酶组织化学
酶免疫组织化学技术的操作程序
酶免疫组织化学技术的操作程序一、取样和固定1. 从动物或人体组织中取得所需样本，并尽快进行处理，以避免样本的降解。
2. 将样本放入适当的缓冲液中进行固定。
常用的固定液包括4%的中性缓冲甲醛和70%的乙醇。
固定时间视样本大小和类型而定，通常为24小时。
二、包埋和切片1. 固定后，将样本从固定液中取出，进行脱水。
脱水过程中，需逐渐用浓度递增的乙醇替换固定液，使组织逐渐脱水。
2. 在脱水完成后，将样本置于透明剂（如苯胶）中浸泡，使其透明化。
3. 将透明化后的样本置于熔蜡中，使其浸透于蜡中。
4. 将浸透于蜡中的样本置于组织芯片中，使其与蜡块紧密结合。
5. 利用组织切片机将蜡块切割成薄片，厚度通常为3-5微米。
三、抗原修复和抗体染色1. 将蜡块上的切片放在载玻片上，并进行抗原修复。
抗原修复可以通过热解蜡或酶解蜡来完成。
2. 在抗原修复完成后，使用PBS（磷酸缓冲盐溶液）或TBST（三丁基甲酸盐缓冲盐溶液）进行洗涤，去除残留的蜡块和其他污染物。
3. 在洗涤完成后，将抗体溶液加到载玻片上，与待测蛋白质发生特异性反应。
抗体可以是一种单克隆抗体或多克隆抗体。
4. 将载玻片置于湿润箱中，保持恒定的温度和湿度，进行抗体与待测蛋白质的结合反应。
反应时间视抗体和待测蛋白质的特异性而定，通常为1-2小时。
四、酶标记和显色1. 在抗体与待测蛋白质的结合反应完成后，进行洗涤，去除未结合的抗体。
2. 加入酶标记的二抗或多抗，与第一次结合的抗体发生反应。
常用的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
3. 经过二次抗体的结合反应后，进行洗涤，去除未结合的二抗。
4. 加入显色底物，使酶标记物发生显色反应。
常用的显色底物有DAB（二氨基联苯胺）和BCIP/NBT（硝基蓝四唑/硝基蓝硝酮）。
五、结果分析和观察1. 经过显色反应后，用清水冲洗载玻片，停止显色反应。
2. 将载玻片进行脱水，并用透明剂进行封片。
3. 使用显微镜观察载玻片下的切片，观察待测蛋白质的表达情况和定位。
免疫组织化学
免疫组织化学(傅琦博)-免疫组织化学引言酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。
酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。
它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。
研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。
后者也被称之为免疫组织化学。
免疫组织化学概述免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。
这种技术称为免疫组织化学技术。
免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。
抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。
它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。
要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。
直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。
间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。
酶的组织化学
试剂配制： 试剂配制： ml； 1. 作用液 2%巴比妥钠 5ml；3%β-甘 ml； 10ml ml； 油磷酸钠 5 ml ； 2% 无水氯化钙 10ml ； ml； ml。 0.1% 硫酸镁 0.5 ml ； 蒸馏水 2.5 ml 。 此液pH pH为 如不到9 可用0 此液 pH 为 9.4 ， 如不到 9.4 ， 可用 0.1N NaOH调节 调节。 NaOH调节。 2. 2% 硝酸钴 现配） 3. 1-2% 硫化铵 （现配）
水解酶类
水解酶催化下列反应 ： AB+H2O AH+BOH 包括酯酶、糖苷酶、肽酶、磷酸酶Biblioteka 。 包括酯酶、糖苷酶、肽酶、磷酸酶等。
碱性磷酸酶钙碱性磷酸酶钙-钴显示法
原理：AKP在有激活剂（ 原理：AKP在有激活剂（Mg++）存在和 在有激活剂 pH9.4时 pH9.4时，将磷酸盐底物分解产生磷酸根 离子， 离子，磷酸根离子被孵育液中高浓度的 钙盐所捕获， 钙盐所捕获，在有酶活性存在处生成磷 酸钙沉淀，再加入硝酸钴， 酸钙沉淀，再加入硝酸钴，用Co2+置换 从而生成磷酸钴沉淀， Ca2+ ，从而生成磷酸钴沉淀，因其无色 需通过硫化铵处理形成黑色硫化钴颗粒 沉淀，显示酶活性所在部位， 沉淀，显示酶活性所在部位，此沉淀与 AKP含量成正比 含量成正比。 AKP含量成正比。
