时间分辨荧光免疫分析
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? ALP
酶放大免疫分析示意图
双标记测定 AFP和β-hCG
β-NTA作为螯合剂 340 nm 激发，Eu:615 nm, 820 μs；Sm:643 nm, 88 μs
（二）均相免疫分析
? 基于时间分辨荧光共振能量转移 ? 无需洗涤、分离、加增强液
? TBP-Eu：Eu3+-二吡啶二胺，最大发射 615nm，供体
（2）增强液
增强原理图
一般增强百万倍
? β-NTA：Eu(β-NTA)3(TOPO) 2复合物 ? TOPO ：荧光增强协同剂 ? Triton X-100 ：表面活性剂，形成胶束 ? 醋酸：酸性介质
（3）酶Βιβλιοθήκη Baidu大
? 酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离 子、螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复 合物
5-2 时间分辨荧光免疫分析
郑鹄志 西南大学 化学化工学院
发展历程
? 1979年，可标记抗体的Eu3+-β-二酮体-EDTA
? 1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测 定HCG和磷酸酯酶A
? “镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配 套研究”获2003年度国家科技进步二等奖
一、时间分辨荧光免疫分析特点
104 -106 ns
2. Stokes位移大
荧光物质 Eu-(β-NTA)3 Sm-(β-NTA)3
Tb-(PTA) 3 Dy-(PTA) 3
激发波长 340 nm 340 nm 295 nm 295 nm
发射波长 613 nm 600 nm 490/543 nm 573 nm
Stokes 位移 273 nm 260 nm
4.激素检测
? 三碘甲状腺原氨酸（T3）：竞争法 ? 微孔板中加入抗体 ? 标准品或样品、铕标记T3 ? 加入增强液，测定荧光 ? 灵敏度：0.21ng/ml
5.细胞活性检测
T：靶细胞 E：效应细胞
测定细胞活性原理图
NK细胞活性
? 靶细胞：K562细胞 ? 加入EuCl3, DTPA, 硫酸葡聚糖，4oC孵育 ? 向靶细胞中加入效应细胞（NK细胞），孵
195/248 nm 278 nm
镧系元素发射峰窄
优点
? 灵敏度高（10-18mol/孔） ? 原子标记 ? 多标记技术
二、时间分辨荧光免疫分析体系
? 非均相时间分辨荧光免疫分析 ? 均相时间分辨荧光免疫分析
（一）非均相时间分辨荧光免疫分析
? 时间分辨固相免疫分析 ? 解离增强荧光免疫分析 ? 酶放大免疫分析
4. 捕获法
捕获法测定抗 -CMV IgM
5. 生物素-亲和素法
生物素-亲和素检测 PAPP-A
四、应用
? 1. 肿瘤标志物检测 ? 2. 传染病检测 ? 3. 糖尿病检测 ? 4. 激素检测 ? 5. 细胞活性检测
1.肿瘤标志物
? AFP测定：双抗体夹心法 ? 固相包被抗体 ? 加入样品或标准品 ? 加入Eu标记抗体 ? 加入增强液 ? 测定荧光 ? 灵敏度：0.17 U/ml
育，离心，测上清荧光 ? 计算比释放率（%）
实验释放量 ? 自然释放量 ×100% 最大释放量 ? 自然释放量
? APC ：别藻蓝蛋白，最大发射665nm ，受 体
? 能量转移效率最高的供体/受体对
时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图
三、时间分辨免疫分析方法
? 夹心法 ? 竞争法 ? 间接法 ? 捕获法 ? 生物素-亲和素放大法
1. 夹心法
双抗体夹心法
双抗原夹心法
2. 竞争法
3. 间接法
间接法测定 HCV 抗体
1.时间分辨固相免疫分析
灵敏度一般不高
? 实例 ? 加拿大Cyber Fluor 的FIAgen 系统 ? Eu 3+-BCPDA 为标记物
2.解离增强分析
原理示意图
（1）双功能螯合剂
? EDTA 衍生物、 DTTA 衍生物、 DTPA 衍生物 ? 一端与镧系离子螯合，一端与抗原 /抗体连接 ? 近中性时，螯合物足够稳定 ? 酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放 ? Eu-DTTA 应用最广泛
1.荧光衰减时间长
镧系元素荧光衰变时间
常见荧光物质荧光寿命
荧光物质 Eu3+
非特异性荧光背景 人血清白蛋白
人球蛋白、血红蛋白 细胞色素C FITC 丹磺酰氯 苯胺萘磺酸 稀土螯合物
荧光寿命 714 μs 1-10 ns 4.1 ns 3.0 ns 3.5 ns 4.5 ns 14 ns 16 ns
2. 传染病检测
? 梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法
? 强阳性血清和正常人血清分别作为阴阳对照 ? 阴性对照、阳性对照和样品加入板上，孵育 ? 加入铕标记抗原，孵育 ? 加入增强液，检测荧光
? 符合中国药品生物制品鉴定所结果
3.糖尿病检测
? C-肽检测：双抗体夹心法 ? 抗体包被微孔板 ? 加入标准品或样品 ? 加入铕标记抗体 ? 增强液，检测荧光 ? 灵敏度：0.08ng/ml
