腺病毒载体的应用研究 • 重组腺病毒载体的安全性及挑战 • 参考文献
01 重组腺病毒载体概述
腺病毒的特点
01
02
03
宿主范围广
腺病毒对多种细胞类型具 有感染能力，包括人体细 胞。
基因容量大
腺病毒载体可以携带较大 的基因片段，适合用于基 因治疗和疫苗研发。
02 重组腺病毒载体的构建过 程
目的基因的获取与。
目的基因的处理
对目的基因进行限制性酶切、修饰、 纯化等处理，以便于后续的克隆和鉴 定。
载体的选择与处理
载体的选择
根据实验需求选择适合的载体，如腺病毒载体、质粒载体等。
载体的处理
重组腺病毒载体的构建过程简介
选择合适的腺病毒血清型
根据应用需求选择对特定细胞类型感染力强、 免疫原性弱的腺病毒血清型。
构建重组质粒
将目的基因插入腺病毒载体的转移质粒中， 形成重组质粒。
转染与筛选
将重组质粒转染进包装细胞，筛选出能够产 生重组腺病毒的细胞克隆。
病毒扩增与纯化
在筛选出的细胞克隆中扩增重组腺病毒，并 进行纯化和浓缩。
腺病毒构建
腺病毒的一般特性腺病毒的形态是特征性的二十面体病毒壳体（Stewart et al., 1993）。
其病毒壳体含有三种主要的蛋白：六邻体（II），五邻体基底（III）和纤突（IV），还有多种其他的辅助蛋白VI，VIII，IX，IIIa和Iva2（Fig. 1）。
腺病毒基因组是一个线性的双链DNA，其5’端与一种末端蛋白（TP）共价结合（Rekosh et al., 1977），5’端上还具有末端反向重复序列（ITRs）。
病毒DNA与核心蛋白VII和一个称为mu的小肽紧密结合（Anderson et al., 1989）。
另一种蛋白V包被在DNA-蛋白复合物上，并且通过蛋白VI为DNA-蛋白复合物和病毒壳体间提供了结构上的联系（Matthews & Russell, 1995）。
病毒含有一种病毒自身编码的蛋白酶（Weber, 1976; Webster et al., 1989），这种蛋白酶对于加工某些结构蛋白从而产生成熟的具有感染性的病毒是必需的。
腺病毒家族（Adenoviridae）的成员可感染种类相当广泛的有丝分裂后细胞，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，脑细胞和心脏细胞。
因为腺病毒可将自身的基因组递送到细胞核中，并且高效率地复制，所以腺病毒成为表达和传递治疗基因的主要候选者。
腺病毒的宿主范围很宽，目前可将之分为三个属，进一步可分为6个种（或称为亚属或亚群），编号从A到F。
主要基于免疫学标准的人血清型的划分，已经由于历史原因而成为腺病毒分类的基础（Benkö et al., 1999; Lukashok & Horwitz, 1998; Mautner, 1989）。
有些腺病毒在动物体内可致瘤，在体外能转化细胞，此处未列出相关文献。
腺病毒载体的应用腺病毒载体可高效地传递和表达基因的能力（尤其是在体外），在过去的15年里已经得到充分地证实和记载。
鸡survivin重组腺病毒载体的构建和体外表达
鸡survivin重组腺病毒载体的构建和体外表达
鸡survivin重组腺病毒载体的构建和体外表达
根据GenBank中鸡survivin cDNA序列,设计引物,从鸡胚组织提取总RNA,利用RT-PCR扩增鸡survivin全长cDNA,经T-A克隆后插入腺病毒穿梭载体、骨架载体,构建腺病毒重组质粒,转染293E4pIX细胞,构建鸡survivin重组腺病毒.T-A克隆的测序结果与GenBank中鸡survivin cDNA完全一致.限制性内切酶分析和PCR表明腺病毒质粒携带survivin基因,Western blot证实重组腺病毒正确表达survivin,survivin基因已被成功重组到腺病毒基因组.
