RNA的制备及纯度的鉴定
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2.置冰浴中分层，在0-4℃下，以4000rpmn离心15分钟。吸 出上清液，加等体积氯仿－异戊醇，室温下剧烈振荡10分 钟，以4000rpm离心5分钟，或在室温下放置10分钟使分 层。吸出上清液（若有必要，该操作可反复多次），加2 倍体积2% 乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置1小时使 RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。
mRNA的选择性拼接 合成类RNA
RNA的生物合成 RNA/DNA诊断仪
实验目的
1 掌握从动物组织中提取RNA的基本原理和操作 2 掌握RNA纯度鉴定的原理和基本操作 3 进一步熟悉可见分光光度计的使用
实验原理
细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形 式存在。因此分离RNA时必须使RNA 与蛋白质解离，并 除去蛋白质。
3.若要得到干燥制品，可将沉淀液以4000rpm离心10分钟，
倾去上清液。沉淀用少许75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇 各洗1次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。
4.将RNA（准确称取30mg左右RNA干燥制品）溶于5～10mL蒸 馏水中，离心除去不溶性杂质，得RNA粗品。
5.RNA纯度的鉴定
一、RNA标准曲线的制定 取8支试管，编号，按表加入试剂。加毕，摇匀，置沸水 浴中加热15min，冷却，测OD670值。以OD670值为纵 坐标，RNA含量（ug/ml）为横坐标绘制标准曲线。
实验步骤
一.实验前的准备 mRNA的分子结构容易受到RNA 酶的攻击反应而降
解,加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在,因此在提 取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其 活性。 所用的玻璃器皿需要置于干燥烘箱中 200.0°C烘烤 两小时以上,凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容 器等可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液 处理，再用蒸馏水冲净。
• RNA制品继续用氯仿－异戊醇处理，可以进一步除去其 中含有的少量蛋白质。最后用乙醇使RNA自水溶液中沉 淀下来。
• 实验所得制品的核酸含量可用地衣酚显色法测定RNA含 量 。RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继 而转变为糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应 呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应 产物在670nm处有最大吸收。RNA在20～250 g范围内， 光吸收与RNA的浓度成正比。
生物制药09303 第七组
指导老师：陈芬
（一） 操 作 方 法
1.背景知识
6.思考问题 5.注意事项
RNA的制备及 纯度的鉴定
2.基本原理 3.仪器试剂
4.工艺过程
背景知识
核糖核酸，简称RNA，主要以单链的形式存在于生物体 内,其高级结构很复杂,它们既担负着储藏及转移遗传信 息的功能,又能作为核酶在细胞内发挥代谢功能。生物体 内共有三种RNA，即编码特定蛋白质序列的信使RNA； 能特异性解读mRNA中的遗传信息、将其转化成相应氨 基酸后加入多肽链中的转运RNA；直接参与核糖体中蛋 白质合成的核糖体RNA。
RNA提取流程
2克动物肝脏组织
加氯仿异戊醇震荡
研碎 加20mlSDS缓冲盐溶液
Hale Waihona Puke Baidu
离心取上清液
加2%乙酸钾乙醇溶液
倒入磨口具塞锥形瓶
放置沉淀离心
加同体积含水酚溶液 室温剧烈震荡10分钟
洗涤沉淀离心干燥
水浴分层并离心
将RNA溶于蒸馏水
得上清液
离心得粗品
二.实验过程
1.取2g动物肝脏组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加 20mLSDS-缓冲盐溶液（见试剂1.）使成均浆，倒入磨口 具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚溶液，室温下剧烈 振荡10分钟。
二、制品的测定 取0.2~0.5ml制品液于试管中，加蒸馏水稀释至2ml，然后加 2ml地衣酚试剂摇匀，于沸水中煮沸15分钟，冷却，测OD670 。根据测得的吸光度，从标准曲线上查出相当该吸光度的RNA 的含量。
