基因的转移与重组体的筛选和鉴定_百替生物

第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定

第一节转化

基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。

一、重组DNA分子转入原核生物细胞

1.重组质粒DNA分子转化大肠杆菌

转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。

转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。

（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染

A、制备感受态细胞

受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100mmol／L）溶液处理后变成。

所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。

转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；

转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；

好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。

B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：

①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；

②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。

③加入适量DNA，于42℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；

④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；

⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。

⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。

（2）电穿孔转化法

基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。

受体细胞的准备：当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用10%甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3×1010个／ml，分装，在干冰上速冻后置于-70℃贮存。每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达6个月以上。

（3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌

原理：是基于非接合型质粒的迁移作用（mobilization）而建立的一种DNA转化方式。首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株，即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，故称三亲本杂交接合转化法。

尤其适用于那些难以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法等进行重组质粒DNA分子直接转化的受体菌。

（4）转化率的计算及其影响因素

转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率

有两种表示方式：

A：以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示

B：以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。

以用于转化处理的受体细胞数为基数来计算转化率

A：通过菌液OD值测定或细菌计数，计算出用于制备感受态细胞的受体菌总数。

B：计算转化子与受体菌的比率。

用于制备感受体细胞的菌液每毫升有5×107个菌体，则4ml菌液有2×108个菌体，由此菌液制备成感受态细胞，通过转化处理，获得1000个转化子，则转化率是103／（2×108）＝5×10-6。其含义是每个受体菌细胞被转化的概率是5×10-6，或者说，要得到一个转化子，需要2×105个受体菌细胞。

每单位质量的DNA分子获得的转化子数来表示

单位通常是转化子数每μg DNA分子，如每μg重组DNA分子获得106个转化子，则转化率为106个/μg DNA分子。

影响转化率的因素：

分子量

载体类型及构型

重组DNA分子的浓度与纯度

受体细胞

2.重组λ噬菌体DNA子转导大肠杆菌

转导（transduction）是指通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。λDNA与外壳蛋白结合成噬菌体颗粒，才有转导宿主大肠杆菌的能力。因此重组的λDNA必须进行体外包装。所谓体外包装，是指在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组λ噬菌体DNA分子包裴为成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒的技术。

在实验方法上，体外包装包括两个方面：（1）包装抽提物的制备；（2）体外包装过程。

二、重组DNA分子转入真核细胞

1.根癌农杆菌Ti质粒介导法

农杆菌介导的Ti质粒载体转化法是目前研究最多、机制最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。迄今为止约8096的转基因植株都是利用农杆菌介导转化系统获得的。

农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，而对绝大多数单子叶植物无侵染能力。植物受伤后，伤口处细胞分泌大量的酚类化合物，如乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮（OH－As），它们是农杆菌识别敏感植物的信号分子。具有趋化性的农杆菌移向这些细胞，并将其Ti质粒上的T－DNA的转移至细胞内部。根据这一性质，将待转移的目的基因组入Ti质粒载体，通过农杆菌介导进人植物细胞，与染色体DNA整合，得以稳定维持或表达。

步骤：（1）外植体选择与预培养；（2）接种活化的农杆菌工程菌；（3）共培养；（4）选择培养；（5）转化植株再生

2.高压电穿孔法

利用脉冲电场将DNA导入受体细胞的方法叫做高压电穿孔法。利用这种方法，可以将DNA导入动、植物及细菌细胞。具有简单方便、对细胞毒性低以及转化效率高等优点。

（1）标准的操作程序——将高浓度的含有克隆基因的质粒DNA加到原生质体的悬浮液中，然后置于200～600V／cm的电场下进行电脉冲刺激。经过如此电穿孔处理的原生质体在组织培养基中培养1～2星期之后，选择已经捕获了转化DNA的细胞，作进一步的继续培养，以便获得再生植株。