核酸的定量测定
高中生物 实验五、核酸定量测定
设波长，置空白，调零，置“吸光度”，读出样品吸光度 ↓
重复上步读出各标准溶液吸光度 ↓
以各样品中已知含量及读得吸光度绘制坐标图，并画出相关 最佳的曲线
↓ 读未知样品的吸光度，在曲线表上找出对应浓度
标准曲线的制作 表5-1
试管
1
标准DNA溶液（mL） 0
蒸馏水（mL）
5
DNA浓度(ug/ml) 0
A260
0
2 3 4 5 67 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2 4
混匀后以1号试管为空白在260nm处测定光吸收值A，以标准DNA 溶液的浓度为横坐标、A为纵坐标在坐标纸上绘制出标准曲线，
它是一条直线。
2、核酸最大紫外吸收波长（λｍ）的确定：
以上5-1表中的７号试管为测定对象，以1号试管 为空白，在240～290nm范围内每隔10nm分别 测定光吸收值A。注意，每次换了波长之后都需 要用空白重新调校“0％T”和 “100％T”。以A 为纵坐标、λ（nm）为横坐标作一条平滑曲线， 找出最高峰处所对应的波长λｍ。
3、样品测定
取一支试管，编号8，加入6mL左右待测的DNA 溶液，仍以1号试管为空白，分别在260nm和 280nm处测定其光吸收A，用A260在标准曲线上 查出DNA溶液浓度C1
根据公式计算出待测DNA溶液的浓度C2 （g/mL）。
根据A260/A280的值来判断该待测的DNA样品是否 纯净。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
如果已知待测的核酸样品不含酸溶性 核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将 样品配制成一定浓度的溶液(20～ 50ug/mL)，在紫外分光光度计上直接测定。
核酸定量测定实验报告
一、实验目的1. 掌握核酸定量测定的原理和方法。
2. 熟悉紫外分光光度法和定磷法在核酸定量中的应用。
3. 提高实验操作技能，培养科学思维和实验数据分析能力。
二、实验原理核酸（DNA和RNA）是生物体内重要的生物大分子，其含量与生物体的生命活动密切相关。
核酸定量测定是生物学、医学和分子生物学等领域的重要研究手段。
1. 紫外分光光度法：核酸、核苷酸及其衍生物具有共轭双键系统，能吸收紫外光。
DNA和RNA在260 nm波长处的紫外吸收峰较强，可用于定量测定核酸含量。
2. 定磷法：核酸分子中含有一定比例的磷，DNA和RNA的含磷量分别为9.2%和9.0%。
通过测定核酸中磷的含量，可间接计算出核酸的量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：粗核酸、DNA标准品、RNA标准品、样品待测液、蒸馏水等。
2. 仪器：紫外分光光度计、电子天平、恒温水浴锅、移液器、试管、吸管等。
四、实验步骤1. 紫外分光光度法测定核酸含量（1）配制核酸标准溶液：准确称取一定量的DNA和RNA标准品，用蒸馏水配制成一定浓度的标准溶液。
（2）测定样品核酸含量：将样品待测液稀释至一定浓度，取适量样品溶液，在260 nm波长处测定其吸光度。
（3）绘制标准曲线：以DNA或RNA标准溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（4）计算样品核酸含量：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得相应的核酸浓度，计算样品中核酸的量。
2. 定磷法测定核酸含量（1）配制标准磷溶液：准确称取一定量的磷酸二氢钾，用蒸馏水配制成一定浓度的标准磷溶液。
（2）测定样品核酸中磷含量：将样品待测液加入强酸，使核酸分子中的有机磷转化为无机磷，与钼酸铵反应生成磷钼酸铵。
在还原剂存在下，磷钼酸铵被还原生成钼蓝，用分光光度法测定其在660 nm处的吸光度。
（3）绘制标准曲线：以标准磷溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（4）计算样品核酸含量：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得相应的磷浓度，乘以核酸的含磷量，计算样品中核酸的量。
核酸含量测定
定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL
04
标准磷溶液：含磷量为10 μg/mL，每组用干试管取15用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；
02
制定定磷标准曲线；
03
测定回收率和样品总磷量。
实验步骤
1. 样品消化（每两组或三组做一份）
回收率的意义；
实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的酸度对测定结果的影响。
01
02
思考题
将试管洗净，斜插在试管架上，放在台面上。
将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。
将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿中。
将实验台面擦干净。
实验结束
消化管
1
2
3
RNA/mL
0
1
0
标准磷原液/mL
0
0
1
dH2O/mL
1
0
0
5mol/L H2SO4/mL
2
2
2
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
dH2O/mL
1
1
1
沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
用dH2O定容/mL
50
50
50
混匀
2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份） 每人取18支试管，按照下表平行操作：
以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画标准曲线，直线应过原点。