三、 RNA含量的计算 根据测得的光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收值的 RNA含量。按下式计算出制品中RNA的百分含量： 样品液RNA含量(ug/ml)=标准曲线查到的值×稀释倍数
RNA质量分数
样品液
RNA 含量（g/mL） 总体积（
新鲜肝重（ g）10 6
mL
）
100
%
操作参照表
管号 0
RNA标 0 准液/ml 蒸馏水 2 /ml 地衣酚 2 试剂/ml
12 34567 0.2 0.4 0.8 1.0 1.2 1.6 2.0 1.8 1.6 1.2 1.0 0.8 0.4 0 22 22222
实验器材与试剂
器材：乳钵 、磨口 具塞锥形瓶 (500ml) 天平 、 离心 机（4000rpm）动物肝脏 、紫外可 见分光度计、恒温水浴锅
试剂：
1.SDS-缓冲盐溶液［0.3%SDS-0.1mol/L氯化钠 -0.05mol/L， pH5.0乙酸盐缓冲液］称取1.5gSDS，2.92g氯化钠，2.05g乙酸钠 溶于水中，用乙酸调至pH5.0，最后定容至 500ml。 2.含水酚液：使用前将苯酚重蒸(酚的沸点为181.8℃)并用SDS－缓 冲盐溶液使其饱和。 3.氯仿-异戊醇液：氯仿：异戊醇=24:1(V/V)。 4.含2%乙酸钾的95%乙醇溶液。 5.75%乙醇，95%乙醇、无水乙醇。 6.乙醚 7.RNA标准溶液（须经定磷确定其纯度）：取酵母RNA配成200 g/mL的溶液。 8.地衣酚试剂：先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸（分析纯）溶液，实 验前用此溶液作为溶剂配成 0.1%地衣酚溶液。
最常用含水的酚溶液除去蛋白质，去污剂和酚均能抑制RNA 酶活力，有利于制备核酸大分子，以酚水两相系统分离 RNA是将细胞或细胞器置于含有SDS的缓冲盐溶液中， 加等体积水饱和的酚，通过剧烈振荡，然后离心形成上层 水相和下层酚相。
实验所用的0.15mol/L缓冲盐溶液系统可使大部分核糖核蛋 白解离，在用酚处理时脱氧核糖核蛋白变性；在低温条件 下，从水相中除去，这样得到的RNA 制品中混杂的DNA 量极低
注意事项
1：在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样品 的完整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避免 剧烈操作
2：在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强 于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋 白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染， 尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污 染更为有效。
mRNA的选择性拼接 合成类RNA
RNA的生物合成 RNA/DNA诊断仪
实验目的
1 掌握从动物组织中提取RNA的基本原理和操作 2 掌握RNA纯度鉴定的原理和基本操作 3 进一步熟悉可见分光光度计的使用
实验原理
细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形 式存在。因此分离RNA时必须使RNA 与蛋白质解离，并 除去蛋白质。
3.若要得到干燥制品，可将沉淀液以4000rpm离心10分钟，
倾去上清液。沉淀用少许75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇 各洗1次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。
4.将RNA（准确称取30mg左右RNA干燥制品）溶于5～10mL蒸 馏水中，离心除去不溶性杂质，得RNA粗品。
5.RNA纯度的鉴定
一、RNA标准曲线的制定 取8支试管，编号，按表加入试剂。加毕，摇匀，置沸水 浴中加热15min，冷却，测OD670值。以OD670值为纵 坐标，RNA含量（ug/ml）为横坐标绘制标准曲线。
实验步骤
一.实验前的准备 mRNA的分子结构容易受到RNA 酶的攻击反应而降
解,加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在,因此在提 取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其 活性。 所用的玻璃器皿需要置于干燥烘箱中 200.0°C烘烤 两小时以上,凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容 器等可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液 处理，再用蒸馏水冲净。
• RNA制品继续用氯仿－异戊醇处理，可以进一步除去其 中含有的少量蛋白质。最后用乙醇使RNA自水溶液中沉 淀下来。