5. 尽量减少初级反应产物在组织细胞内 的弥散程度。 的弥散程度。 6.. 反应产生的最终反应产物应是不溶于 水的有色而稳定的物质，沉积于原位， 水的有色而稳定的物质，沉积于原位，其 颜色深度与物质含量或酶活性应有一定量 效关系。 效关系。
由于酶的活性可受到很多因素影响， 7. 由于酶的活性可受到很多因素影响， 因而在酶生化方面有许多要求， 因而在酶生化方面有许多要求，以保证 充分显示酶的活性： 充分显示酶的活性： 最适孵育温度（25最适孵育温度（25-37。C） 最适pH pH值 最适pH值 最适底物及辅助物浓度 激活剂与抑制剂
植物酶的组织和细胞化学定位研究方法
酶是广泛分布于生命有机体的组织细胞内具有催化活性的特殊蛋白质，参与体内几乎所有的细胞功能活动进程。
有些酶类还是不同亚细胞器的标志酶，如酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶，过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶，葡萄糖-6-磷酸酶是内质网的标志酶，氨肽酶是微粒体的标志酶，琥珀酸脱氢酶和细胞色素氧化酶是线粒体的标志酶[1–2]。
目前，由国际生物化学酶学委员会(Enzyme Commission, EC)认定并注册登记编号的酶约有2000多种。
按照酶对底物的特异性、催化性和来源，酶的命名可分为6大类：氧化还原酶(Oxidoreductase, EC 1)、转移酶(Transferase, EC 2)、水解酶(Hydrolase, EC 3)、裂解酶(Lyase ，EC 4)、异构酶(Isomerase, EC 5)和合成酶(Synthetase, EC 6), 这些酶中已知能被现有的组织化学和细胞化学技术原位检测显示的酶仅有200多种[3]。
1980年，简收稿日期： 2014–01–09 接受日期： 2014–04–17基金项目： 广东省科技计划项目资助作者简介： 林植芳(1936~ )，女，研究员，主要从事植物生理学研究。
* 通讯作者Correspondingauthor.E-mail:***************.cn热带亚热带植物学报 2014， 22(5)： 525 ~ 536Journal of Tropical and Subtropical Botany植物酶的组织和细胞化学定位研究方法林植芳*, 刘楠(中国科学院华南植物园，广州 510650)摘要： 酶是参与植物体内生化反应的特殊蛋白质。
在保持活组织和细胞结构完整性的条件下，利用组织化学、细胞化学、免疫学和显微检测等技术研究酶的即位定位，是了解酶在组织、细胞和亚细胞中的分布、活性动态与定量及酶功能等的重要途径。
对植物体中酶定位的组织化学和细胞化学方法的概念、原理与研究进展进行了综述，并根据国际酶化学分类编号顺序，分别介绍了25种酶的组织化学染色定位所用的反应介质和染色方法及46种酶的细胞化学定位方法的参考文献。
酶免疫组织化学染色技术 -回复
酶免疫组织化学染色技术-回复酶免疫组织化学染色技术（Enzyme ImmunoHistoChemistry, E-IHC）是一种常用于组织学研究和病理诊断的方法。
该技术基于免疫学原理，采用酶标标记抗体和细胞色素底物，通过酶的催化作用来检测组织中特定抗原的分布和表达水平。
本文将一步一步回答与酶免疫组织化学染色技术相关的问题。
第一步：样本处理样本处理是酶免疫组织化学染色技术的重要步骤，它的目的是保持组织结构和细胞膜完整性，同时保留目标抗原的免疫原性。
1. 固定化：将组织样本进行固定化处理有助于保持细胞和组织的形态学结构。
最常用的固定剂包括甲醛和乙醇。
甲醛能够形成甲醛-蛋白质交联，从而固定并保持组织中的抗原。
乙醇可以用于去除水分和酮糖，提高抗体的渗透性。
2. 残胶和抗原修复：许多抗原在标本固定过程中会损失其免疫原性，需要进行抗原修复。
常用的修复方法包括热处理、酶消化和酸碱处理等。
热处理通常使用高温蒸煮或压力加热，可使蛋白质水平解离，恢复抗原性。
酸碱处理则通过改变组织的PH值，使抗原解离。
第二步：抗体选择抗体是酶免疫组织化学染色技术的核心。
选择合适的抗体对于获得可靠的结果至关重要。
1. 一抗和二抗：酶免疫组织化学染色一般采用间接法。
首先，使用一抗与目标抗原特异性结合。
随后，使用标记有酶的二抗来识别和结合一抗，从而可视化目标抗原。
常用的二抗有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
2. 选择合适的抗体：选择抗体需要考虑目标抗原的特异性和抗体的亲和性。
在选择抗体时，可以参考文献报道、试剂公司提供的抗体说明书和其他研究人员的建议。