在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量(μg)。
数据处理
计算样品总磷量：
01
计算RNA量：
02
样品RNA含量：
03
计算回收率：
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定，不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
核酸定量方法及原理
核酸定量方法及原理广泛用于测定制备物中核酸含量的方法有两类。
如果样品较纯（即蛋白质、酚、琼脂糖以及其他核酸等杂质含量较低时），可通过分光光度法测定其吸收紫外线的量，既简便又准确。
若样品中DNA或RNA含量较低或含有较多杂质，则可以通过溴化乙锭或Hoechst 33258等荧光染料所发出的荧光估测核酸的含量。
DNA或RNA的分光光度法测定核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。
可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。
核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。
每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。
定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。
如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / mL的dsDNA，37μg / mL的ssDNA， 40μg/mL的RNA，30μg/ mL的寡核苷酸。
测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。
测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，而后测试空白液和样品液。
然而，实验并非一帆风顺。
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。
灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，对应吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。
另外，还需考虑核酸本身理化性质和溶解核酸缓冲液的pH 值、离子浓度等。
在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。
这些小颗粒的存在干扰测试效果。
为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。
在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。
从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
核酸定量的常用方法
核酸定量的常用方法、原理、优缺点等。
紫外分光光度法：利用核酸中的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，在紫外光的照射下在260nm处有最大吸收峰的原理对核酸进行定量和定性的方法。
是实验室内较为常用的方法。
优点：操作简单，设备要求低。
缺点：灵敏度不够高，只能测定总核酸量，不能区分核算种类；易受样品中其他杂质的干扰（如pH值、残留的提取剂等）。
荧光染料法：基于荧光染料与核酸分子结合，发出的荧光信号强度与结合的核酸分子数成正比的原理设计的。
常用的荧光染料有嗅化乙锭、SYBR系列染料等。
优点：灵敏度高，所需样品量少，可重复性高。
缺点：染料一般都含有较高毒性，检测结果受染料与核酸的结合率影响。
实时荧光定量PCR法：在反应体系内加入荧光基团，通过荧光基团发出荧光信号经积累来实时检测PCR的反应过程，最后通过相对定量或者绝对定量的方法对未知浓度的核酸进行定量分析。
常用的检测方法有TaqMan探针和荧光染料两种。
TaqMan探针法：利用Taqman酶在特异性引物上增加一条荧光双标记的探针，分别标记有荧光信号基团R和淬灭基团Q，当二者都存在的时候R基团受Q基团影响不发出荧光信号，而在PCR反应过程中，聚合酶将探针的碱基水解，R 与Q基团分离，R基团发出荧光信号，模板每扩增一次，就产生一次荧光信号，通过对荧光信号的检测和绘制荧光信号曲线，与标准曲线对比分析，可对核酸进行定量。
优点是特异性强，缺点是探针序列设计时需要强特异性，以及成本相对较高。
DNA结合荧光染料法：常用的荧光染料为SYBR Green Ⅰ，该技术通过在PCR 反应体系中加入过量的荧光染料，染料会特异性的与dsDNA结合并发出荧光信号，而未与dsDNA结合的不会发出荧光信号，在PCR过程中仪器通过检测荧光信号增强的曲线图，与标准品进行对比分析进行核酸定量。
优点是成本相对于Taqman探针法较低，可以做熔解曲线了解引物的Tm值，缺点是染料能与非特异性的dsDNA结合对实验结果产生干扰。
核酸的定量分析方法
光
分
析
DNA
法
AO-ST体系能 量发生荧光猝 灭
DNA浓度与荧光 猝灭强度呈线性 关系
检出限 2.6× 10-7mol/L
线性范围为 0～ 1.1× 10-6mol/L
1.DNA促进AO-ST间的荧光能量转移
下图表明ST的电子吸收光谱与AO的荧光发射光谱重叠。AO的荧
光在ST存在时明显地被淬灭，说明两者在水溶液中存在能量的转
准确、分析适应性广等特点。
DNA电化学生物传感器：基本原理
电
电压
ssDNA
化
（单链DNA）
学 法
杂交反应
电流
待测溶液
（样品中与之互补 的另一条DNA）
电导
样品中DNA的结构 和含量的测定
差分脉冲和方波伏安法研究亲和素-生物素固载ssDNA的生物传感器
Pt电极预 处理（抛光）
ssDNA在铂 电极表面的 固定化
核酸(DNA或RNA)在中性至碱性介质中由于核苷酸上磷酸基的离 解而能以有机 离子形式存在，因此能用某些碱性染料对其加以 测定。
