基因的转移与重组体的筛选和鉴定_百替生物
重组体的筛选方法
重组体的筛选方法重组体是一种重要的生物技术手段，它可以用于改良微生物、植物和动物的基因组，从而实现对目标基因的精准编辑和调控。
在进行重组体的筛选过程中，选择合适的筛选方法对于提高筛选效率和准确性具有重要意义。
本文将介绍几种常见的重组体筛选方法，帮助读者更好地理解和应用这一技术。
1. 抗生素筛选法。
抗生素筛选法是重组体筛选中最常用的方法之一。
通过将目标基因与抗生素抗性基因连接在一起，然后转化至宿主细胞中，能够通过对抗生素的耐受性来筛选出含有目标基因的重组体细胞。
这种方法简单易行，且操作方便，适用于微生物和植物等生物体的筛选。
2. 标记基因筛选法。
标记基因筛选法是利用标记基因与目标基因共转化至宿主细胞中，通过标记基因的表达情况来筛选出含有目标基因的重组体细胞。
常用的标记基因包括荧光标记基因、抗性标记基因等，通过检测标记基因的表达情况，可以快速准确地筛选出目标基因的重组体细胞。
3. PCR筛选法。
PCR筛选法是利用聚合酶链式反应（PCR）技术来筛选重组体。
通过设计特定的引物，可以扩增出含有目标基因的DNA片段，从而实现对重组体的筛选。
PCR筛选法具有高灵敏度和高特异性的优点，能够准确地检测出目标基因的存在，是一种常用的重组体筛选方法。
4. 免疫筛选法。
免疫筛选法是利用抗体对目标蛋白的特异性识别来筛选重组体。
通过将目标蛋白与标记蛋白连接在一起，然后转化至宿主细胞中，利用抗体对标记蛋白的特异性识别来筛选出含有目标蛋白的重组体细胞。
这种方法对于筛选蛋白重组体具有重要意义，能够快速准确地筛选出目标蛋白的重组体细胞。
5. 酶标记筛选法。
酶标记筛选法是利用酶标记技术来筛选重组体。
通过将目标基因与酶标记基因连接在一起，然后转化至宿主细胞中，利用酶标记基因的表达情况来筛选出含有目标基因的重组体细胞。
这种方法操作简便，能够快速准确地筛选出目标基因的重组体细胞。
总结。
重组体的筛选方法多种多样，每种方法都有其特点和适用范围。
抗菌肽百替生物
service@
投稿附例
抗菌肽MSI-78基因在大肠杆菌DH5α中的克隆及阳性重组体的鉴定
耿哲，韩跃武，王雪琴
兰州医学院生物化学与分子生物学教研室，甘肃兰州 730000 Email ：
目的：研究抗菌肽MSI-78基因的克隆及鉴定的方法,为进一步进行抗菌肽MSI-78的表达及抗菌活性的研究奠定了基础。
方法：1．根据MSI-78的氨基酸序列及大肠杆菌偏爱密码子，推出MSI-78编码基因的序列,并在MSI-78基因的两侧分别加上了EcoRⅠ和PstⅠ的限制酶特别识别序列，设计出目的基因。
通过化学合成方法，获得含EcoRⅠ和PstⅠ识别序列的MSI-78基因。
2．将含EcoRⅠ和PstⅠ粘性末端的MSI-78基因与用EcoRⅠ和PstⅠ消化后的pUC18载体连接并转化大肠杆菌DH5α。
3．通过氨苄青霉素、α-互补LB 平板筛选出阳性重组菌，并通过单酶切、双酶切、PCR 扩增及基因测序方法鉴定阳性重组体。
结果：
1． 根据MSI-78的氨基酸序列、大肠杆菌偏爱密码子以及MSI-78基因的两侧设计的EcoRⅠ和PstⅠ的识
别序列，通过化学方法合成方法，得到了含EcoRⅠ和PstⅠ粘性末端的蛙皮素突变基因，即MSI-78基因。
2．将含EcoRⅠ和PstⅠ识别序列的MSI-78基因与用EcoRⅠ和PstⅠ消化后的pUC18载体连接并转化大肠杆菌DH5α。
3．通过氨苄青霉素、α-互补LB 平板筛选出了阳性重组菌，并通过单酶切、双酶切、PCR 扩增及基因测序鉴定阳性重组体。
结论：MSI-78的克隆为后期抗菌肽MSI-78的表达、纯化及生物活性研究奠定了基础。
转基因的筛选与鉴定定义
转基因的筛选与鉴定定义转基因的筛选与鉴定呀，这就像是在一群特别的小伙伴里找到真正有超能力的那几个。
咱先说说转基因是怎么回事儿。
转基因就好比是给植物或者动物做了个特殊的改造，把一些我们想要的基因塞进去，就像给一个普通的小机器人安装了超级厉害的新零件一样。
那这时候呢，怎么知道哪些真的被改造成功了呢？这就需要筛选和鉴定啦。
筛选这个事儿啊，有点像在一堆混在一起的宝石里面找特定的宝石。
比如说，我们把带有特殊基因的细胞和一大堆普通细胞放在一起培养。
那些成功接受了转基因的细胞呢，可能会有一些特殊的表现。
就像在一群白色的花里，我们把一些能让花变红的基因转进去，那可能会变红的花苗就是我们初步要筛选出来的。
这个过程就像是一场特别的寻宝游戏，我们要根据一些小线索来找出那些可能被转基因成功的个体。
那鉴定呢？这可就更精细啦。
这就好比是我们找到那些可能是红宝石的石头后，要确定它到底是不是真的红宝石，有多纯。
鉴定转基因就是要确定那个基因是不是真的在新的生物体里好好地待着，有没有发挥作用。
我们可以用很多方法。
比如说，有一种方法就像看基因的身份证一样。
每个基因都有它独特的序列，就像每个人有独特的身份证号。
我们通过检测这个序列，就能知道是不是我们转进去的那个基因。
还有一种方法呢，就像是看这个基因有没有在新的家里开始工作。
如果这个基因是能让植物抗虫的，那我们就看看这个植物是不是真的不怕虫子咬啦。
这就像我们给一个人一个特殊的能力，然后看他有没有在需要的时候施展出来。
咱举个例子吧。
比如说转基因棉花，我们想让它抗虫。
我们把抗虫的基因转进去之后，先筛选的时候，可能会发现有些棉花苗长得特别壮，虫子也不怎么爱靠近。
这时候我们可不能就确定它们就是转基因成功的呀。
我们得进行鉴定。
我们把棉花的细胞拿出来，检测里面有没有那个抗虫基因的独特序列，如果有，再看看这个基因是不是真的在棉花里产生了那种能杀死虫子的东西。