第三步：酶标标记酶标标记是酶免疫组织化学染色技术的另一个关键步骤。
酶标标记抗体在靶抗原区域内催化底物，从而产生特定的染色反应。
1. 酶标物质的选择：常用的酶标物质有HRP和AP。
HRPHRP常用于DAB法（diaminobenzidine）和AEC法（aminoethyl carbazole）等反应体系中，可产生棕色至棕黑色反应。
免疫组织化学检验技术—酶免疫组织化学检验技术(免疫学检验课件)
（二）技术类型 1.直接法
形成抗原一抗体一酶复合物 2.间接法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E复合物 3.酶标抗体三步染色法 为间接法的改良法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E复合物
（三）方法评价
三、非标记抗体酶免疫组化染色法
（一）原理 该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特
异性强的抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结 合形成复合物，然后利用第二抗体（Ab2） 作桥，Ab2既可与 Ab3的Fc段结合，又可与 结合在组织抗原上的第一抗体（Ab1）的Fc 段结合，经酶催化底物的显色反应，达到对 抗原的检测。
4.APAAP法 APAAP法就是以碱性磷酸酶代替HRP建立
的碱性磷酸酶（AP）- 抗碱性磷酸酶（AAP） 法，简称APAAP法。技术要点与PAP法相似。
（三）方法评价
该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由于 酶不是标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗 体反应与抗酶抗体结合，避免了酶标抗体的 缺点，提高了方法的敏感性。尤其是双桥 PAP法，是当今免疫组化技术中敏感性较高 的方法。
通过桥抗体（Ab2）将特异性识别组织抗原 的抗体（Ab1）与PAP复合物的抗酶抗体连 接起来Ag-Ab1-Ab2-PAP
3.双桥PAP法 该法是PAP法的改良，通过两次连接桥抗体
和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了比 PAP法更多的酶分子，大大增强了方法的敏 感性。
酶标记抗体免疫组织化学染色法 非标记抗体酶免疫组织化学染色法
二、酶标记抗体的免疫组化染色法
（一）原的共价键作用将酶直接连接在抗体 （或抗抗体）上，酶标抗体（或抗抗体） 与组织内特异抗原或抗原抗体复合物反应 后，通过酶对底物的催化作用，生成不溶 性有色产物并沉淀在特定位置，达到对抗 原定性、定位、定量检测的目的。
病理学技术-酶组织细胞化学技术
Gomori醋酸-α-萘酯固蓝-B盐法
紫黑色
对氯汞苯甲酸（PCMB）和二乙基对硝苯磷酸盐（E600）
定位于内质网和溶酶体
Mueller-Ranki萘酯-六偶氮对品红法
棕红色或深红色
R-谷氨酰基转移酶
Lojda萘酰胺法
棕黄色或棕色
硫酸铜
琥珀酸脱氢酶
Nachlas硝基蓝四唑法
蓝紫色
Ogawa-Barnett法
正常肝定位于毛细胆管
Dubowitz-Brooke钙激活酶法
黑色
区分红肌纤维和白肌纤维
胆碱酯酶
Snell-Garrett胆碱铜法
棕色或黄棕色
胆碱酯酶染色，分布于血浆、胰腺和唾液腺
Karnovsky-Roots铁氰化铜法
红棕色至深棕色
四异丙基焦磷酰胺（ISO-OMPA）0.137%
乙酰胆碱酯酶染色，分布于神经组织
酶组织细胞化学技术
酶
染色法
结果颜色
激活物
对照方法（抑制物）
注意
碱性磷酸酶
Gomori钙钴法
黑色
金属阳离子
空白对照；热水处理
1、可石蜡切片
2、含铁血黄素与钙盐可出现假阳性
3、不纯的二甲苯对硫化钴有分解作用
Gossrau偶氮吲哚酚法
坚牢蓝VB-暗褐色，BB-浅红色，紫B-蓝色
不同坚牢蓝色号和坚牢紫
酸性磷酸酶
Berry硝酸铅法
棕黑色颗粒
空白对ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ；氟化钠
前列腺含量最高，肝内毛细胆管旁活性最强
Leder-Stutt改良萘酚AS-TR磷酸酯法
红色
热水处理与氟化钠
三磷酸腺苷酶
Wachstein-Mersel镁激活酶法
酶的组织化学
靛蓝
（蓝色沉淀）
酶组化的应用
• 了解组织、细胞的代谢活动，并显示病变 所在部位以帮助诊断 • 帮助确定细胞类型 • 细胞定位和作为某些细胞分化标志 • 用于肿瘤的研究及帮助诊断 • 用于免疫组化和原位杂交的显示手段
酶
α- 萘酚磷酸钠+水 ――→磷酸氢二钠+ α萘酚
α-萘酚+坚牢蓝――→偶氮染料沉淀
联苯胺色素法
酶 无色联苯胺 脱 氢 有色联苯胺 联苯胺褐