定
以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化
磷
法
直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷
量。
定磷法简单、快速、灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响。
核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基
紫
都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm处有强烈
紫 外
RNA的质量浓度(mg/L)＝ A260nm 稀释倍数
吸
0.024 L
收
DNA的质量浓度（mg / L) A260nm 稀释倍数
核酸含量测定(精)
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为空白，660nm测定吸光值 A660(1) A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
8
3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行）
7（空白） 定容溶液/mL dH2O/mL 定磷试剂/mL A660(1) 1.5 0 1.5 8（样品） 1.5 0 1.5 9（标准） 0.15 1.35 1.5
3
还原产物钼蓝在波长660nm测定 吸光值，当无机磷含量在1—25μg 范围内，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为9.5%，即1μg RNA磷相当于10.5 μg RNA。DNA 的含磷量平均为9.9%。
4
试剂
酵母RNA样品溶液：2000μg/mL
标准磷原液：含磷量为1000 μg/mL 标准磷溶液：含磷量为10 μg/mL，每组用干试管取 15mL 定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果 变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL
核酸含量测定
定磷法
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω -羟 -γ -酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。
2
1 50 混匀
2
1 50
2
1 50
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
实验七 核酸的定量
成分测定
取200mg提取的核酸，加入3mol/L硫酸10ml，在沸 水浴中加热10min制成分解液并进行组分的鉴定。
1、嘌呤碱 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加 入约1ml 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的 银化合物沉淀。
2、核糖 取一支试管加入水解液1ml、三氯化铁浓 盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中 10min。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。
二、器材与试剂
1、试剂的配制 钼酸铵-过氯酸沉淀剂[0.25%钼酸按-2.5%过
氯酸溶液]：取3.6ml 70%过氯酸和0.25g钼酸 铵溶于96.4ml蒸馏水中。 样品DNA 2、器材 容量瓶（50ml）、离心管、离心机、紫外分 光光度计。
三、操作步骤
取两支1.0ml小离心管，甲管加入0.5ml样品 和 0.5ml 蒸 馏 水 ； 乙 管 加 入 0.5ml 样 品 和 0.5ml钼酸铵-过氯酸沉淀剂，摇匀，在冰浴 中放置15min，以3000r/min离心10min，分 别取上清液0.75ml在量筒中定容到25ml，备 用。
干扰因素
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能 吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm波长处，在260nm处的消光值仅为核 酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质 含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。 RNA的260nm与280nm消光值的比值在2.0以 上；DNA的260nm与280nm消光值的比值则 在1.8左右。当样品中蛋白质含量较高时比 值即下降。
2、二苯胺试剂为什么要溶于浓醋酸? 3、请分析自己的DNA样品。
三、操作 1、提取 称取干酵母粉2g于50mL三角瓶内。加
10% NaCl溶液10mL，搅拌均匀，然后于沸水浴 中提取半小时。 2.分离 将上述提取液取出，用自来水冷却，分装 在离心管内，以3500r/min离心10min，使提取 液与菌体残渣等分离。 3.沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50mL烧杯 内，并置于有冰块的250mL烧杯中冷却。待溶液冷 至10℃以下时，在搅拌下小心地加入等体积的酸性 乙醇，随着酸性乙醇的加入，溶液的逐步下降，溶液 中白色沉淀也逐渐增加，当 pH=2.5（RNA 等电 点）时沉淀量最多（注意严格控制pH值），继续于 冰浴中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。
核酸的定量分析方法
将样品放入核磁共振谱仪中，通过调节磁场强度和射频 脉冲的频率和幅度，获取样品的一维核磁共振谱图。
方法优缺点
优点是无需进行化学反应，对样品无损伤；缺点是对仪 器要求较高，谱图解析较为复杂。
THANK YOU.