这就像我们请了一个保镖，先看到他长得高高大大的像个保镖的样子，然后还要看看他有没有真本事，能不能保护我们。
重组体筛选和鉴定PPT课件
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
基因的转移与重组体的筛选和鉴定_百替生物
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。
只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。
在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。
一、重组DNA分子转入原核生物细胞1.重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。
（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染A、制备感受态细胞受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100mmol／L）溶液处理后变成。
所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。
转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。
B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。
③加入适量DNA，于42℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。
⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。
（2）电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。
实验七 重组载体转化大肠杆菌_百替生物
实验七重组载体转化大肠杆菌实验目的]][实验目的将质粒DNA转化到大肠杆菌中。
[实验原理实验原理]]蓝白筛选常用在重组子和非重组子的初步筛选中，它是通过载体和宿主菌之间基因内互补来实现。
许多载体（如pUC,pBS等）都是带有包括乳糖操纵子的调控序列和编码β-半乳糖苷酶前146个氨基酸的基因序列。
并在编码区中构建了多克隆位点，它不破坏读框，可使几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶基因的氨基端，而不影响功能。
若有外源基因插入多克隆位点则破坏编码读框产生没活性的α肽段。
宿主菌为缺失产生α肽段的突变体，但能产生其余肽段。
两者之间进行基因内互补就产生有活性的β-半乳糖苷酶基因。
β-半乳糖苷酶基因在IPTG的诱导下产生肽段与宿主菌其余肽段结合成有活性的β-半乳糖苷酶。
此酶能使显色底物X-gal分解成蓝色化合物，从而使菌落发蓝。
若有外源片段插入载体的多克隆位点，则使β-半乳糖苷酶基因失活，不能产生α肽，形成白色菌落。
利用此方法仅通过目测就轻而一举地筛选出重组菌落。
实验试剂]][实验试剂LB液体培养基（配1L），分装成10瓶，每瓶100mLLB固体培养基（配1L），（50ml分装一瓶，高压灭菌）氨苄抗生素10mg/ml（过滤除菌）IPTG200mg/ml（在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。
）X-Gal（溶解200mg的X－gal于10ml的二甲基甲酰胺（DMF），用铝箔包裹装液管，贮存于-20℃。
），实验耗材]]Eppendorf管，大小枪头，培养皿，涂布棒[实验耗材实验器材]][实验器材摇床，离心机、水浴锅，微量移液器，实验步骤]][实验步骤（1）冻存于－80℃的感受态细胞置冰上溶化，将连接产物加入溶化后的感受态细胞中，冰浴40min，（2）42℃热激90s，不要摇动试管，立即移至冰上放置2min。
（3）加入400µl LB液体培养基，37℃100rpm恢复培养1h后，将细菌铺布于含ampicilin（终浓度100mg/L）/IPTG(4uL)/X-Gal(40uL)的LB固体培养基上，在37℃培养过夜。
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定解析
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3. 学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4. 掌握利用Cacl2感受态细胞的方法。
5. 学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6. 掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
7. 学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1. 重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
目的基因的遗传转化_百替生物
实验十目的基因的遗传转化一、目的基因的表达载体构建1.实验目的本实验以强化植物基因工程平台技能训练为目的，涵盖PCR分离克隆全长目的基因、Gateway技术构建目的基因的表达载体、农杆菌介导目的基因的转化、转基因植株的驯化和移栽等系列实验。
