金属硫蛋白_MT_分离纯化技术进展

金属硫蛋白(MT)分离纯化技术进展
王　翔1,张大成1,李　婷1,王　玮1,任宏伟2,韩铁钢2,俞梅敏2 (11北京大学微电子学系,北京100871;21北京大学生命科学学院,北京100871)
E2mail:wxiang@
摘要:较全面地总结了近几年来金属硫蛋白最常见的分离纯化方法,并较详细地介绍了磁法分离纯化、芯片检测等新技术。

关键词:金属硫蛋白;分离纯化;蛋白质芯片
中图分类号:R318　文献标识码:A　文章编号:167124776(2003)07/0820335203 Development of the purif ication for metallothionein(MT)
WAN G Xiang1,ZHAN G Da2cheng1,L I Ting1,WAN G Wei1,
Ren Hong2wei2,Han Tie2gang2,Yu Mei2min2
(1.Instit ute of Microelect ronics,Peki ng U niversity,Beiji ng100871,Chi na;
2.School of L if e Science,Peki ng U niversity,Beiji ng100871,Chi na)
Abstract:Several purification methods of metallothionein(M T)used at present have been listed and compared.A new method of magnetic purification and protein chip analyze has also been in2 troduced.
K ey w ords:metallothionein;purification;protein chip
1　引　言
金属硫蛋白(Metallothionein,M T)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。

人体内、动物、植物以及微生物均含M T,而且含量还随发育进程而变化,与组织或器官的功能需要相适应。

它涉及许多生理和病理学过程,对体内细胞分化、代谢癌变等许多方面有重要影响[1～6]。

M T的生物学功能主要涉及:(1)体内必需金属元素的储运、代谢和精细调节,使机体达到最佳生理状态;(2)体内重金属解毒;(3)清除体内的自由基、防止机体衰老并减轻辐射对细胞的损伤;(4)调控金属酶或转录因子的活性,增强机体对各种不良状态的适应能力;(5)参与调控细胞分化和信号传导;(6)调控细胞代谢,防止癌变。

自从M T被发现以来,它已成为分子生物进化和蛋白质结构功能等基础科学研究的热点之一,研究它在各进化水平生物中都存在的可能的原因。

并且各国科学家也在努力开发M T的新用途,大量的科学实验和临床结果表明,M T在抗电离辐射、抗紫外线照射、解除金属毒素(贵重金属回收)、治疗消化道溃疡、心肌梗塞、各种炎症、某些癌症、美容护肤、减轻吸烟及环境污染对人体的危害及抗过敏等方面均有显著疗效。

由此可见,研究金属硫蛋白的高效分离和纯化方法的的紧迫性、理论意义和良好的市场前景。

本文将就目前使用和正在研究开发的分离纯化方法进行简要综述。

2　几种分离纯化技术
目前最常用的和正在研究开发的金属硫蛋白的分离和纯化方法,主要有如下几种:
1)层析法:目前最常用的方法是凝胶过滤和离子交换技术相结合的层析法,还有吸附层析、亲和层析法。

吸附层析包括吸附柱层析、薄层层析和聚酰胺薄膜层析。

亲和层析法亦称特异性配体亲和层析
收稿日期:2003205215
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Micro nano ele ctro nic F e ch no lo gy/J uly～Augus t2003 微纳电子技术　2003年第7/8期
法。

除此之外,还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。

这两种亲和层析法相比,前者的配体一般为复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似之物等),它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。

而后者的配体则一般为简单的小分子物质(如金属、染料以及氨基酸等),它成本低廉,具有较高的吸附容量,通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。

层析在目前相当重要,也是相当常见的一种技术,其原理较为复杂,对人员技术的要求也相对较高。

2)HPLC法:微量分离也可采用HPLC法。

1983年Kagi和K lauser等人建立了反向HPLC法。

后来K laassen和Lehman又建立了阴离子交换的HPLC2AAS法,用以分离纯化了大鼠肝脏的金属硫蛋白。

3)DEAE2Sepharose Fast Flow法:该凝胶流速快、容量大,而且溶涨体积不受缓冲液离子强度变化的影响,所以每次用完后不需重新装柱。

铁氏[7]等人将二价铜离子螯合在Chelating Sepharose Fast Flow凝胶上,制成亲和层析柱,锌诱导兔肝和镉诱导小鼠肝,经匀浆、乙醇处理后上柱,用p H4.0的醋酸盐缓冲液平衡,再用p H5.2不同浓度的醋酸盐缓冲液洗脱,可得M T21和M T22两个洗脱峰,此法比传统的凝胶过滤2离子交换法简单、省时,非常适用于实验室规模分离纯化。

4)郭氏法:郭祥学等人[9]用镉诱导蓝藻,经凝胶过滤、离子交换层析和反向HPLC法纯化得到类金属硫蛋白。

此法为在植物和真菌中提取非典型M T建立了一种有效的提取方法。

Norio M等人在小鼠肝脏M T的分离纯化过程的离子交换层析后的洗脱液使用了超滤浓缩。

5)微磁分离纯化:北京大学微电子学研究院王翔和生命科学院任宏伟、俞梅敏教授等正在合作研究开发一种新型的磁法分离纯化技术,即为本课题组提出的并已展开研究的生物电磁学方法。