酶放大免疫分析示意图
双标记测定 AFP和β-hCG
β-NTA作为螯合剂 340 nm 激发，Eu:615 nm, 820 μs；Sm:643 nm, 88 μs
（二）均相免疫分析
? 基于时间分辨荧光共振能量转移 ? 无需洗涤、分离、加增强液
? TBP-Eu：Eu3+-二吡啶二胺，最大发射 615nm，供体
（2）增强液
增强原理图
一般增强百万倍
? β-NTA：Eu(β-NTA)3(TOPO) 2复合物 ? TOPO ：荧光增强协同剂 ? Triton X-100 ：表面活性剂，形成胶束 ? 醋酸：酸性介质
（3）酶Βιβλιοθήκη Baidu大
? 酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离 子、螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复 合物
5-2 时间分辨荧光免疫分析
郑鹄志 西南大学 化学化工学院
发展历程
? 1979年，可标记抗体的Eu3+-β-二酮体-EDTA
? 1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测 定HCG和磷酸酯酶A
? “镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配 套研究”获2003年度国家科技进步二等奖
一、时间分辨荧光免疫分析特点
104 -106 ns
2. Stokes位移大
荧光物质 Eu-(β-NTA)3 Sm-(β-NTA)3
Tb-(PTA) 3 Dy-(PTA) 3
激发波长 340 nm 340 nm 295 nm 295 nm
发射波长 613 nm 600 nm 490/543 nm 573 nm
Stokes 位移 273 nm 260 nm
4.激素检测
? 三碘甲状腺原氨酸（T3）：竞争法 ? 微孔板中加入抗体 ? 标准品或样品、铕标记T3 ? 加入增强液，测定荧光 ? 灵敏度：0.21ng/ml
5.细胞活性检测
T：靶细胞 E：效应细胞
测定细胞活性原理图
NK细胞活性
? 靶细胞：K562细胞 ? 加入EuCl3, DTPA, 硫酸葡聚糖，4oC孵育 ? 向靶细胞中加入效应细胞（NK细胞），孵
195/248 nm 278 nm
镧系元素发射峰窄
优点
? 灵敏度高（10-18mol/孔） ? 原子标记 ? 多标记技术
二、时间分辨荧光免疫分析体系
? 非均相时间分辨荧光免疫分析 ? 均相时间分辨荧光免疫分析
（一）非均相时间分辨荧光免疫分析
? 时间分辨固相免疫分析 ? 解离增强荧光免疫分析 ? 酶放大免疫分析
4. 捕获法
捕获法测定抗 -CMV IgM
5. 生物素-亲和素法
生物素-亲和素检测 PAPP-A
四、应用
? 1. 肿瘤标志物检测 ? 2. 传染病检测 ? 3. 糖尿病检测 ? 4. 激素检测 ? 5. 细胞活性检测
1.肿瘤标志物
? AFP测定：双抗体夹心法 ? 固相包被抗体 ? 加入样品或标准品 ? 加入Eu标记抗体 ? 加入增强液 ? 测定荧光 ? 灵敏度：0.17 U/ml
育，离心，测上清荧光 ? 计算比释放率（%）
实验释放量 ? 自然释放量 ×100% 最大释放量 ? 自然释放量
? APC ：别藻蓝蛋白，最大发射665nm ，受 体
? 能量转移效率最高的供体/受体对
时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图
三、时间分辨免疫分析方法
? 夹心法 ? 竞争法 ? 间接法 ? 捕获法 ? 生物素-亲和素放大法
1. 夹心法
双抗体夹心法
双抗原夹心法
2. 竞争法
3. 间接法
间接法测定 HCV 抗体
1.时间分辨固相免疫分析
灵敏度一般不高
? 实例 ? 加拿大Cyber Fluor 的FIAgen 系统 ? Eu 3+-BCPDA 为标记物
2.解离增强分析
原理示意图
（1）双功能螯合剂
? EDTA 衍生物、 DTTA 衍生物、 DTPA 衍生物 ? 一端与镧系离子螯合，一端与抗原 /抗体连接 ? 近中性时，螯合物足够稳定 ? 酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放 ? Eu-DTTA 应用最广泛
1.荧光衰减时间长
镧系元素荧光衰变时间
常见荧光物质荧光寿命
荧光物质 Eu3+
非特异性荧光背景 人血清白蛋白
人球蛋白、血红蛋白 细胞色素C FITC 丹磺酰氯 苯胺萘磺酸 稀土螯合物
荧光寿命 714 μs 1-10 ns 4.1 ns 3.0 ns 3.5 ns 4.5 ns 14 ns 16 ns
2. 传染病检测
? 梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法
? 强阳性血清和正常人血清分别作为阴阳对照 ? 阴性对照、阳性对照和样品加入板上，孵育 ? 加入铕标记抗原，孵育 ? 加入增强液，检测荧光
? 符合中国药品生物制品鉴定所结果
3.糖尿病检测
? C-肽检测：双抗体夹心法 ? 抗体包被微孔板 ? 加入标准品或样品 ? 加入铕标记抗体 ? 增强液，检测荧光 ? 灵敏度：0.08ng/ml