此外，还就如何利用新型的反向遗传学技术RNAi（RNA interfere，RNA干涉）进行基因功能研究进行试验指导。
为从事相关领域的科学研究奠定基础。
通过本实验，要求学生理解和掌握Gateway技术构建目的基因的表达载体的基本原理和具体实验步骤。
2.实验原理利用高保真聚合酶，采用PCR方法在克隆基因两侧引入attB重组位点，然后将含有attB位点的PCR产物与含有attp位点和Gateway BP Clonase混合，之后转化E.coli。
在两对att位点之间的位点特异性重组过程中产生一个融合载体，融合载体随即分解成两个分子，重组位点在结构上重新分配，目标基因进入新的载体骨架，通过筛选阳性克隆，获得此重组产物，称为“entry克隆”。
在得到的entry 克隆中目标基因位于att重组位点之间。
将此重组产物与选定的Gateway载体和Gateway LR Clonase 酶混合，在entry克隆中的attL位点间的序列取代表达（目标）载体的attR位点之间的序列即目标基因进入表达载体，形成表达（目标）克隆（图）。
Gateway技术构建植物表达载体原理3.仪器设备微量取液器、制冰机、微型离心机、PCR仪、凝胶成像系统、毛细管自动测序仪、电子天平、高速冷冻离心机、振荡器、恒温金属浴、干燥箱、紫外分光光度计、电泳仪、-80℃冰箱、-20℃冰箱等。
4.实验试剂克隆全长基因，pDONR TM221载体（Invitrogen，12535-019），目标载体（购自Invitrogen，类型可选）。
（1）核酸和质粒提取试剂，测序试剂，T-vector，DNA片段回收试剂盒，Taq聚合酶，反转录试剂盒，DNA marker，氨苄青霉素，X-gal，IPTG等试剂的配方和购买公司见模块一中相应章节。
基因工程学实验3、重组体的转化和筛选2006
四川农业大学基因工程学实验课程请同学们严格注意实验室相关规则并相互提醒实验三实验三、、重组重组体体的转化和转化和筛选筛选一、实验目的实验目的：：体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒，选用转化和筛选技术，可获得含重组的阳性克隆。
在此阳性克隆中，DNA 可在生物体系中大量扩增，繁殖，保存以及表达目的基因的产物，这是PCR 体外扩增DNA 所不能替代的。
配合DNA 重组技术，所获得的，不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。
本实验的目的是熟悉重组体转化的方法和筛选的方法。
二、准备材料准备材料：：1、 转化管2、 Amp （50ug/ml ）和X-gal （40ug/ml ）的LB 琼脂平板三、操作方法操作方法：：（一） 转化转化方法方法方法：：1、 取实验一制备的感受态大肠杆菌细胞100ul ，加入上述实验二的连接实验组的重组质粒5ul ，缓慢加入并且边加边搅拌，置于冰浴30min 。
（对照组只加入2ul ） 2、 在42℃下2min ，使转化的菌株成为稳定态。
3、 加入0.9ml 的LB 肉汤，振荡培养1h 。
4、 在每1个含有Amp （50ug/ml ）和X-gal （40ug/ml ）的LB 琼脂平板上加入100ul 转化菌液，涂布均匀。
5、 将平板置于37℃的培养箱中，24h 后观察结果。
（二） 重组质粒的筛选重组质粒的筛选：：1、 选取白色菌落为重组菌落。
2、 其他鉴定方法。
备注备注：：如PUC18有含有一个大肠杆菌DNA 的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ ）的调控序列和头146个氨基酸偏码区。
这个偏码区中插入一个多克隆位点。
受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。
当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal ）培养基中形成兰色菌落。
而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ 基因不表达而形成白色菌斑。
实验17-重组体筛选与鉴定
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
三 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
只有带有插入片断的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
Southern blot 筛选 结果
（1）原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
（2）R-环检测法
1）原理： DNA-RNA杂交。
2）选择过程
用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇 培养至OD600值达到0.5-0.6之间
3. 取50ml菌液置于离心管内，4 ℃ 4500g离心5分钟
4. 加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴 30分钟
5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷 CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬
重组体的筛选和鉴定