在MALDI-TOF MS中，样品分子与基质分子混合 后，通过激光束照射基质分子，使样品分子离子 化并解吸进入气相。
MALDI-TOF MS具有高灵敏度、高分辨率和高通 量等优点，可广泛应用于蛋白质、核酸等生物分 子的分析鉴定，如用于蛋白质组学研究、DNA测 序和定量分析等。
06
基于核磁共振的定量分析方 法
核磁共振的基本原理
01
核磁共振现象
原子核在磁场中进行旋转，当磁场发生变化时，原子核吸收能量并发
生跃迁，产生核磁共振信号。
02
原子核自旋
原子核具有自旋角动量，在外加磁场中会产生磁矩，导致原子核在磁
场中进行旋转。
03
核磁共振条件
原子核只有在磁场发生变化时才会发生核磁共振，变化的磁场可以是
静磁场或梯度磁场。
02
基于染料结合的方 法
该方法利用荧光染料或溴化乙锭等 染料与DNA结合形成复合物，通过 测量染料-DNA复合物的荧光信号 强度来定量核酸。该方法包括荧光 染料结合法和荧光光谱法等。
基于标准品比较的 方法
该方法通过与已知浓度的标准品 进行比较，推算未知样品的浓度
04
基于生物传感器的 方法
该方法利用生物传感器对核酸进行 定性和定量分析
定量分析指导实验设计
通过对核酸进行定量分析，可以了解特定实验条件下细胞或 生物体内核酸的含量，指导实验设计、功能研究及临床诊断 等。
核酸定量分析的方法分类
12 生物化学实验--核酸的定量分析
核酸的定量分析【目的】1 ．掌握定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的方法。
2 ．熟悉定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的原理。
【原理】核酸分子中含有戊糖、磷酸与含氮碱，测定三者之一即可推算出核酸含量。
1 ．定糖法通过测定 DNA 或 RNA 分子中戊糖的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。
RNA 在强酸环境中加热可水解产生核糖。
核糖在浓酸作用下脱水形成糠醛，糠醛能与 3 ， 5 - 二羟基甲苯（地衣酚）缩合成绿色化合物（反应式见第 3 篇实验 11 ），其最大吸收峰波长为 670nm ， fe 3+ 或 Cu 2+ 可作为催化剂催化反应，与同样处理的核糖标准液进行比色即可测定出 RNA 的含量。
DNA 在强酸环境中加热水解生成的脱氧核糖与浓酸共热脱水生成ω- 羟基γ- 酮基戊醛，后者与能与二苯胺反应生成蓝色化合物（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为 595nm ，与同样处理的脱氧核糖标准液进行比色即可测定出DNA 的含量。
2 ．定磷法通过测定核酸中磷的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。
核酸含磷量平均为 8.73% （ RNA 含磷量为 8.5~9% ； DNA 含磷量为 9.2% ）。
用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷，在酸性溶液中磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏血酸、α-1 ， 2 ， 4- 氨基萘酚磺酸等）存在时，立即被还原为蓝色的钼蓝（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为660nm 。
当无机磷浓度在 2.5~25μg/ml 范围内时，溶液的吸光度值与磷含量成正比。
本法测得的磷含量为样品中的总磷量，需同时测定未消化样品中无机磷的含量，将测得的总磷量减去原无机磷含量即为样品中核酸的含磷量，进而计算核酸的含量。
3 ．紫外吸收法核酸分子中的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性能，最大吸收峰波长为 260nm ，不论是核苷、核苷酸或核酸，在此波段内都具有吸收紫外光的特性。
核酸的定量测定.
二、计算公式
ΔA260
RNA浓度 =
xN
0.024 x L
式中， ΔA260为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释 液在260nm波长处A值；
L ──比色杯的厚度，1cm；
N ——为稀释倍数；
0.024──每毫升溶液内含1μgRNA的A值；
1mL待测样品液中核酸（微克）
核酸％ ＝
1mL待测样品液中制品的毫克数
（一）琼脂糖凝胶电泳
用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分 离范围广。
电泳迁移率决定于： （1）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比） （2）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用0.7～1%） （3）DNA的构象：超螺旋＞线状分子＞开环状分子
（4）电压 （一般5V/cm,电压与迁移率成正比) （5）碱基组成（影响不大） （6）温度（4～30℃都可以，常室温进行）
2. 钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。 当使用维生素C为还原剂时，测定的最适范围 为1-10微克无机磷。
3. 测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过 氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未 消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷 量。
4. RNA的理论含磷量为9.5%，故由所测的核 酸含磷量可计算出核酸含量。
地衣酚法
二、实验原理
1. 当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的 核糖转变成醛类，后者与3，5-二羟基甲苯（ 地衣酚）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜 绿色复合物。反应产物在670nm处有最大光 吸收。
