酶促反应

当 Da < 1时， CSS → CS ,ηout → 1，过程为反应控制。
令 C * = CSS , K = K m ，（2-86）式可变形为：
CS
CS
rmaxC * K +C*
= kL aCS (1 − C * ) =
N max (1 − C * )
整理，得
Da = rmax = rmax = (1 − C * )(K + C * )
微胶囊 2.3.1.3 固定化对酶性质的影响
（1）底物专一性的改变 由于立体障碍，使的底物特异性发生改变。例如，胰蛋白酶既作用于高分子的蛋白 质，又作用于低分子的肽或多肽。采用羧甲基纤维素对胰蛋白酶进行固定化后，胰蛋白 酶对二肽或多肽的作用不变，但对酪蛋白的作用仅为游离酶的 3％左右。
（2）稳定性增强 一般固定化酶比游离酶稳定性好，表现在热稳定性，保存和使用稳定性的增加，及 对蛋白酶的抵抗性和耐受性增强。 （3）最适 pH 值和最适温度变化 酶固定化载体为多聚阳离子性质时，固定化酶的最适 pH 值向酸性一侧移动；酶固 定化载体为多聚阴离子性质时，固定化酶的最适 pH 值向碱性一侧移动；产物为酸性时， 固定化酶最适 pH 值向酶性一侧移动；产物为中性时，最适 pH 值一般无变化。 （4）动力学参数的变化 酶经固定化后，表观米氏常数发生变化。 2.3.1.4 影响固定化酶促反应的主要因素 （1）分子构象的改变 指固定化过程中酶与载体的相互作用引起酶的活性中心或调节中心的构象发生了 变化，导致酶与底物的结合力下降。（见教材 P27 图 2－6） （2）位阻效应 由于载体的遮蔽作用或固定化方法不当，给酶的活性中心或调节中心造成空间障 碍 ，使底物和酶无法与酶接触。（见教材 P27 图 2－6） （3）微扰效应 由于载体的亲水性、疏水性、介电常数等性质，使酶所处的微环境与宏观环境不同， 从而改变了酶的催化能力或酶对效应物的调节能力的效应。 （4）分配效应 由于载体与底物之间疏水性、亲水性或静电作用引起微环境和宏观环境之间物质的 不等分配，从而影响酶促反应速率的一种效应 分配效应可用分配系数 KP 来定量描述。 Kp 的定义：载体内外底物（或其他物质）浓度之比。 Kp 的测定：在已知底物浓度 CS0、体积 V0 的溶液中，放入不含底物的一定体积 V’ 的载体，并保持适宜条件，当达到平衡时，测定载体外溶液的底物浓度 CS。 (5) 扩散效应 由于底物、产物或其他效应物的迁移和传递速度所受到的限制，当物质扩散系数很 低，酶活性较高时，在固定化周围形成浓度梯度，造成微观环境和宏观环境间底物、产 物浓度产生差别。 扩散效应可定量描述。
CS，ηout 越接近 1。Da 准数越大，固定化酶表面浓度越趋近于零，ηout 越小，越趋近于 零。
可见，为提高固定化酶外扩散效率，应设法减小 Da 准数。
从公式 Da = rmax 可知，减小 Da 准数的方法有两个，一是降低固定化酶颗粒的粒 kL aCS
径，增大比表面积 a ，但由于粒径减小会伴随压降增加，因此应用中综合考虑，确定合
流入量－流出量＝反应量
4π (r + dr)2 De⎜⎛ dCSr ⎝ dr
⎟⎞ ⎠ r+dr
− 4πr 2 De⎜⎛ dCSr ⎝ dr
⎟⎞ ⎠r
=
4πr 2rS dr
整理，得
4π[r 2
+
2rdr
+
(dr)2 ]De⎜⎛ dCSr ⎝ dr
⎟⎞ ⎠ r+dr
−
4πr 2 De⎜⎛ ⎝
dC Sr dr
作用力
载体
物理吸附法 物理吸附 石英砂，多孔玻璃，淀粉，硅胶，活性碳
载体结合法 离子结合法 离子键 离子交换树脂
共价结合法 共价键 纤维素，尼龙
交联法：利用双功能试剂，在酶分子间发生交联，凝胶形成网状结构。
O E
O E
E O
O
E
包埋法：将酶包埋在凝胶的微细格子里，或被半透性的聚合膜所包埋，使酶分子只能 从凝胶的网络中漏出，而小分子的底物和产物可自由通过。 格子型 常用凝胶：角叉菜胶，明胶，淀粉凝胶，聚丙烯酰胺凝胶
Da 准数定义： Da = rmax kL aCS
西勒准数定义：φ 2 = R 2rmax 9K m De
外扩散效率因子定义：η out
=
rout r0
Da<1，过程为反应控制，Da 准数越小，
ηout 越接近 1；Da>1，过程为外扩散控制，
Da 准数越大，ηout 越趋近于零。
内扩散效率因子定义：ηin
rmax C SS
η out
=
rout ro
= K m + CSS rmax C S