二、利用插入序列提供的表型特征筛选
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。 一、原理： 1.弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。 受体菌： his外源基因： his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
GFP 老鼠
GFP- Kac的狗
GFP Alba 發青綠光 芒的 兔子
①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、卡 那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动 植物转化子的选择标记基因。 ②潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）赋予转化子能抗 潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物 转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）也被用于筛选动 植物转化子的标记基因。
PstI酶切
外源DNA 黏性末端 连接酶 PstI酶切
pBR322 4363
重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr) 插入子(ampstets)
导 入
黏性末端
重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子(amprtetr)
影印在含Ap的平板上
涂布在含Tc的平板上
野生型的E.coli (ampstets)
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。 主要检测插入片 断是否被转录。 从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
Northern Blotting
Western Blotting
Southern和Western印迹法
32P-labled
重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定
a类筛选
• 基本原理 • 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为重组质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，转 化受体菌后能使后者在含有相应选择药物的选择培养基上 生长，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活。
a类筛选的实验方法
• LB固体培养基中加入千分之一的抗性药物，再倒平板； • 将转化后的菌液均匀涂布在平板上； • 放在37℃培养箱培养12~16小时； • 观察菌落生长情况。
RNA水平
蛋白质水平
免疫化学检测法（放射性抗体检测法、 免疫沉淀检测法） Westhern印迹杂交法
重点介绍的筛选方法
抗药性筛选 遗传表型直接选择法 a互补 快速裂解菌落鉴定分子大小 限制性内切酶酶切法 间接选择法 PCR方法筛选鉴定重组子 菌落杂交筛选
遗传学表型筛选的方法之一——抗药性筛选
• 基本原理 • 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，与目的 基因重组后，转入受体菌，能使受体菌带有相应抗药性， 另一种情况是虽然质粒中原来有相应抗性，但插入外源片 段后重组质粒失去抗药性，据此我们也可以进行抗药性筛 选。
蓝白斑筛选
X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)，IPTG (异丙基硫代-β-D-半乳糖苷) X-gal被没分解后的产物为5-溴-4-氯-靛蓝
无质粒的 受体菌
b-半乳糖苷酶 部分缺失，不 能分解Xgal； 无抗菌素抗性 b-半乳糖苷酶 的缺失被载体 产物a互补，能 分解Xgal。且 有抗菌素抗性 载体产物失活， 不能互补b-半乳 糖苷酶的缺失。 不能分解Xgal， 但有抗菌素抗性
直接筛选法
• 直接筛选法是借助遗传学表型来进行筛选的方法。 • 重组子转化宿主细胞后，载体上的一些筛选标志基因表 达，会导致宿主的某些表型的改变，通过琼脂平板中添加 相应筛选物质，可以直接筛选含重组子的菌落。如果质粒 上有两种抗性，因为外源基因的插入，导致其中一个不 能 表达，那么也可以通过抗药性将重组子筛选出来。
重组体的筛选方法
重组体的筛选方法重组体是指通过基因工程技术将不同的DNA片段重新组合形成的新的DNA分子。
重组体的筛选方法是指通过一系列的实验步骤，筛选出具有所需特性的重组体，以便进一步应用于基因工程、生物技术等领域。
下面将介绍几种常见的重组体筛选方法。
首先，常用的重组体筛选方法之一是抗生素筛选法。
在进行重组体构建时，通常会将目标基因与抗生素抗性基因连接在一起，形成重组质粒。
然后将重组质粒导入宿主细胞中，通过培养含有相应抗生素的培养基，只有携带了重组质粒的细胞才能在含有抗生素的培养基中存活下来，从而实现对重组体的筛选。
其次，还有一种常见的重组体筛选方法是色素筛选法。
这种方法通常用于真核细胞中重组体的筛选。
通过将目标基因与荧光蛋白等标记基因连接在一起，形成重组质粒。