2. RNA浓度在20—250μg/ml范围内，光吸收与 RNA浓度成正比。
地衣酚法特异性差，凡戊糖均有此反应，DNA 和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。
核酸的定量分析方法
核酸的定量分析方法核酸的定量分析方法主要包括吸光光度法、DNA染色剂法、荧光法和实时荧光定量PCR等。
这些方法具有灵敏度高、选择性好和操作简便等特点，广泛应用于核酸相关的科研和临床领域。
下面将详细介绍这些方法的原理和应用。
吸光光度法是一种常用的核酸定量方法。
其原理是通过测量核酸分子在紫外（UV）或可见光区域吸收的光的强度来确定其浓度。
核酸在UV区域（260 nm）有较高的吸收峰，可以根据表观摩尔吸光系数来计算核酸的浓度。
吸光光度法简单快捷，操作简便，但只能提供核酸总含量信息，无法区分DNA和RNA，并且对于样品中的杂质、蛋白质和其他分子也会产生吸光，进而影响测定结果。
因此，在使用吸光光度法进行核酸定量时，需要对样品进行纯化和质控处理。
DNA染色剂法是另一种常用的核酸定量方法。
该方法利用DNA染色剂如伯胺黑（Ethidium Bromide，EtBr）或 PI（Propidium Iodide）与DNA结合，形成可视化的荧光复合物。
这些染色剂在无核酸或DNA浓度极低时不发光，只有与DNA结合后形成复合物才发光。
通过测量荧光强度，可以确定DNA的浓度。
DNA染色剂法具有较高的选择性和灵敏度，可以用于测定DNA的含量、纯度和相对分子量，但无法区分DNA和RNA。
此外，染色剂法测定DNA浓度时，需要对样品进行染色，并在测量前对染色剂进行去除以避免干扰。
荧光法是一种基于荧光现象的核酸定量方法，常用荧光标记试剂有SYBR Green I和PicoGreen等。
这些试剂可与DNA特异性结合并发出特定波长的荧光。
荧光强度与DNA浓度呈线性关系，通过测量荧光强度可以精确测定DNA浓度。
相比于吸光光度法和DNA染色剂法，荧光法具有更高的灵敏度和特异性，可以实现DNA和RNA的定量分析。
荧光法还可用于检测特定序列的DNA，如PCR扩增产物以及基因表达分析中的定量RT-PCR 实验等。
综上所述，核酸的定量分析方法种类繁多，吸光光度法、DNA染色剂法、荧光法和实时荧光定量PCR是其中常用的方法。
核酸定量检测
核酸定量检测核酸的定量核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。
可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。
核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。
每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。
定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。
如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / ml 的dsDNA，37μg / ml 的ssDNA， 40μg/ml 的RNA，30μg/ml的寡核苷酸。
测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。
测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。
然而，实验并非一帆风顺。
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。
灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，答应吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。
另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH 值、离子浓度等。
在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。
这些小颗粒的存在干扰测试效果。
为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。
在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。
从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260 / A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280 nm。
核酸的定量测定-定磷法
一、实验原理 核酸分子中含有一定比例的有机磷，一般为9.5%左右(RNA含 磷量约9.0%，DNA含磷量约为9.2%)，若测得某一核酸样品中有 机磷的含量，即可推算其核酸的含量。
核酸的消化：用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
强酸消化 钼酸铵
核酸中的有机无机磷酸
还原剂（抗坏血酸等）
无机磷酸
磷钼酸铵（Mo6+）
钼兰（Mo4+）兰色
钼兰在一定浓度范围内(无机磷含量在1—25μg范围内)。兰色的深浅和磷酸的含 量成正比（660nm），可用比色法测定其光吸收值。 1、标准曲线的制作 2、总磷的测定 3、无机磷的测定
▪用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
▪无机磷再与钼酸铵结合成磷钼酸铵。 PO43- + 3NH4 + + 12MoO4 2- + 24H+ (NH4)3PO4· 12MoO3· 2O↓(黄色)+6H2O 6H ▪ 当有还原剂存在时，Mo6+被还原成Mo4+，此4价钼再 与试剂中的其它MoO42－结合成Mo(MoO4)2或Mo3O8呈兰 色，称为钼兰。
4.生物化学实验,陈钧辉等编,3版或4版 科学出版社2003
3. 苔黑酚（地衣酚）法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为 糠醛，后者与地衣酚（3,5-二羟甲苯）作用生成 绿色化合物，在670nm处有最大吸收，RNA浓 度在10~100微克/毫升范围内，光密度与RNA的 浓度成正比关系。