作者：李秋田聆文艳君吴扬罗彦 LI Qiu TIAN Ling WEN Yan-jun WU Yang LUO Yan 作者单位：四川大学华西医院人类疾病生物治疗重点实验室·肿瘤生物治疗科,成都,610041 刊名：四川大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF SICHUAN UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2006 43(5) 分类号：Q95 关键词：survivin 异种疫苗腺病毒载体。
人乳铁蛋白腺病毒载体的构建及细胞表达
人乳铁蛋白腺病毒载体的构建及细胞表达摘要：将人乳铁蛋白基因与腺病毒基因组骨架质粒重组，在293细胞中包装重组腺病毒颗粒，获得真核细胞表达的载体pAd－hLTF。
以pcDNA3X为模板，PCR扩增hLTF基因，腺病毒穿梭载体pshuttle－cmv与hLTF重组为pshuttle－cmv－hLTF；再与腺病毒骨架质粒pAdEasy－1同源重组为pAd－hLTF质粒；脂质体法将重组pAd－hLTF质粒转染HEK 293细胞，包装成重组腺病毒颗粒。
Western blot和ELISA法测定细胞中hLTF基因的表达。
结果表明，pAd－hLTF 质粒转染293细胞后，7～10 d后，获得细胞裂解液，将细胞裂解产物再次接种新鲜的293细胞，3～5 d后，80%以上的细胞变圆、膨胀、漂浮。
Western blot 和ELISA结果显示，上清液中有hLTF基因的表达，为重组人乳铁蛋白的体外表达及其功能分析奠定了基础。
关键词：重组人乳铁蛋白；腺病毒载体；重组蛋白质Construction of Human Lactoferrin Gene Recombinant Adenoviruses and Expression in Eukaryotic CellsAbstract：To construct the recombinant adenoviral vectors containing human lactoferrin gene，the recombinant adenoviruseswas obtained and expressed the recombinant protein in eukaryotic cells．The human lactoferrin gene was amplified from plasmid pcDNA3X；the gene of interest which contained hLTF gene was cloned into the pshuttle－cmv vector．The resulted vector was named pshuttle－cmv －hltf that was linearized by digesting with restriction endonuclease PmeI，and subsequently cotransformed into Escherichia coli BJ5183 cells with an adenoviral backbone vector pAdEasy－1；Homologous recombinants were performed in bacterial cells．Finally，the linearized backbone adenoviral vector was transfected into the packaging cells lines HEK 293 cells by lipofectamine 2000 transfection reagents．The expression of human lactoferrin in cells was investigated by Western blot and ELISA methods．After the transfection，seven to ten days later，the cells lyses were collected and added into the separate 293 cells．The cells become roundness，swell and floats．Western blot and ELISA results showed the high expressed human lactoferrin in the cells．These results shown that human lactoferrin gene recombinant adenoviral backbone vector had been constructed successfully．The recombinant adenoviruses pAd－hLTF had been produced by packaging in 293 cells．This study could provide the possibility of further researches on the high－level expression of recombinant proteins．Key words：recombinant human lactoferrin；adenoviral vectors；recombinant protein人乳铁蛋白(human lactoferrin，hLTF)是主要存在于初乳中的一种结合性糖蛋白，由于乳铁蛋白具有许多独特的生物学功能，如广谱的抗菌性及免疫作用、抗氧化作用、抗炎症、抗病毒、抗癌症作用等[1]生物学功能，近年来成为国内外研究的热点。
重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定的开题报告
重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定的开题报告一、研究背景和意义腺病毒是一种广泛存在于哺乳动物中的DNA病毒，能够感染多种类型的细胞，具有高效的基因转导能力和良好的安全性。
因此，腺病毒已经成为了重要的基因转导载体，被广泛应用于基因治疗、基因工程和生物学研究等领域。
其中，重组腺病毒作为基因转导载体具有如下的优点：（1）能够稳定地表达外源基因：腺病毒具有较高的基因转导率，可以长时间稳定地表达外源基因，从而实现目标蛋白的大量表达。
（2）病毒颗粒结构复杂：腺病毒颗粒结构复杂，能够有效地包装外源基因，从而保证表达的效率和精度。
（3）有良好的生物安全性：腺病毒基因组不会整合到宿主细胞基因组中，从而减少对宿主基因组的影响，有良好的生物安全性。
本研究主要针对重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定展开，主要研究内容包括以下几个方面：1. 进一步优化pAd-CD载体的构建，提高其基因转导效率。
2. 针对pAd-CD载体的具体应用领域，开展针对性的效果评价和分析。
3. 探索pAd-CD载体在基因治疗、基因工程和生物学研究等方面的应用潜力。