然后将重组质粒导入宿主细胞中，通过观察细胞的荧光表达情况，来筛选出携带了重组质粒的细胞，从而实现对重组体的筛选。
另外，还有一种常见的重组体筛选方法是筛选标记法。
这种方法通常用于原核细胞中重组体的筛选。
通过在重组质粒中引入特定的筛选标记基因，例如β-半乳糖苷酶等，在含有相应底物的培养基中，只有携带了重组质粒的细胞才能表达出特定的酶活性，从而实现对重组体的筛选。
最后，还有一种常见的重组体筛选方法是PCR筛选法。
通过设计特定的引物，可以在PCR扩增反应中筛选出含有目标基因的重组体。
这种方法通常用于对大量重组体进行快速筛选，可以高效地筛选出所需的重组体。
总之，重组体的筛选方法多种多样，可以根据具体的实验要求选择合适的筛选方法。
通过合理地设计实验方案，可以高效地筛选出具有所需特性的重组体，为基因工程技术的应用提供有力支持。
基因的转移与重组体的筛选和鉴定
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。
只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。
在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。
一、重组DNA分子转入原核生物细胞1. 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。
（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染A、制备感受态细胞受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100 mmol／L）溶液处理后变成。
所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。
转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。
B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。
③加入适量DNA，于42 ℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37 ℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。
⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。
（2）电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。
第七章基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
二、转译筛选 载体+外源DNA 转录
mRNA 无细胞翻译系统 翻译 35S标记的肽链
35S标记的 甲硫氨酸
PAGE电泳
与预期的产物 分子量相符？
比较放射性 带纹的位置
放射自显影
三、杂交抑制转译法
1. 原理 mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链 后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被 抑制）。
核糖体 小亚基
核糖体单链mRNA 大亚基
能翻译
mRNA DNA
核糖体 小亚基
核糖体 大亚基
不能翻译
2. 过程
四、杂交释放转译法
1. 原理：
在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA 与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释 放出与它对应的mRNA，进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基 因产物（如分子量、免疫源性等）。
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
A
A
T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
插入片段
三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片段。 2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片段引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
2. 过程
凝胶放射自显影
硝酸纤 载体和插 维素滤膜 入的cDNA
总mRNA
杂交
硝酸纤 载体和插 cDNA基因的 维素滤膜 入的cDNA mRNA
洗脱
cDNA编 码的蛋白
电泳
cDNA编 码的蛋白
硝酸纤 载体和插 维素滤膜 入的cDNA
cDNA基因的
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第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。
只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。
在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。