注意事项： 1．地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，DNA及 其他杂质也有影响。故一般测定RNA时，可先测定样品 中DNA含量，再算出RNA含量。 2．本法较灵敏。样品中蛋白质含量高时，应先用5%三氯 醋酸溶液将蛋白质沉淀后再测定，否则将发生干扰。
核酸定量的方法和原理应用
核酸定量的方法和原理应用一、方法简介核酸定量是实验室中常用的一项技术，用于确定核酸样品中的DNA或RNA的浓度。
准确的核酸定量是许多分子生物学实验的基础，包括聚合酶链式反应(PCR)、脱氧核糖核酸测序和基因表达分析等。
本文将对常见的核酸定量方法和其原理应用进行介绍。
二、常见的核酸定量方法1. 吸光度法(Absorbance method)吸光度法是最常用的核酸定量方法之一。
该方法是基于核酸在紫外光区域的吸收特性来测定其浓度。
核酸样品溶液吸收紫外光的程度与其浓度成正比，可以通过测定吸光度来确定核酸的浓度。
通常使用比色杯、分光光度计或多功能酶标仪等设备进行测量。
2. 荧光染料法(Fluorometric method)荧光染料法是一种常用的核酸定量方法，适用于测定低浓度的核酸样品。
该方法通过加入荧光染料与核酸结合，形成荧光复合物并测量其荧光强度来定量核酸。
常用的荧光染料有SYBR Green、Ethidium Bromide等，可以使用荧光光度计来进行测量。
3. 核酸电泳法(Electrophoresis method)核酸电泳法是一种直接观察核酸浓度的方法。
通过将核酸样品在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，根据核酸带的强度和大小来估算核酸的浓度。
该方法适用于检测纯度较高的核酸样品，并可同时检测DNA和RNA。
可以使用核酸电泳仪进行实验操作。
三、核酸定量原理应用1. 核酸质量浓度的计算核酸定量方法可以进一步应用于核酸质量的计算。
根据核酸浓度，通过知道样品的体积大小可以计算出样品中的核酸质量。
这对于实验中需要精确配制核酸样品的工作非常重要，同时也有助于确定实验所用核酸的最佳浓度。
2. 酶切反应的优化核酸定量方法可用于酶切反应的优化。
酶切反应是分子生物学研究中常用的方法之一，通过将核酸样品与特定酶酶解，可以切割特定的DNA或RNA序列。
根据核酸定量结果，可以确定切割反应中所需的核酸样品的最佳浓度，从而优化酶切反应的结果。
核酸含量测定——定磷法
12
思考题
1. 回收率的意义； 回收率的意义； 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的 实验所用的水质、试剂质量、 酸度对测定结果的影响。 酸度对测定结果的影响。
13
实验结束
将试管洗净，斜插在试管架上， 将试管洗净，斜插在试管架上，放在台 面上。 面上。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净， 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿 中。 将实验台面擦干净。 将实验台面擦干净。
10
(1) 计算回收率： 计算回收率：
y × 50 回收率 = 0.15 ×100% 1000
x × 50 RNA总磷量 g / mL) = 1.5 ( 回收率
(2) 计算样品总磷量： 计算样品总磷量：
(3) 计算 计算RNA量： 量
RNA质量浓度（ g / mL) = 总磷量 无机磷量 DNA含量× 9.9% ×10.5 质量浓度（ （ ） ≈ 总磷量×10.5
核酸含量测定
定磷法
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量， 含量，反应灵敏。 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰 处有吸收高峰， 受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 地衣酚法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热 的含量， 与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为 中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω 酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应， -γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。 糖外其他糖类无此反应。
核酸定量检测方法
核酸定量检测方法
核酸定量检测是一种常见的生物学实验技术，用于测定DNA或RNA的浓度和纯度。
这种方法可以用于许多应用，例如基因克隆、PCR反应、RNAi实验等。
核酸定量检测的方法包括分光光度法、荧光定量法、凝胶电泳法等。
其中，分光光度法是最常用的方法。
该方法通过测量核酸在紫外光下的吸收值来确定其浓度。
荧光定量法是一种更灵敏的方法，它使用荧光染料来测量核酸的浓度。
凝胶电泳法是一种用于分离和可视化核酸的方法，通过与已知浓度的DNA或RNA进行比较，可以确定未知样品的浓度。
无论使用哪种方法，都需要注意样品的纯度。
检测前应使用比色法或荧光探针等方法检测样品中是否存在杂质，如果存在杂质，可能会影响检测结果。
此外，还应注意样品的保存和处理条件，以避免样品受到污染或损坏。
总之，核酸定量检测是生物学实验中非常重要的一步，正确的方法和技巧可以确保实验结果的准确性和可靠性。
- 1 -。
核酸的定量测定—定磷法
(1)6mol/L硫酸：取17ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加 入83ml水中。
(2)2.5%钼酸铵：2.5g钼酸铵溶于100ml水中 (3)10%抗坏血酸溶液：取10g抗坏血酸溶于100ml水 中。棕色瓶4 ℃ 贮藏。溶液应为淡黄色，深黄色或棕 色则不能用。
3. 催化剂：硫酸铜（
CuSO 5H O）：硫酸钾
660