• 用于检测过氧化物酶 eg：DAB法
四唑盐法
• 底物被氧化酶或脱氢酶作用，使底物氧化并释放 出氢，产生的氢离子被传递给受氢体（无色的四 唑盐），受氢体被还原为有色不溶性沉淀物（双 甲 formazane ） • 用于单胺氧化酶和脱氢酶 • 常用的四唑盐
• 第一反应（酶促反应）
– 细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产 物，即初级反应产物(Primary reaction product, PRP)
• 第二反应（捕捉反应）
– 初级反应产物与辅助物（捕捉剂）经一步或二 步反应，生成有色不溶性的终反应产物(Final reaction product, FRP)
• 作用特点
– 高度催化效率 – 高度专一性（底物特异性）
酶的定位
• • • • 细胞核内：DNA核苷酸转移酶 细胞质内：乳酸脱氢酶 细胞膜内：碱性磷酸酶 细胞器内
– 线粒体：琥珀酸脱氢酶 – 内质网：葡萄糖-6-磷酸酶 – 溶酶体：酸性磷酸酶
酶组织化学基本原理
酶 底物 PRP(无色） 捕捉剂 FRP（有色）
转移酶 Transferases
酶的分类
水解酶 Hydrolases 裂合酶 Lyases
异构酶 Isomerases 合成酶 Ligases
酶组织化学技术
第二章酶组织化学技术酶（enzyme）是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质，在细胞的各个部位都有酶的存在。
人和动物体内的各种化学反应（包括新陈代谢反应）都必须由酶来催化，没有酶的存在，体内生物化学反应就无法进行。
组织及细胞中含有多种酶类，主要包括碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、ATP酶、非特异性酯酶、胆碱酯酶、琥珀酸脱氢酶、γ-谷氨酰转肽酶等。
组织细胞内的各种酶均不具有使其本身直接可见性的特性，常需用某些方法在一定条件下将组织细胞中的酶作用于特定的底物，以底物分解产物作为反应物质，在原作用部位进行捕捉反应，从而使其具有可见性。
这种通过酶的作用形成反应产物，经捕捉反应来显示细胞和组织结构中的各种酶，并对其进行定性、定位、定量的方法称为酶组织化学反应。
酶组织化学技术在人类认识疾病的科学实践中曾非常活跃，50~60年代在病理学上的应用达到高峰。
它所涉及的内容相当广泛，如利用酶组织化学方法研究生物体内细胞形态与其代谢、功能的关系；在病理学领域中，研究疾病发生、发展的代谢基础；肿瘤的诊断及鉴别诊断；肿瘤的代谢功能及形态与酶组织化学的变化规律；以多种酶组织化学指标显示细胞损害程度，从而检测新药物及其临床毒性等。
但由于酶组织化学技术操作较复杂，需用新鲜组材料，且多数反应特异性不高，故其应用受到限制。
同时因酶为蛋白质，它在福尔马林固定及石蜡包埋的组织中虽然失去了酶活性，但仍具有免疫原性，这使得应用较为特异的免疫组织化学方法显示酶成为可能，因而不少酶组织化学染色现已被免疫组织化学技术所代替。
但应指出的是，有一些酶组织化学方法仍以其良好的特异性在病理诊断及研究领域被广泛应用。
目前最常应用于诊断的酶组织化学方法有骨骼肌相关酶（用于诊断肌病）、乙酰胆碱酯酶（用于诊断先天性巨结肠）、氯乙酸酯酶（用于辨认骨髓髓细胞系统的细胞和肥大细胞）以及酸性磷酸酶等染色方法。
第一节酶组织化学反应的方法和基本原理一、酶组织化学反应的主要方法和基本原理1．金属沉淀反应法酶的分解产物可与大多数金属结合，金、银、铜、铁、铅、钴及其化合物均具有颜色，因此，在酶反应时使其与金属结合，利用其呈色反应，显示出酶反应的部位，间接地证明某种酶的存在。
生物化学酶的结构
一、酶分子的化学组成酶的本质是蛋白质。
酶与其他蛋白一样，由氨基酸构成，具有一、二、三、四级结构。
酶也会受到某些物理、化学因素作用而发生变性，失去活力。
酶分子量很大，具有胶体性质，不能透析。
酶也能被蛋白酶水解。
1.辅因子有些酶完全由蛋白质构成，属于简单蛋白，如脲酶、蛋白酶等；有些酶除蛋白质外，还含有非蛋白成分，属于结合蛋白。
其中的非蛋白成分称为辅因子(cofactor)，蛋白部分成为酶蛋白，复合物叫全酶。
辅因子一般起携带及转移电子或功能基团的作用，其中与酶蛋白以共价键紧密结合的称为辅基，以非共价键松散结合的称为辅酶。
在催化过程中，辅基不与酶蛋白分离，只作为酶内载体起作用，如黄素蛋白类酶分子中的FAD、FMN辅基携带氢，羧化酶的生物素辅基携带羧基等等。
辅酶则常作为酶间载体，将两个酶促反应连接起来，如NAD+在一个反应中被还原成NADH，在另一个反应中又被氧化回NAD+。
它在反应中象底物一样，有时也称为辅底物。
有30％以上的酶需要金属元素作为辅因子。
有些酶的金属离子与酶蛋白结合紧密，不易分离，称为金属酶；有些酶的金属离子结合松散，称为金属活化酶。