一、重组DNA分子转入原核生物细胞1.重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。
（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染A、制备感受态细胞受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100mmol／L）溶液处理后变成。
所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。
转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。
B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。
③加入适量DNA，于42℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。
⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。
（2）电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。
受体细胞的准备：当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用10%甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3×1010个／ml，分装，在干冰上速冻后置于-70℃贮存。
每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达6个月以上。
（3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌原理：是基于非接合型质粒的迁移作用（mobilization）而建立的一种DNA转化方式。
首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。
整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株，即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，故称三亲本杂交接合转化法。
尤其适用于那些难以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法等进行重组质粒DNA分子直接转化的受体菌。
（4）转化率的计算及其影响因素转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率有两种表示方式：A：以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示B：以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。
以用于转化处理的受体细胞数为基数来计算转化率A：通过菌液OD值测定或细菌计数，计算出用于制备感受态细胞的受体菌总数。
B：计算转化子与受体菌的比率。
用于制备感受体细胞的菌液每毫升有5×107个菌体，则4ml菌液有2×108个菌体，由此菌液制备成感受态细胞，通过转化处理，获得1000个转化子，则转化率是103／（2×108）＝5×10-6。
其含义是每个受体菌细胞被转化的概率是5×10-6，或者说，要得到一个转化子，需要2×105个受体菌细胞。
每单位质量的DNA分子获得的转化子数来表示单位通常是转化子数每μg DNA分子，如每μg重组DNA分子获得106个转化子，则转化率为106个/μg DNA分子。
影响转化率的因素：分子量载体类型及构型重组DNA分子的浓度与纯度受体细胞2.重组λ噬菌体DNA子转导大肠杆菌转导（transduction）是指通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。
λDNA与外壳蛋白结合成噬菌体颗粒，才有转导宿主大肠杆菌的能力。
因此重组的λDNA必须进行体外包装。
所谓体外包装，是指在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组λ噬菌体DNA分子包裴为成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒的技术。
在实验方法上，体外包装包括两个方面：（1）包装抽提物的制备；（2）体外包装过程。
二、重组DNA分子转入真核细胞1.根癌农杆菌Ti质粒介导法农杆菌介导的Ti质粒载体转化法是目前研究最多、机制最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。
迄今为止约8096的转基因植株都是利用农杆菌介导转化系统获得的。
农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，而对绝大多数单子叶植物无侵染能力。
植物受伤后，伤口处细胞分泌大量的酚类化合物，如乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮（OH－As），它们是农杆菌识别敏感植物的信号分子。
具有趋化性的农杆菌移向这些细胞，并将其Ti质粒上的T－DNA的转移至细胞内部。
根据这一性质，将待转移的目的基因组入Ti质粒载体，通过农杆菌介导进人植物细胞，与染色体DNA整合，得以稳定维持或表达。
