蛋白质糖基化的研究及进展
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蛋白质糖基化的研究及进展
1概
述
1988年，牛津大学的 Raymond Dwek 在 Annual Review of Biochemistry上 发表题为 “糖生物学”的综述，标志糖生物学这一前沿领域的诞生。
美国的新罕布什大学 首先开展了“糖组学”（glycomics) 的研究
美国于2001年正式启动了“功能糖组学”的研究
“连接方式异构体” “分枝形成”
2 蛋白质糖基化的分类
1．O-糖基化 糖链通过GalNAc连接在蛋白质的Ser或Thr 糖基化: 糖基化 等侧链的羟基处
2．N-糖基化 糖链连接在蛋白质的Asn的氨基侧链处 糖基化: 糖基化
3．GPI-Anchor糖基化 蛋白质通过肽链的C端共价连接 的 糖基化: 糖基化 糖基磷脂酸肌醇锚定在膜脂上。
Leabharlann Baidu
3.O-β-GlcNAc 糖基化研究
4 糖基化蛋白质的分离技术
是一种典型的对于一系列高甘露糖型的N-连接糖链 是一种典型的对于一系列高甘露糖型的 连接糖链 具有高亲和性的植物凝集素， 具有高亲和性的植物凝集素， 同时也能结合复杂型 连接糖链及双分枝的复杂型的N-连接糖链 的N-连接糖链及双分枝的复杂型的 连接糖链 连接糖链及双分枝的复杂型的 蛋白质混合物 分离纯化糖蛋白 糖肽 凝集素 ConA
2 糖链组成，连接顺序及连接方式的分析 ESI 串联质谱可以MS 和MS/MS谱图进行解析
质量数推断对于同质量异构的糖基无法分辨（ 质量数推断对于同质量异构的糖基无法分辨（Man/Glu) 对于同质量异构的糖基无法分辨 外切糖苷酶处理后， 利用 外切糖苷酶处理后，再分析 具体的糖链结构还需进行衍生化。（甲基化， 。（甲基化 具体的糖链结构还需进行衍生化。（甲基化，还原胺化）
蛋白质糖基化的研究策略
1.凝胶技术与质谱联用 凝胶技术与质谱联用
与磷酸化之间存在 “阴阳”关系 可以 被筛选和鉴定
细胞组织
双向电泳
切割 酶切
质谱分析 糖链鉴定 数据库搜索 靶蛋白鉴定及功能分析
2.非凝胶技术与质谱联用 非凝胶技术与质谱联用
O-β-GlcNA pr 亲和层析 母离子扫描 366 数 据 库 搜 索 鉴 定
展
望
由于糖蛋白本身的复杂性， 由于糖蛋白本身的复杂性，蛋白质糖基化的研究必须 采取多元化的研究策略和技术， 采取多元化的研究策略和技术，而各种新的检测方法也不 断的被采用。 断的被采用。
随着各种分离技术的不断发展，研究方法也不断 随着各种分离技术的不断发展， 翻新。 翻新。蛋白质糖基化研究也将成为翻译后修饰研究的新热 点
“功能糖组学” 研究目标
阐明由蛋白质-糖链所介导的细胞通讯机制 阐明由蛋白质 糖链所介导的细胞通讯机制 基因组计划提供了基本的遗传信息，而许多基因的功能仍需 要阐明。其中的关键就是蛋白质的翻译后修饰，而糖基化 是最主要的翻译后修饰之一。
糖组学研究的重心便是蛋白质糖基化的研究。 糖组学研究的重心便是蛋白质糖基化的研究。
增强疏水性和离子化能力
离子肼和FTICR在分析糖链结构方面有其独特优势 Cancilla 利用碱性降解和MALIDY-FT-MS 成功分析了寡糖 连接方式
Q-TOF-MS 高分辨 高灵敏度 高精确度 母离子扫描 HexNAc+ (m/z 204) HexHexNAc + (m/z366)
MALDI-TOF-MS 能方便的检测出衍生或未衍生的寡 糖 可以直接分析分子质量较大的糖蛋白，并分辨不均 可以直接分析分子质量较大的糖蛋白， 一性
2 与凝集素联用的检测方法 蛋白质印迹到膜上后，与标记了地高辛的凝集素一起孵育， 再通过与带有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合，最后加入 显色试剂进行检测。