金属酶的辅因子一般是过渡金属，如铁、锌、铜、锰等；金属活化酶的辅因子一般是碱金属或碱土金属，如钾、钙、镁等。
2.单体酶、寡聚酶和多酶体系由一条肽链构成的酶称为单体酶，由多条肽链以非共价键结合而成的酶称为寡聚酶，属于寡聚蛋白。
有时在生物体内一些功能相关的酶被组织起来，构成多酶体系，依次催化有关的反应。
构成多酶体系是代谢的需要，可以降低底物和产物的扩散限制，提高总反应的速度和效率。
有时一条肽链上有多种酶活性，称为多酶融合体。
如糖原分解中的脱支酶在一条肽链上有淀粉-1，6-葡萄糖苷酶和4-α-D-葡聚糖转移酶活性；来自樟树种子的克木毒蛋白（camphorin）由一条肽链组成，有三种活性：①RNA N-糖苷酶活性，可水解大鼠28S rRNA中第4324位腺苷酸的糖苷键，释放一个腺嘌呤；②依赖于超螺旋DNA构型的核酸内切酶活性，专一解旋并切割超螺旋环状DNA形成缺口环状和线状DNA；③超氧化物歧化酶活性。
酶组织化学染色诊断-概述说明以及解释
酶组织化学染色诊断-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述：酶组织化学染色是一种用来检测组织中特定酶活性的技术手段。
通过这种方法，可以直观地观察组织中的酶分布和活性水平，从而为疾病的诊断和治疗提供重要的依据。
酶组织化学染色技术已经在医学领域得到广泛应用，例如肿瘤诊断、炎症检测等。
本文将介绍酶组织化学染色的原理、应用和优势，旨在帮助读者更好地了解和运用这一重要的诊断工具。
1.2 文章结构文章结构部分主要是指出本文的组织结构和内容安排。
首先，我们将介绍酶组织化学染色的基本原理，包括染色的方法和操作步骤。
然后，我们将探讨酶组织化学染色在医学诊断中的应用，包括疾病诊断和治疗效果监测等方面。
接着，我们将分析酶组织化学染色相比传统染色方法的优势和不足之处。
最后，我们将总结本文的主要内容，展望酶组织化学染色在未来的发展方向，并提出一些思考和建议。
通过这样的结构，读者可以清晰地了解本文的主要内容和观点，有助于更好地理解和评价酶组织化学染色在临床诊断中的应用。
1.3 目的酶组织化学染色作为一种重要的病理分析技术，在临床诊断、研究和治疗中起着至关重要的作用。
本文旨在深入探讨酶组织化学染色的原理、应用和优势，以帮助读者更好地了解这一技术的价值和意义。
通过系统性的介绍和分析，希望能够为医学和科研工作者提供更丰富的知识和实践经验，从而推动该领域的进一步发展和应用，为疾病的早期诊断和精准治疗提供更有效的支持和指导。
同时，也希望通过本文的阐述，引起更多学者和医生对酶组织化学染色技术的关注和重视，为医学科研领域的进步和人类健康事业的发展作出贡献。
2.正文2.1 酶组织化学染色的原理:酶组织化学染色是一种通过酶的催化作用来检测组织中特定分子的方法。
在这种方法中，首先需要选择适当的酶作为标记物，常用的酶包括过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
然后将标记的抗体与待检测的抗原特异结合，形成抗原-抗体复合物。
接着，加入对应的底物，酶会催化底物的化学反应，产生可见的染色产物。
酶组织化学染色诊断
酶组织化学染色诊断酶组织化学染色是一种常用的病理学方法，用于诊断和研究组织和细胞中酶的活性和表达情况。
通过染色反应，酶活性的变化可以在组织切片中可视化，从而为疾病的诊断和治疗提供重要的依据。
在酶组织化学染色中，常用的染色剂包括酶底物和染色显色剂。
酶底物是一种可以被特定酶催化反应的物质，而染色显色剂则是将酶催化反应转化为可见颜色的物质。
通过这种方式，可以通过染色显色的结果来间接评估组织和细胞中特定酶的活性水平。
酶组织化学染色的最大优势之一是可以在组织切片中直观地显示酶的分布和表达情况。
不同的酶在不同的组织和细胞类型中表达不同，因此，通过观察染色结果，可以对组织和细胞的类型进行初步鉴定。
例如，在肿瘤组织中，常常可以观察到某些特定酶的过表达，这可能与肿瘤的发生和发展有关。
酶组织化学染色还可以用于评估酶活性的定量变化。
通过对染色结果的定量分析，可以对不同组织和细胞中酶活性的差异进行比较。
这对于研究酶的功能和调控机制以及评估治疗效果具有重要意义。
然而，酶组织化学染色也存在一些限制。
首先，染色结果受到多种因素的影响，包括染色剂的浓度和反应时间、切片的处理和保存条件等。
因此，在进行酶组织化学染色时，需要严格控制这些因素，以确保结果的准确性和可靠性。
其次，染色结果通常只是一种间接指标，不能直接反映酶的功能状态。
因此，在对染色结果进行解读时，需要结合其他病理学和临床资料进行综合分析。
总的来说，酶组织化学染色是一种重要的病理学方法，可以用于疾病的诊断和研究。
通过对酶活性的可视化，可以直观地评估组织和细胞中酶的表达情况，并为疾病的诊断和治疗提供重要的信息。
然而，在使用酶组织化学染色时，需要注意染色条件的控制和结果的解读，以确保结果的准确性和可靠性。
酶组织化学应用汇总.