步骤：（1）外植体选择与预培养；（2）接种活化的农杆菌工程菌；（3）共培养；（4）选择培养；（5）转化植株再生2.高压电穿孔法利用脉冲电场将DNA导入受体细胞的方法叫做高压电穿孔法。
利用这种方法，可以将DNA导入动、植物及细菌细胞。
具有简单方便、对细胞毒性低以及转化效率高等优点。
（1）标准的操作程序——将高浓度的含有克隆基因的质粒DNA加到原生质体的悬浮液中，然后置于200～600V／cm的电场下进行电脉冲刺激。
经过如此电穿孔处理的原生质体在组织培养基中培养1～2星期之后，选择已经捕获了转化DNA的细胞，作进一步的继续培养，以便获得再生植株。
应用这种方法已成功地转化了玉米和水稻的原生质体，其转化效率在0．1％～1．0％之间。
（2）影响电穿孔导入DNA效率的因素：①外加电场的强度：250～750V／cm较宜；②电脉冲的时间：20～100ms；③工作温度：对不同类型细胞所要求的条件不同，可以在0℃至室温（25℃）之间进行选择；④DNA的构象和浓度：线性DNA比环状DNA要好，浓度控制在1～40μg／mL。
⑤工作缓冲液的离子成分：也对其DNA导入效率发生作用，一般用盐溶液悬浮细胞要比用非离子溶液更易DNA的导入。
3.聚乙二醇介导的原生质体转化法这种方法常用于转化酵母细胞以及其他真菌细胞。
活跃生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶处理变成球形体后，在适当浓度的聚乙二醇6000（PEG－6000）的介导下，将外源DNA转化入受体细胞中。
4.磷酸钙或DEAE一葡聚糖介导的转染这是将外源基因导入哺乳类细胞中进行瞬时表达的常规方法。
将被转染的DNA同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后通过内吞作用进入受体细胞。
对于DEAE-葡聚糖作用的机理尚不清楚，可能是其与DNA结合从而抑制核酸酶的作用或与细胞结合从而促进DNA的内吞作用。
5.原生质体融合通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体同培养的哺乳细胞直接融合。
经过细胞膜融合，细菌内容物转入动物细胞质中，质粒DNA被转移到细胞核中。
6.脂质体法将DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜融合将基因导入。
脂质体是由磷脂组成的膜状结构，用它包装外源DNA分子，然后与植物原生质体共保温。
于是脂质体与原生质体膜结构之间发生相互作用，尔后通过细胞的内吞作用而将外源DNA高效地纳入植物的原生质体。
这种方法具有多方面的优点，包括可保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了对细胞的毒性效应，适用的植物种类广泛，重复性高，包装在脂质体内的DNA可稳定地贮藏等。
用此法转化水稻原生质体的效率可达14％，并得到了转基因的再生植株。
7.显微注射法借助显微镜将外源DNA直接注射到受体细胞的方法。
适用于此种方法的植物样品包括原生质体、游离的细胞，以及诸如愈伤组织、分生组织和胚胎组织等多细胞结构。
在显微注射的实际操作中，受体细胞或组织是被固定在褐藻酸钠或琼脂糖等特定载体上，然后通过显微操作器，将转化的外源DNA直接注射到受体细胞核中去。
由于一些重要的禾本科粮食作物均为单子叶的，在原生质体再生和Ti质粒的转化方面都存在着相当的困难，所以对此类植物来说，DNA的直接注射法具有特别重要的实用价值。
本法的一个突出优点是转化频率高，可达60％以上，但操作困难，需要经过特殊训练的专门技术人员才能迸行。
8.颗粒轰击（particle bombardment）技术颗粒轰击技术是将基因转移到细胞或组织中去的通用方法，也就是平常所说的用基因枪实现基因转移的方法。
将DNA包被在金或钨的微粒中，然后用基因枪将DNA包被的颗粒直接转移到原位组织、细胞乃至细胞器中去。
这一技术目前广泛用于植物基因工程、基因治疗以及基因（DNA）免疫等研究。
生物弹击法的操作对象可以是完整的细胞或组织，突破了基因转移的物种界限，也不必制备原生质体，实验步骤比较简单易行，具有相当广泛的应用范围，已经成为研究植物细胞转化和培养转基因植物的最有效的手段之一。
第二节基因重组将目的基因插入载体的过程，即基因重组（gene recombination)，其基本过程包括：首先在目的目的基因和载体两端造成切口，然后依赖于双链DNA粘性末端单链序列的互补结合和DNA连接酶将切口补上。
这一步的实质就是将两种DNA在体外进行酶促连接，最终获得一个重组子。
一般连接反应中外源DNA与载体的比例采用3：1，4：1或5：1。
不同来源、性质的外源片段采用的连接方式不同。
常采用的连接方法有：粘末端连接、平端连接法、人工接头法和同聚物接尾法。
一、粘末端连接1.全同源粘性末端连接如果目的序列与载体两端具有相同的限制内切酶位点，则同一限制性核酸内切酶酶切后在目的基因与载体两端产生完全相同的粘性末端，在降低温度退火时，能重新互补结合，在DNA连接酶催化下，目的序列与载体DNA连接，实现基因重组，称为全同源粘性末端连接。
另外，不同的限制性内切酶，如果产生的粘性末端相同，也同样用此方法连接。
该连接方法的优缺点为：优点：该方法是最方便的克隆方法，其连接效率高，一般采用低浓度酶在低于16度，高浓度ATP的情况下进行连接。
缺点：容易出现载体自身环化、双向插入（即目的基因以两种方向插入载体和多拷贝插入的现象，从而在转化后出现高背景，使得筛选更为困难。