6 质谱在蛋白质糖基化研究中的应用
1 位点分析 a 特征离子检测 寻找糖基特征离子，进而确定糖肽 如 NacGlc 特征离子为 m/z 204 b 酶处理前后酶解肽谱比对 在TIC图上，酶解前的糖肽峰酶解后消失，出现去糖肽， 根据去糖肽的相对分子量及MS/MS图确定糖基化位点
3 蛋白质糖基化常用研究方法
糖基化位点分析 糖基化蛋白分析 糖链分析
糖蛋白
因为糖链的复杂性，很难通过单一的方法进行序列测定等研究，需 要多种方法组合完成。
单糖分析 糖链释放
蛋白酶水解
去糖基蛋白
糖链 氨基酸分析
糖基肽
肽链
氨基酸序列分析 糖链释放
去糖基肽链
糖链
分馏/纯化 结构分析 酶解 糖基肽/寡糖多糖图谱 质谱 核磁共振
PNA
花生凝集素是组织化学中用于检测T抗原的。 抗原在黏蛋 花生凝集素是组织化学中用于检测 抗原的。 T抗原在黏蛋 抗原的 白中广泛存在（如血型糖蛋白A） 可广泛结合于存在O-连接 白中广泛存在（如血型糖蛋白 ） 可广泛结合于存在 连接 糖链的T抗原上 糖链的 抗原上
5 糖基化蛋白的检测技术
1 荧光染色检测法 丹磺酰肼 检测聚丙烯酰胺凝胶中的糖蛋白 绿色荧光蛋白 即 Pro-Q Emerald 300 染色剂 SYPRO Rubby Pro-Q Emerald 488
蛋白质糖基化研究的基本目标是： 蛋白质糖基化研究的基本目标是：
基因组信息
寻找编码糖蛋白的基因
糖基化位点信息
寻找糖基化位点
结构信息
解析糖链及糖基化肽段的结构
功能信息
研究糖基化的功能
现代分子生物学的中心法则：
蛋白质的糖基化在生物体是广泛存在的。 真核细胞中，有一半以上的蛋白质被糖基化
糖链的多样性和复杂性
谢
谢
主要参考文献
1 夏其昌 曾嵘等 蛋白质化学与蛋白质组学 科学出版社 2004 2 Hirabayashi J ,etc JCB 2002,771(1-2):67-87 3 Hirabayashi J ,etc Trends Glycosci Glyco ,2000,20(6):286-287 4 Courtenay Hart etc Electrophoresis 2003, 24, 588–598 5 Cristian I. Ruse etc Anal. Chem.2002, 74,1658-1664 6 STEVEN A etc Protein Science (1993), 2, 183-196. 7 Benjamin L. etc Anal. Chem.2002, 74,6088-6097 8 Wei Li,etc Anal. Chem.2002, 74,5701-5710 9 Rong Zeng,etc Eur. J. Biochem. 266, 352-358 (1999) 10 Pauline M.etc Proteomics 2001, 1, 285–294 11Schulz BL etc Anal Chem,2002,74:6088-6097 12Robbe C, etc Biochem J 2004 Dec1 ; 384：307-16 13Suzuki ,etc, Anal Chem, 2006 Apr 1;78(7):2239-2243 14Sparbier K，etc J Biomol Tech. 2005 Dec;16(4):407-13 15Fukui etc, Nat Biotechol,2002,20:1011-1077
Mana1-6(Mana1-3)Manβ Mana1-2Mana1-6 (Mana1-3)Manβ 较强 最强
缺少三甘露糖核心结构或含有阻碍性的3-OH， 较弱 6-OH取代基团的Mana（α1-6）
Galectin LEC-6