OH
OH （ H）
最适PH因组织而异。小鼠肾为7.5, 睾丸、脑、肝分 别为8.5、7.5~8.5、8.0
激活剂：Mg++，Mn ++ 抑制剂：氟化钠（0.1M NaF），硼酸钠
5′核苷酸酶存在于胞膜，为胞膜的标志酶
5′核苷酸酶的显示----铅法
【基本原理】5′Nase水解底物5′单磷酸腺苷
AMP
酶组织化学
---水解酶及氧化还原酶
组织化学原理及方法
显示酶的组织化学方法
1.金属沉淀法：磷酸酶的显示
甘油磷酸钠
酸性磷酸酶
磷酸酯+铅 酶
磷酸铅
硫化铅
2.偶氮偶联法：显示各种酶类最重要的方法
底物 重氮盐 初级反应产物（PRP） 最终反应产物（FRP）
3.电子传递法：氧化酶和脱氢酶的显示
水解酶---这是一类增加或去除水，催化 水解反应的酶 AB+H2O AH+BOH
1. 小块组织液氮骤冷, 低温冰箱切片 2. 甲醛钙液(Fca)固定5分钟, 4℃, 然后蒸馏水洗, 也可不固定
3. 作用液5~60分钟, 37℃或室温 4. 蒸馏水洗 5. 4%甲醛固定15分钟~2小时, 室温 6. 自来水洗, 蒸馏水洗 7. 1%甲基绿(氯仿洗过)5~10分钟, 蒸馏水洗 8. 甘油明胶封片, 或丙酮-丙酮甲苯-DPX封固
显示酸性磷酸酶的常用方法
1. 酸性磷酸酶硝酸铅法
【基本原理】与碱性磷酸酶钙钴法的原理相似 ACP 甘油磷酸钠 磷酸酯+铅 磷酸铅
硫化铅（黑色）
【孵育液】硝酸铅，巴比妥-硝酸盐缓冲液，β-甘油磷酸钠 【结果】酸性磷酸酶活性处呈棕黑色
2. 同时偶联法
【基本原理】ACP在酸性条件下水解萘酚AS-TR磷酸酯为萘酚ASTR和磷酸, 萘酚AS-TR和六偶氮对品红偶联, 在酶活性处形成红 色的不溶性复合物 【孵育液】萘酚AS-TR磷酸酯, 六偶氮对品红
酶免疫组织化学染色技术
酶免疫组织化学染色技术一、酶免疫染色原理酶免疫组织化学染色技术是一种利用酶催化反应原理，将抗体与酶结合，形成酶标抗体，并将其固定在组织上，通过显色反应，检测抗原-Ab的结合，从而对组织中的抗原进行定位、定量及定性的一种免疫组织化学技术。
酶免疫染色原理主要包括酶促反应和免疫反应两个阶段，其中酶促反应阶段主要是抗体与酶的结合，而免疫反应阶段则是抗原-Ab的结合。
二、酶免疫组织化学染色步骤1. 组织处理：将组织样本进行固定、脱水、透明化等处理。
2. 抗原修复：采用加热或化学方法使抗原从组织中释放出来，暴露出抗原表位。
3. 阻断：加入内源性过氧化物酶阻断剂，以消除组织中存在的过氧化物酶活性。
4. 孵育：加入酶标抗体，在组织中与抗原特异性结合。
5. 显色：加入底物溶液，在组织中形成有色产物，以可视化抗原-Ab 的结合。
6. 观察：观察并记录染色结果。
三、酶免疫组织化学染色的应用酶免疫组织化学染色技术广泛应用于医学和生物学领域，包括肿瘤诊断、病原微生物检测、细胞凋亡和坏死检测等方面。
通过对组织中特定抗原的检测，可以揭示疾病的发生、发展过程以及药物治疗的效果。
四、酶免疫组织化学染色技术的发展随着生物技术的不断发展，酶免疫组织化学染色技术也在不断改进和完善。
近年来，该技术已逐渐向自动化、定量化和标准化方向发展。
自动化技术可以减少人为操作误差，提高实验的重复性和准确性；定量技术可以实现对组织中抗原的定量检测，揭示抗原表达水平与疾病发生、发展的关系；标准化技术可以保证不同实验室之间的实验结果具有可比性，提高实验结果的可靠性。
五、未来趋势随着生物技术的不断发展，酶免疫组织化学染色技术的未来发展趋势将主要体现在以下几个方面：1. 多指标联合检测：将多种指标联合检测，可以更全面地揭示疾病的发生、发展过程以及药物治疗的效果。
例如，可以将肿瘤标志物、细胞因子等指标联合检测，以更准确地诊断肿瘤并评估治疗效果。
2. 免疫荧光与免疫组织化学联合应用：免疫荧光技术可以实现对组织中抗原的准确定位和定性分析，而免疫组织化学技术则可以对组织中抗原进行定量分析。
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（一）A1型题(标准型)1.免疫组化技术的关键步骤是A.标本处理B.抗体的处理与保存C.免疫染色D.设立对照试验E.结果判断2.免疫组化技术的首要试剂是A.抗原B.抗体C.标记物D.固定剂E.洗涤液3.酶免疫组化技术中，关于标本处理的说法正确的是A.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。
B.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。
C.充分洗后于室温用0.5%H2O2和90%甲醇处理20～30min。
D.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。
E.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。
4.PAP法是Sterberger等于哪一年建立的A.1950B.1960C.1970D.1980E.19905.PAP复合物中的酶是A.辣根过氧化物酶B.碱性磷酸酶C.葡萄糖氧化酶D.胃蛋白酶E.胶原酶8.PAP法中的“桥”是A.第一抗体B. 第二抗体C. 第三抗体D.亲和素E.第四抗体9.ABC技术由美籍华人Hsu于哪一年建立，已广泛应用于免疫学检测技术A.1961B.1975C.1981D.1985E.199010.ABC法中的“桥”是指A.第一抗体B. 第二抗体C. 第三抗体D.亲和素E.链霉素亲和素14.免疫组化法吸收试验是用过量已知抗原与抗体在多少度以下充分反应，离心后再行免疫组化染色A.4℃B.20℃C.40℃D.37℃E.50℃23．PAS反应是检测组织内的：A.核酸B.脂C.蛋白质D.多糖E.抗原一、填空1、免疫组织化学中最常用的标记物是__荧光素__、_酶_ 、生物素和亲和素_、_铁蛋白和胶合金_。