计算样品中核酸含量，按下式进行：
有机磷量( g ) D 11 测定时取样量(ml) 100 样品中核酸含量%= 样品重量( g ) 其中：有机磷量(μg)=总磷量—无机磷量
Dቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ稀释倍数,即=
消化后定容体积(ml ) 消化时取样体积(ml )
核苷酸的消化和核酸一样。此外嘌呤类核苷 酸可用1.5mol/L的HCL，100℃ 水解1小时脱磷； 嘧啶类核苷酸可用10mol/L H 2 SO4 消化1—2个小 时脱磷。
二，试剂
1.标准磷试剂（含磷5μg/ml）:准确称取恒重 （105℃ ）的 KH 2 PO4 0.4389g,用水定容到100ml，此液 的浓度为1mg/ml，用前再稀释200倍，即为5μg/ml。 2.定磷试剂：
取稀释后的消化液1ml，加水2ml，定磷试剂3ml， 摇匀，45 ℃放置20分钟，于660nm处读取OD值。空白 对照同样操作。 3. 样品中无机磷含量测定： 取未消化的核酸样品液1ml用水定容到50ml。从中取 1ml，加2ml水，3ml定磷试剂，摇匀后保温，然后读
OD
660
四，结果
首先制作标准磷曲线，以消化和未消化的样品中的 从标准曲线上查出各自对应的磷含量。 计算样品中核酸含量，按下式进行： OD
在测定过程中，浓硫酸与核酸共热使其转变为无 机磷（此为消化过程），而无机磷与定磷试剂中的钼 酸铵在酸性条件下反应生成磷钼酸铵，它在还原剂作 用下被还原成深蓝色的钼蓝（高价钼被还原成低价 钼），钼蓝在660nm初有最大光吸收峰。在一定的磷 浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比 生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，为了消 除无机磷的影响，应同时测定样品中的总磷量和样品 中的无机磷含量（样品未经消化而直接测定的含磷 量）。从总磷量中减去无机磷量，才是样品中的真正 磷含量。
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用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分 离范围广。
电泳迁移率决定于： （1）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比） （2）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用0.7～1%） （3）DNA的构象：超螺旋＞线状分子＞开环状分子
（4）电压 （一般5V/cm,电压与迁移率成正比) （5）碱基组成（影响不大） （6）温度（4～30℃都可以，常室温进行）
核酸的定量测定
紫外吸收法 核酸的凝胶电泳 定磷法 二苯胺法 地衣酚法
紫外吸收法 实验原理
核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有
吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸
的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升 溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值） （表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以 计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅 速，并对被测样品无损，用量也少。
的DNA含量。
地衣酚法
二、实验原理
1. 当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成
的核糖转变成醛类，后者与3，5-二羟基甲苯
（地衣酚）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成
鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大 光吸收。 2. RNA浓度在20—250μg/ml范围内，光吸收与 RNA浓度成正比。
3
0.40 2.60 3.00 0.00
4
0.60 2.40 3.00 0.00
5
0.80 2.20 3.00 0.00
6
1.00 2.00 3.00 0.00
7
0.00 2.00 3.00 1.00
8
0.00 2.00 3.00 0.00
0.00
0.00
0.00
2.00
0.00
4.00
0.00
6.00
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
用于小片段DNA的分析
相对分子质量小于1000bp的DNA片断 和RNA的电泳。 PAGE中一般不含RNase，用于RNA分 析时不会分解样品。
定磷法
二、实验原理
1. 在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼
酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，
当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的 还原产物——钼蓝。
1. 取同样规格的试管8支，按下表顺序分别精确 地加入各试剂。
编号
标准磷溶液 10ug/mL(mL) 水(mL) 定磷试剂 消化的RNA(0.06mg/ml) 未消化的 RNA(0.06mg/ml) 相当于无机磷量(微克)
1
0.00 3.00 3.00 0.00
2
0.20 2.80 3.00 0.00
琼脂糖凝胶电泳常用于DNA分析；分析RNA时需加 入蛋白质变性剂甲醛。电泳完毕用溴化乙锭 （0.5μg/mL）染色，用紫外光检测
★琼脂糖电泳用于DNA 分子量的测定
在同一凝胶中加入已 知相对分子质量的样 品（分子marker) ， 在电泳完成后，通过 染色，照相，从照片 上比较待测样品的 DNA片段与标准样品 中的已知大小片段， 可以推测待测未知 DNA片段的分子大小。
2.
钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。当 使用维生素C为还原剂时，测定的最适范围为
1-10微克无机磷。
3. 测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过 氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未 消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷 量。
4. RNA的理论含磷量为9.5%，故由所测的核酸含
磷量可计算出核酸含量。
DNA待测液(mL)
DNA含量(ug)
0.00
0
பைடு நூலகம்
0.00
80
0.00
160
0.00
240
0.00
320
0.00
400
2.00
Y
OD595
X
2. 将试管内溶液立即摇匀，于70℃恒温水浴内保温5060分钟。取出冷却至室温，于595nm处测定OD值。 3. 以1-6号管DNA含量（微克）为横坐标，光密度为纵坐 标，绘出标准曲线。 4. 根据7号管测得的OD值，从标准曲线求出DNA待测液中
0.0
3.0 3.0
0.6
2.4 3.0
1.2
1.8 3.0
1.8
1.2 3.0
2.4
0.6 3.0
3.0
0.0 3.0
0
0 3.0
2. 将试管内溶液立即摇匀，置沸水浴内25-30分钟。取 出冷却至室温，于670nm处测定OD值。 3. 以0-5号管RNA浓度为横坐标，对应光密度为纵坐标， 绘出标准曲线。 4. 根据6号管测得的OD值，从标准曲线求出RNA待测液浓 度。
地衣酚法特异性差，凡戊糖均有此反应，DNA和 其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。
• •
三、 实验步骤 1. 取同样规格的试管7支，按下表顺序分别精 确地加入各试剂。
试管 试剂/ml RNA待测溶液 标准RNA溶液 (100ug/ml) 蒸馏水 地衣酚-Fe3+ 0 0.0 1 0.0 2 0.0 3 0.0 4 0.0 5 0.0 6 3.0
密度与DNA的浓度成正比。
2. 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏
度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖（五碳糖
）也有同样反应。其它多数糖类，包括核糖在 内，一般无此反应。
• 三、 实验步骤
• 1. 取同样规格的试管7支，按下表顺序分别精 确地加入各试剂。
编号 DNA标准液(200ug/mL) 蒸馏水(mL) 二苯胺试剂(mL) 1 0.00 2.00 4.00 2 0.40 1.60 4.00 3 0.80 1.20 4.00 4 1.20 0.80 4.00 5 1.60 0.40 4.00 6 2.00 0.00 4.00 7 0.00 0.00 4.00
0.00
8.00
0.00
10.00
0.00
A
1.00
B
2. 将试管内溶液立即摇匀，于45℃恒温水浴内保温30-45
分钟。取出冷却至室温，于660nm处测定OD(光密度)值 。 3. 以1-6号管标准磷含量（微克）为横坐标，光密度为纵 坐标，绘出标准曲线。
二苯胺法
二、实验原理
1. 脱氧核糖核酸中的2-脱氧核糖在酸性环境中与 二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm 处有最大吸收。DNA在40-400微克范围内，光
二、计算公式 ΔA260 RNA浓度 = 0.024 x L
式中， ΔA260为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释 液在260nm波长处A值；
x N
L ──比色杯的厚度，1cm；
N ——为稀释倍数；
0.024──每毫升溶液内含1μ gRNA的A值；
1mL待测样品液中核酸（微克）
核酸％ ＝ 1mL待测样品液中制品的毫克数
消化的RNA溶液(0.06mg/mL) ：
取0.6mg酵母RNA，加入1.5M H2SO4溶液 10mL，在沸水浴中加热10-20分钟，使核酸充 分水解后，用于对各组分的鉴定。
未消化的RNA溶液(0.06mg/mL) :
取0.6mg酵母RNA,加入蒸馏水10mL，55-65
度消化半小时。
三、 实验步骤
试剂和器材
• 试剂： • 钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取 3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼
• 材料
酵母RNA干粉。
酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，
即成0.25%钼酸铵－2.5%过 氯酸溶液。 • 5-6%氨水：用25-30%氨水稀 释5倍。
操作方法
1.准确称取待测核酸样品0.5g，加少量0.01mol/L NaOH调成 糊状,再加适量水，用5-6%氨水调至pH7.0，定容至50mL。
在本实验中，1mL待测液中制品量为50μ g。
注意事项
1. 紫外分光光度计使用前要预热。 2. 比色皿应成套使用，注意保护,不能拿在光面上。 3. 离心机使用前必须将离心管平衡，对称放置。调速必须 从低到高，离心完等转子完全停下后，再打开盖子，然 后将转速打到最低。
核酸的凝胶电泳
是当前核酸研究中最常用的方法。有许多的 优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的 有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2.取两支离心管，甲管加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水，乙管 加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂。混匀，在冰浴上放置 30min。 3.在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5 mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英 比色杯，在260nm波长处测定A值。
4.测定A280的值。求出A260/A280.判断RNA的纯度。 RNA=A260/A280=2.0