= CSS K m + CSS
Km + CS
（2－83）
（ CS >> K m 时， rout ≈ ro ）
可见，只要确定了固定化酶表面浓度 CSS， 即可计算外扩散效率因子ηout。那 么，固定化酶表面底物浓度 CSS 又如何确定呢？
适的粒径；二是使固定化酶表面流体处于湍流状态以增大 kL 。
2.3.2.2 内部扩散过程 具有大量内孔的球形固定化颗粒，其内部是酶促反应的主要场所，底物通过孔口向
内扩散，达到不同深度，产物沿反方向从内部向孔口扩散。颗粒内部各点处底物和产物 浓度不同，导致各处的反应速率的差异。
内扩散效率因子ηin 的定义为单位时间内颗粒内部实际酶促反应速率 rin 与按颗粒外 表面底物浓度计算而得到的反应速率 ro 之比。记作
=
CE CE0
=
∑ xi
i
exp(−kit)
， tc
=
1 kd
（2－98）
2.4.1.2 多步失活模型 ( multi step model ) 多步串联失活模型：酶的失活经历多步，即 E → F → D
可划分为 同步失活模型：全部酶分子可划分为热稳定性不同的若干个组分，每
个组分均符合一步失活模型。
对同步失活模型，全部酶中残存活性酶的比率
ϕ (t )
(2-91)
当酶促反应符合米氏方程规律时，在微元壳体内
rS
=
rmax CSr K m + CSr
故， d 2CSr + 2 dCSr = rmaxCSr dr 2 r dr De(K m + CSr )
(2-92)
令CX
=
CSr CSS
，l
=
r R
，β =
CSS Km
，φ 2
=
R 2 rmax 9 DeK m
φ >> 0.3 ，则ηin < 1，反应为内扩散所限制。
为提高固定化酶内扩散效率，应设法减小φ。 减小φ的措施主要是适当降低固定化酶颗粒粒径。 下面将固定化酶外扩散限制与内扩散限制进行比较。
表 2-1 外扩散过程与内扩散过程的比较
外扩散过程
内扩散过程
Da 准数是决定外扩散效率因子的唯一参数 φ 准数是决定内扩散效率因子的主要参数
− dCE dt
= kdCE
（2－96）
边界条件： t = o,CE = CE0 积分，得
CE = CE0 exp(−kd t) 几个概念：
kd ：一步失活常数。
t1/ 2 ：半衰期，当 t
= t1/ 2 , CE
=ห้องสมุดไป่ตู้
1 2
C
E
0
（2－97）
tc
：时间常数， tc
=
1 kd
三者关系：
t1/ 2
=
ln 2 kd
2.3.1.1 酶的固定化技术定义
酶的固定化技术就是将水溶性的酶分子通过一定的方式，如静电吸附，共价键等与
载体如角叉菜胶、离子交换树脂等材料，制成固相酶的技术。
细胞的固定化技术：为省去从微生物（动、植物）中提取酶的操作，确保酶的稳定
性，采用直接固定化微生物细胞，动植物细胞、组织技术。
2.3.1.2 酶和细胞固定化方法
图 2-9 为 rmax >> N max 的情况，此时 CSS → 0,ηout → 0 ；图 2-10 为 rmax << N max 的
情况，此时 CSS → CS ,ηout → 1。
Da = rmax ，称为 Da 准数 N max
当 Da > 1 时， CSS → 0,ηout → 0 ，过程为外扩散控制。
式中φ为西勒（Thiele）准数，其物理意义是表面反应速率与内扩散速率之比。对各
类反应动力学与固定化酶的形状，普遍化的φ的定义式为
1
∫ φ = VP AP
rs 2
⎜⎜⎝⎛
CSS CS ,eq
Ders
dCs
⎟⎟⎠⎞
2
将(2-92)式转化为无因次形式，得
d 2cX + 2 dcX = 9φ 2 cX
dl 2 l dl
以表面固定化酶为例。主体溶液底物浓度为 CS，载体外表面底物浓度为 CSS。
CSS CS
外扩散速率 N=kLa(CS-CSS)，Nmax=kLaCS
酶促反应速率
rout
= rmaxCSS K m + CSS
达到平衡时， N = rout ，即
rmax C SS K m + CSS
= kL a(CS
− CSS )
2.3 固定化酶促反应动力学
2.3.1 固定化酶促反应动力学基础
这里分三个方面讨论：什么是酶的固定化？为什么进行酶的固定化？怎样进行酶的
固定化？
生物工业用酶大多为水溶性，酶促反应体系为均相体系，均相体系简单，但存在一
个缺点，就是酶难以回收利用，同时，酶和产物混在一起，给产物的提取带来困难。解
决此问题可采用酶的固定化技术。