原位杂交组织化学中常用的标记物有__放射性同位素_________和非同位素标记物___________两大类。
2、常用的粘附剂有_蛋白甘油_、甲醛明胶_、多聚赖氨酸__等。
3、抗原决定簇是指__抗原___________分子表面的、具有活性的___特异性化学集团________。
4、一般组织化学是利用化学或物理反应，在组织标本上加入一定的_化学试剂____________，使其发生反应，形成__有色沉淀物___________，能在显微镜下观察。
常用于检测_糖类__脂类_______、核酸____________ 、_酶_________等。
5、酶组织化学是利用酶对其_底物___________的催化作用，生成初反应产物__________，再与某种_捕捉剂_________反应，形成__有色终反应物沉淀物__________沉淀，检测__酶_________分布及活性的方法。
常用的方法有_金属沉淀法__________ 、_偶氮偶联法__________、__四唑盐法__________、__靛蓝法________和___DAB法_________。
6、最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是_PAS反应__________。
7.、免疫染色对特殊标本的进一步处理常用_蛋白酶消化法_______和_非特异吸附法_______法。
8、免疫组化中最常用的制片方法是_冰冻切片______和_石蜡切片_______。
9、免疫组化染色后，阳性细胞的染色分布有三种类型，分别是_胞质型________、_细胞核型________和__细胞膜表面型_____。
10、酶免疫组化技术中最常用的酶有辣根过氧化物酶_________、碱性磷酸酶__________及_葡萄糖氧化酶________。
11、免疫电镜标本的制备主要有_非包埋法免疫染色________、包埋前免疫染色__________和_包埋后免疫染色________三种。
12、组织块包埋前需先经_固定_____，常用的包埋剂是__石蜡、火棉胶、炭蜡___13、光学显微镜下观察的固定标本除组织切片外，还有_涂片_____、_铺片_____和_磨片_____。
14、免疫细胞化学术中常用的标记物有_荧光素、酶_、_胶体金、亲和物质_和_铁蛋白一、名词解释;1.HE染色法：苏木精—伊红染色法( hematoxylin-eosin staining ) ，简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。
苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。
2固定：为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定，其作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抵制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。
3.银染法：又称镀银或银浸法，是显示神经细胞、神经纤维和网状纤维的一种方法，在分子生物学中用于DNA核苷酸序列分析，将切片浸于银盐（如硝酸银）染料中，使银盐沉淀在这些结构的表面而显出黑褐色，其余结构不着色，这样观察切片就很清晰。
4冷冻切片：是新鲜组织或固定组织在低温下快速冷冻后制备组织切片的方法。
一般是将组织块置于干冰或液氮中使其快速冻结，然后在恒冷箱切片机内制冷冻切片。
制片快速，常用于外科手术切除标本的快速病理诊断。
5.组织化学（histochemistry）和细胞化学（cytochemistry）技术：是通过化学或物理反应原理显示组织切片细胞内某种化学成分，进行定位、定量及其与功能相关的研究。
如糖类、脂类、酶、核酸等与试剂发生化学物理反应，形成有色终末产物，在光镜下观察，有的可在电镜下观察。
6.免疫细胞化学技术：是应用免疫学原理，通过特异性标记抗体与抗原（某种蛋白质、多肽等）的结合来显示细胞内某种抗原，并进行定位和定量的研究方法。
[免疫组化技术，是在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，借助可见的标记物，对相应抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检查方法。
7.原位杂交：是在免疫细胞学化学的基础上发展起来的一种核酸分子杂交技术，用来检测细胞内某种蛋白质的基因（DNA片段或mRNA片段）表达和定位与定量研究，目前已经成为细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。