该金属硫蛋白微磁分离纯化及检测芯片方法,是在微电极磁场作用下,依靠磁性粒子定向迁移的原理分离纯化金属硫蛋白。

由于不同的金属离子与脱金属的M T的亲合力不同[8],可通过采用磁性金属离子在电磁场作用下迁移的方法来纯化金属硫蛋白。

3　磁法纯化技术特点
金属硫蛋白磁法分离纯化新技术是在特定的磁场作用下,依靠磁性粒子定向迁移的原理分离纯化金属硫蛋白的。

该法主要是运用金属硫蛋白在酸性
条件下,容易脱去金属而形成脱金属硫蛋白,不同的金属离子与脱金属的M T的亲合力不同以及磁性金属离子在磁场下定向迁移原理而开发地一种新型技术。

具体纯化过程是:先使金属硫蛋白溶液的p H 值降低到某一值以下,使之脱金属;进一步测试并选中最佳的p H值;之后加入特定的纳米级磁性金属颗粒,调整到合适的p H值,使磁性金属离子在最优的条件下结合金属硫蛋白;最后在优化磁场作用下,将结合了的金属硫蛋白分离出来。

纯化的M T将进行原子吸收光谱定量检测和EL ISA酶联免疫定性测定法检测。

其任务包括研究特定磁性分离纯化装置、M T分离纯化机制以及在特定磁场作用下的动力学模型。

这种分离纯化方法能进行大规模制备和纯化金属硫蛋白,具有简便、纯化效率高、成本低等诸多优点,为大规模制备和纯化金属硫蛋白打下基础。

由于金属硫蛋白涉及许多生理和病理学过程,对体内细胞分化、代谢癌变等许多方面有重要影响。

高效的纯化方法将对金属硫蛋白的作用机理和应用前景研究有重要意义。

近来,一些文献[1,2]相继报道了金属硫蛋白在电磁场作用下的一些结构检测,从这些报告中可以看出,由于金属硫蛋白中金属离子的存在,使我们联想到合适的电磁场对其金属离子的作用。

如果将金属硫蛋白中的金属离子置换成可在合适强度的电磁场作用下定向移动的磁性金属离子,那么金属硫蛋白就可以在磁场作用下,实现简单、快速高效的分离纯化方法。

要想螯合磁性金属离子的金属硫蛋白大分子在电磁场作用下定向迁移,就必须调整好磁场强度的大小极其分布,以使得金属硫蛋白的分离纯化过程得以顺利的进行。

关于金属硫蛋白的分离纯化研究和M T的特性研究,本课题组成员已经完成了一系列的研究工作[1～13]。

金属硫蛋白作为内源性活性氧清除剂,对D2半乳糖的致衰老效应有很好的对抗作用。

M T还能有效地表征水体中重金属对生物的影响,通过对不同组织M T含量的测定,研究了不同组织对重金属的积累能力,也可以对不同水体中鱼类M T的测量来确定水资源的污染源和污染程度。

采用蛋白质芯片,用酶联免疫吸附法测定鱼体内的金属硫蛋白,以确定水源的质量。

进一步研究了M T23在人体、典型动物模型中不同发育时期的分布、M T23的蛋白质结构、它的基因调控方面等的特点、它在中枢系统中的功能及其与老年痴呆症的可能关系。

初步认定M T23是一种对神经元或特异神经细胞生长具有抑制功能的蛋白,并比较了抑制活性大小。

利用蛋633
微纳电子技术　2003年第7/8期 Micro nano ele ctro nic F e ch no lo gy/J uly～Augus t2003
白质芯片进行大量的、及时的分析,可为现代神经生物学发展及研制出预防和治疗老年痴呆症的新药打下极为良好的基础。

4　结　语
近几年来,金属硫蛋白最常见的分离纯化方法在不断地发展和创新。

几种纯化方法也出现交叉应用。

新型的磁法分离纯化方法及蛋白质芯片检测等新技术也正在得到积极研究和开发。

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作者简介:
王　翔　(19652),男,博士,副教授,主要研究方向为生物电子学、微电子器件技术;
张大成　(19612),男,教授,主要从事多种传感器、MEMS工艺技术等的研究;
任宏伟　(19562),男,博士,副教授,主要从事金属硫蛋白分子生物学方面的研究;
俞梅敏　(19392),女,博士,教授,主要从事分子生物学、蛋白质方面的研究工作。

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(2)金属镍薄膜电阻是一种灵敏度较高的PCR 生物芯片温度传感器;
(3)镍铬合金薄膜电阻是一种性能稳定,效率较高的PCR生物芯片微型加热器;
(4)镍薄膜电阻温度传感器和镍铬合金薄膜电阻微型加热器能满足PCR的扩增要求。

参考文献:
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作者简介:
席文柱　(19762),男,山东省阳谷县人,大连理工大学电子系硕士生,专业方向为微传感器的设计、制造及应用。

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