半乳糖苷结合凝集素是一类分布广泛，不依赖于金属离子的 可溶性凝集素 很多生物具有保守性 倾向于结合包含半乳糖且 具有分枝结构的N-连接糖链
1概
述
1988年，牛津大学的 Raymond Dwek 在 Annual Review of Biochemistry上 发表题为 “糖生物学”的综述，标志糖生物学这一前沿领域的诞生。
美国的新罕布什大学 首先开展了“糖组学”（glycomics) 的研究
美国于2001年正式启动了“功能糖组学”的研究
“连接方式异构体” “分枝形成”
2 蛋白质糖基化的分类
1．O-糖基化 糖链通过GalNAc连接在蛋白质的Ser或Thr 糖基化: 糖基化 等侧链的羟基处
2．N-糖基化 糖链连接在蛋白质的Asn的氨基侧链处 糖基化: 糖基化
3．GPI-Anchor糖基化 蛋白质通过肽链的C端共价连接 的 糖基化: 糖基化 糖基磷脂酸肌醇锚定在膜脂上。
Leabharlann Baidu
3.O-β-GlcNAc 糖基化研究
4 糖基化蛋白质的分离技术
是一种典型的对于一系列高甘露糖型的N-连接糖链 是一种典型的对于一系列高甘露糖型的 连接糖链 具有高亲和性的植物凝集素， 具有高亲和性的植物凝集素， 同时也能结合复杂型 连接糖链及双分枝的复杂型的N-连接糖链 的N-连接糖链及双分枝的复杂型的 连接糖链 连接糖链及双分枝的复杂型的 蛋白质混合物 分离纯化糖蛋白 糖肽 凝集素 ConA
2 糖链组成，连接顺序及连接方式的分析 ESI 串联质谱可以MS 和MS/MS谱图进行解析
质量数推断对于同质量异构的糖基无法分辨（ 质量数推断对于同质量异构的糖基无法分辨（Man/Glu) 对于同质量异构的糖基无法分辨 外切糖苷酶处理后， 利用 外切糖苷酶处理后，再分析 具体的糖链结构还需进行衍生化。（甲基化， 。（甲基化 具体的糖链结构还需进行衍生化。（甲基化，还原胺化）
蛋白质糖基化的研究策略
1.凝胶技术与质谱联用 凝胶技术与质谱联用
与磷酸化之间存在 “阴阳”关系 可以 被筛选和鉴定
细胞组织
双向电泳
切割 酶切
质谱分析 糖链鉴定 数据库搜索 靶蛋白鉴定及功能分析
2.非凝胶技术与质谱联用 非凝胶技术与质谱联用
O-β-GlcNA pr 亲和层析 母离子扫描 366 数 据 库 搜 索 鉴 定
展
望
由于糖蛋白本身的复杂性， 由于糖蛋白本身的复杂性，蛋白质糖基化的研究必须 采取多元化的研究策略和技术， 采取多元化的研究策略和技术，而各种新的检测方法也不 断的被采用。 断的被采用。
随着各种分离技术的不断发展，研究方法也不断 随着各种分离技术的不断发展， 翻新。 翻新。蛋白质糖基化研究也将成为翻译后修饰研究的新热 点
“功能糖组学” 研究目标
阐明由蛋白质-糖链所介导的细胞通讯机制 阐明由蛋白质 糖链所介导的细胞通讯机制 基因组计划提供了基本的遗传信息，而许多基因的功能仍需 要阐明。其中的关键就是蛋白质的翻译后修饰，而糖基化 是最主要的翻译后修饰之一。
糖组学研究的重心便是蛋白质糖基化的研究。 糖组学研究的重心便是蛋白质糖基化的研究。
增强疏水性和离子化能力
离子肼和FTICR在分析糖链结构方面有其独特优势 Cancilla 利用碱性降解和MALIDY-FT-MS 成功分析了寡糖 连接方式
Q-TOF-MS 高分辨 高灵敏度 高精确度 母离子扫描 HexNAc+ (m/z 204) HexHexNAc + (m/z366)
MALDI-TOF-MS 能方便的检测出衍生或未衍生的寡 糖 可以直接分析分子质量较大的糖蛋白，并分辨不均 可以直接分析分子质量较大的糖蛋白， 一性
2 与凝集素联用的检测方法 蛋白质印迹到膜上后，与标记了地高辛的凝集素一起孵育， 再通过与带有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合，最后加入 显色试剂进行检测。
6 质谱在蛋白质糖基化研究中的应用