其基本原理是应用已知的并被标记的核酸片段（同位素或荧光素、酶等标记的探针）与细胞内待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，在光镜和电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。
8.胶体金：是氯金酸的水溶液，具有亲电子密度，并能与多种生物大分子结合，已成为继荧光素、放射性核素和酶之后在免疫标记技术中较常用的一种非放射性示踪物。
9.简述石蜡切片的制备过程：1．取材及固定2．冲洗3．脱水和硬化4．透明5．浸渗6．包埋7．塑型和切片8．展片和粘片9．染色和封固最后，将干燥好的切片上的浮色擦净，并在玻片的左端粘上标签，注明组织切片的名称、染色方法、固定方法、年月日。
10.背景着色：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。
血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。
11. 一抗和二抗：第一抗体就是能和非抗体性抗原特异性结合的蛋白。
种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。
第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。
第一抗体就是平常所说的抗体，即能和抗原特异性结合。
第二抗体是能和抗体结合的，即抗体的抗体。
主要用于检测抗体的存在。
一抗是针对抗原的抗体，二抗是针对一抗的抗体。
12.探针：是一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。
双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷-32）、萤光染料或者酶（如辣根过氧化物酶）标记成为探针。
13.免疫组织化学技术：利用标记物标记的抗体与组织或细胞的抗原反应，结合形态学检查，对抗原做定性、定量、定位检测的技术。
三、简答题（一）免疫组织化学的全过程包括哪些步骤？1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的制备；5.免疫细胞化学反应以及呈色反应；6.显微镜下观察结果。
（二）2.免疫组化标本固定时，好的固定剂应满足哪些要求？要求：1能快速固定抗原2防止抗原物质扩散3固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应（三）3.简述荧光免疫组化技术直接法的原理？原理：将荧光素标记的已知抗体（或抗原）与切片（印片）中相应抗原（或抗体）直接发生反应，以检测组织与细胞标本中的靶抗原（或抗体）。
（四）4.何谓免疫电镜技术？指免疫电镜技术是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合的在亚细胞和超微结构水平上对抗原进行定位分析的一种高度精确、灵敏的技术。
此技术成功的关键是①对细胞超微结构的完好保存②保持被检细胞或其亚细胞结构的抗原表位，其抗原性不受损伤③选择的免疫试剂能顺利穿透组织细胞结构与抗原结合。
四论述题（一）1.试述酶免疫组化技术的原理及其应用？原理：酶免疫组化技术是利用酶标记已知抗体（或抗原），然后与组织标本中相应抗原（或抗体）在一定条件下相互结合形成带酶分子的复合物，酶遇到底物时，能催化底物水解，或氧化或还原，产生有色的不溶性产物，出现显色反应，在显微镜下进行细胞与组织表面或内部某种抗原成分的定位观察分析。
免疫组化在人体研究中的主要用途：㈠免疫组化在肿瘤病理学的研究和诊断中的主要应用：（1）组织起源不明肿瘤的研究；（2）研究病原体与肿瘤的关系；（3）协助确定肿瘤的良恶性；（4）测定肿瘤细胞的增殖活性；（5）分化差的癌和肉瘤的鉴别；（6）确定转移性恶性肿瘤的原发灶；（7）恶性淋巴瘤的诊断和分型；（8）为制定肿瘤的治疗方案提供依据。
㈡免疫组化技术在病原微生物的鉴定中的应用；㈢免疫性皮肤疾病在诊断中的应用（二）：2. 试述任意3种酶组织化学技术的反应原理?1金属沉淀反应法酶的分解产物可与大多数金属结合金、银、铜、铁、其化合物均具有颜色因此在酶反应时使其与金属结合利用其呈色反应显示出酶反应的部位间接地证明某种酶的存在。
该法主要用于显示磷酸酶如显示碱性磷酸酶的钙钴法和显示酸性磷酸酶的硝酸铅法。
2偶联偶氮法此法又称偶氮色素法其基本原理是使用某种人工合成底物，在酶作用下产生分解产物与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应形成不溶性偶氮色素以此对酶进行定位。
3色素形成法在酶作用下使底物的无色化学物质在作用的局部形成色素沉着，从而达到显示酶定位的目的。
常用的有①四唑盐法②靛蓝形成法（三）3. 试述免疫荧光双标记技术（间接法）的原理和当两种一抗及两种二抗分别混合使用时应注意的问题？原理：先用已知未标记的特异抗体（一抗）与抗原反应，再用标记的抗体（二抗）与其反应，形成抗原-抗体-抗体复合物，水洗-干燥-封镜-镜检（四）4. 试述免疫组织化学ABC技术中，组织抗原、一抗、二抗和ABC如何依次相互结合的?抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术简称ABC法，是在BRAB法和LAB法的基础上改良的，其特点是利用抗生素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。