• 实验所得制品的核酸含量可用地衣酚显色法测定RNA含 量 。RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继 而转变为糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应 呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应 产物在670nm处有最大吸收。RNA在20～250 g范围内， 光吸收与RNA的浓度成正比。
生物制药09303 第七组
指导老师：陈芬
（一） 操 作 方 法
1.背景知识
6.思考问题 5.注意事项
RNA的制备及 纯度的鉴定
2.基本原理 3.仪器试剂
4.工艺过程
背景知识
核糖核酸，简称RNA，主要以单链的形式存在于生物体 内,其高级结构很复杂,它们既担负着储藏及转移遗传信 息的功能,又能作为核酶在细胞内发挥代谢功能。生物体 内共有三种RNA，即编码特定蛋白质序列的信使RNA； 能特异性解读mRNA中的遗传信息、将其转化成相应氨 基酸后加入多肽链中的转运RNA；直接参与核糖体中蛋 白质合成的核糖体RNA。
RNA提取流程
2克动物肝脏组织
加氯仿异戊醇震荡
研碎 加20mlSDS缓冲盐溶液
Hale Waihona Puke Baidu
离心取上清液
加2%乙酸钾乙醇溶液
倒入磨口具塞锥形瓶
放置沉淀离心
加同体积含水酚溶液 室温剧烈震荡10分钟
洗涤沉淀离心干燥
水浴分层并离心
将RNA溶于蒸馏水
得上清液
离心得粗品
二.实验过程
1.取2g动物肝脏组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加 20mLSDS-缓冲盐溶液（见试剂1.）使成均浆，倒入磨口 具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚溶液，室温下剧烈 振荡10分钟。
二、制品的测定 取0.2~0.5ml制品液于试管中，加蒸馏水稀释至2ml，然后加 2ml地衣酚试剂摇匀，于沸水中煮沸15分钟，冷却，测OD670 。根据测得的吸光度，从标准曲线上查出相当该吸光度的RNA 的含量。
三、 RNA含量的计算 根据测得的光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收值的 RNA含量。按下式计算出制品中RNA的百分含量： 样品液RNA含量(ug/ml)=标准曲线查到的值×稀释倍数
RNA质量分数
样品液
RNA 含量（g/mL） 总体积（
新鲜肝重（ g）10 6
mL
）
100
%
操作参照表
管号 0
RNA标 0 准液/ml 蒸馏水 2 /ml 地衣酚 2 试剂/ml
12 34567 0.2 0.4 0.8 1.0 1.2 1.6 2.0 1.8 1.6 1.2 1.0 0.8 0.4 0 22 22222
实验器材与试剂
器材：乳钵 、磨口 具塞锥形瓶 (500ml) 天平 、 离心 机（4000rpm）动物肝脏 、紫外可 见分光度计、恒温水浴锅
试剂：
1.SDS-缓冲盐溶液［0.3%SDS-0.1mol/L氯化钠 -0.05mol/L， pH5.0乙酸盐缓冲液］称取1.5gSDS，2.92g氯化钠，2.05g乙酸钠 溶于水中，用乙酸调至pH5.0，最后定容至 500ml。 2.含水酚液：使用前将苯酚重蒸(酚的沸点为181.8℃)并用SDS－缓 冲盐溶液使其饱和。 3.氯仿-异戊醇液：氯仿：异戊醇=24:1(V/V)。 4.含2%乙酸钾的95%乙醇溶液。 5.75%乙醇，95%乙醇、无水乙醇。 6.乙醚 7.RNA标准溶液（须经定磷确定其纯度）：取酵母RNA配成200 g/mL的溶液。 8.地衣酚试剂：先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸（分析纯）溶液，实 验前用此溶液作为溶剂配成 0.1%地衣酚溶液。
最常用含水的酚溶液除去蛋白质，去污剂和酚均能抑制RNA 酶活力，有利于制备核酸大分子，以酚水两相系统分离 RNA是将细胞或细胞器置于含有SDS的缓冲盐溶液中， 加等体积水饱和的酚，通过剧烈振荡，然后离心形成上层 水相和下层酚相。
实验所用的0.15mol/L缓冲盐溶液系统可使大部分核糖核蛋 白解离，在用酚处理时脱氧核糖核蛋白变性；在低温条件 下，从水相中除去，这样得到的RNA 制品中混杂的DNA 量极低
注意事项
1：在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样品 的完整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避免 剧烈操作
2：在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强 于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋 白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染， 尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污 染更为有效。