1 位点分析 a 特征离子检测 寻找糖基特征离子，进而确定糖肽 如 NacGlc 特征离子为 m/z 204 b 酶处理前后酶解肽谱比对 在TIC图上，酶解前的糖肽峰酶解后消失，出现去糖肽， 根据去糖肽的相对分子量及MS/MS图确定糖基化位点
3 蛋白质糖基化常用研究方法
糖基化位点分析 糖基化蛋白分析 糖链分析
糖蛋白
因为糖链的复杂性，很难通过单一的方法进行序列测定等研究，需 要多种方法组合完成。
单糖分析 糖链释放
蛋白酶水解
去糖基蛋白
糖链 氨基酸分析
糖基肽
肽链
氨基酸序列分析 糖链释放
去糖基肽链
糖链
分馏/纯化 结构分析 酶解 糖基肽/寡糖多糖图谱 质谱 核磁共振
PNA
花生凝集素是组织化学中用于检测T抗原的。 抗原在黏蛋 花生凝集素是组织化学中用于检测 抗原的。 T抗原在黏蛋 抗原的 白中广泛存在（如血型糖蛋白A） 可广泛结合于存在O-连接 白中广泛存在（如血型糖蛋白 ） 可广泛结合于存在 连接 糖链的T抗原上 糖链的 抗原上
5 糖基化蛋白的检测技术
1 荧光染色检测法 丹磺酰肼 检测聚丙烯酰胺凝胶中的糖蛋白 绿色荧光蛋白 即 Pro-Q Emerald 300 染色剂 SYPRO Rubby Pro-Q Emerald 488
蛋白质糖基化研究的基本目标是： 蛋白质糖基化研究的基本目标是：
基因组信息
寻找编码糖蛋白的基因
糖基化位点信息
寻找糖基化位点
结构信息
解析糖链及糖基化肽段的结构
功能信息
研究糖基化的功能
现代分子生物学的中心法则：
蛋白质的糖基化在生物体是广泛存在的。 真核细胞中，有一半以上的蛋白质被糖基化
糖链的多样性和复杂性
谢
谢
主要参考文献
1 夏其昌 曾嵘等 蛋白质化学与蛋白质组学 科学出版社 2004 2 Hirabayashi J ,etc JCB 2002,771(1-2):67-87 3 Hirabayashi J ,etc Trends Glycosci Glyco ,2000,20(6):286-287 4 Courtenay Hart etc Electrophoresis 2003, 24, 588–598 5 Cristian I. Ruse etc Anal. Chem.2002, 74,1658-1664 6 STEVEN A etc Protein Science (1993), 2, 183-196. 7 Benjamin L. etc Anal. Chem.2002, 74,6088-6097 8 Wei Li,etc Anal. Chem.2002, 74,5701-5710 9 Rong Zeng,etc Eur. J. Biochem. 266, 352-358 (1999) 10 Pauline M.etc Proteomics 2001, 1, 285–294 11Schulz BL etc Anal Chem,2002,74:6088-6097 12Robbe C, etc Biochem J 2004 Dec1 ; 384：307-16 13Suzuki ,etc, Anal Chem, 2006 Apr 1;78(7):2239-2243 14Sparbier K，etc J Biomol Tech. 2005 Dec;16(4):407-13 15Fukui etc, Nat Biotechol,2002,20:1011-1077
Mana1-6(Mana1-3)Manβ Mana1-2Mana1-6 (Mana1-3)Manβ 较强 最强
缺少三甘露糖核心结构或含有阻碍性的3-OH， 较弱 6-OH取代基团的Mana（α1-6）
Galectin LEC-6
半乳糖苷结合凝集素是一类分布广泛，不依赖于金属离子的 可溶性凝集素 很多生物具有保守性 倾向于结合包含半乳糖且 具有分枝结构的N-连接糖链