本研究的开展能够拓展腺病毒在基因转导载体方面的应用范围，对基因治疗、生物学研究等领域具有一定的应用前景。
二、主要研究内容和研究方案1. 重组腺病毒载体pAd-CD的构建（1）提取并纯化腺病毒：采用经典的离心法等分离技术，从已知类型的腺病毒细胞株中提取并纯化腺病毒。
（2）选择并设计适合的pAd-CD载体：根据研究方向选择并设计适合的重组腺病毒载体。
（3）克隆外源基因：将目标基因与pAd-CD载体进行克隆，形成包含外源基因的载体。
（4）包装重组腺病毒：使用适当的技术和装置，将载体转化为重组腺病毒并包装成病毒颗粒。
2. 重组腺病毒载体pAd-CD的鉴定（1）DNA测序鉴定：使用合适的方法对构建出的pAd-CD载体进行测序鉴定。
（2）病毒包装率检测：测定包装率，评估重组腺病毒的制备质量。
（2）病毒的基因转导效率检测：采用不同的检测方法检测病毒的基因转导效率，分析重组腺病毒的基因转导效率及其影响因素。
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载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容 量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉 害，应用局限。
第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒
基因，仅保留ITR和包装信号序列。这一载体系 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础
重组系统由2种质粒 构成：一、包含全 部（或右侧大部分） 腺病毒基因组DNA 的大质粒，即骨架 质粒
二、小的穿梭质粒，其带有 目的基因的表达盒以及表达 盒两侧的与大质粒上的目的 基因拟插入部位同源序列 （左右臂）
AdEasy腺病毒载体系统
稳定 性高
安全性好 无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞 基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小。
病毒基因组组成 载体容量 基因整合功能
表达丰度 表达时间 感染细胞类型 滴度U/ml 四环素诱导系统 毒性作用
腺病毒表达系统 慢病毒表达系统
逆转录病毒
双链DNA <8kb
单链RNA <8kb
单链DNA <6kb
E2蛋白涉及AdDNA复制 E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统 E4蛋白调节有效的晚期基因转录
腺病毒分类
第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代
载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较 强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用， 体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广 泛 ，一般常用Ad5型腺病毒）
无，病毒基因组游 离于宿主基因组之 外，瞬时表达外源 基因
有，病毒基因组整 有 合到宿主基因组， 长时间、稳定表达 外源基因
高水平表达
中
中
快（1-2天）
慢（2-4天）
快（1-2天）
分裂和不分裂细胞 1012
分裂和不分裂细胞，分裂cell，但在干 适用于难转染细胞 细胞中表达效率低
109
109
不可以
TET-ON,TET-OFF
腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在 连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
宿主范 可转入分裂后的非分裂细胞中发挥作用，可以感染处
围广
于分裂状态的细胞。
感染 性
强
可经不同途径进入不同组织(可以在肠道内繁殖，也可 以 在呼吸道内繁殖。
包装容量 改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb， 大 腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。
腺病毒
• 腺病毒 Adenovirus 最初由人类腺样增殖体组织培养中分 离得到的，此病毒名称也由此而来。质粒是直径约70毫微 米的正二十面体，各顶点具有突起。结构亚基总数为252 个。核酸是双链DNA，分子量20—25×106。无包膜。在被感 染的细胞核中增殖，病毒蛋白在细胞质内合成，再输送到 细胞核。
• 腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具 有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感 冒症状、呼吸系统不适等。
腺病毒 是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它 通过 受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病 毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整 合进入宿主细胞基因组中.
腺病毒的基因及其功能
ITR Ψ E1a/E1b E2 E3 E4 ITR
腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚 期表达。
早期表达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并 且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的表达。
早期表达的E1区蛋白（甚至包括E2区蛋白）是腺病毒基因组复制、病毒 包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。
可以
基因过表达 常见应用
包装容量大，可以 满足较大基因的包 装，是过表达基因 的优选工具
1、体外基因转导 2、基因治疗
包装容量有限，过 表达的基因过大时 病毒滴度受到影响
同上
包装容量有限，过 表达的基因过大时 病毒滴度受到影响
体外基因转导，突 变筛选，功能基因 库构建
不可以
细胞毒性
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
遗传毒性
遗传毒性
免疫原性 动物模型
安全系数 能否用于miRNA RNAi
腺病毒表达系统 慢病毒表达系统 逆转录病毒
高免疫原性
低免疫原性
低
不能得到转基因动 可产生转基因动物 可以，但很难 物
高
高
中
可以
可以
不可以
病毒进入细胞往往 引起细胞内干扰素 反应，不适合做 RNAi实验
适合，是优选工具