细胞凋亡和细胞坏死

(二) 细胞凋亡信号的转导
1.细胞凋亡的诱导因素
.生理活性因子：TNF家族（Fas-L,TNF)、 TGF、神经递质(谷氨酸、多巴胺)、生长 因子撤退、GC等 .损伤相关因子：热休克、病毒感染、自 由基、癌基因、抑癌基因、放射线等 .化疗药物 .毒素：乙醇、β -淀粉样肽
2.细胞凋亡的抑制因素
二.
DNA降解分析
• DNA降解过程的特点： • 1. 发生于凋亡早期，由内源性核酸内切 酶激活引起 • 2. DNA在核小体连接部位断裂，产生 180－200bp为最小单位的单体或寡聚 体片断 • 3. DNA碎片可被细胞膜包裹，形成凋亡 小体
• (一) DNA凝胶电泳 • 原理：凋亡细胞降解产生一系列 规则的DNA片断，其电泳结果呈典型的 “ 梯状带”(ladder)；而坏死或凋亡后 坏死细胞的DNA分解是随机的，产生的 碎片分子量大小不一，在电泳时形成 “ 涂片状”(smear)。 • 普通琼脂糖凝胶电泳、Southern blotting、放射自显影(32PdATP或 32PdCTP连接到DNA片断的3’ 端)
1.DNA的片段化“梯”状 条 带为细胞凋亡主要特 征
2.内源性核酸内切酶激活及其作用
• 由一系列胞内信号转导环节激活， 执行染色质DNA切割
3. Caspase 9 激活，需要通过CARD （caspase-recruitment domain)、Apaf-1、 细胞色素c、ATP等多个因子的参与
(二)细胞凋亡信号的转导 -凋亡信号转导系统特点
① 多样性：不同种类的细胞系统不同 ② 偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶联 ③ 同一性：多因素，共用同一系统触发 ④ 多途性：同一诱导因素启动多条信号转导 途径
㈡细胞凋亡信号的转导
诱导信号
神经酰胺
R R
多途径 SAPK/JNK
NF-kB,JNK/AP-1途径 P53 基因 激活bax or 下调bcl-2
细胞凋亡的检测
随着研究技术的提高和对凋亡的认识不断深 入，检测凋亡的方法已从细胞、染色质到分 子水平日趋完善和成熟。 1.形态学检测
2.DNA降解分析
3.凋亡酶学分析 4.凋亡相关蛋白分析 5.流式细胞分析
一．细胞凋亡的形态学分 析
细胞凋wenku.baidu.com的形态学变化主要表现 为：细胞皱缩(cell shrinkage)，失去细 胞连接(cell junction)，微绒毛 (microvilli)消失，发泡(blebbing)，染色 质浓集并靠近核膜，形成沿核膜收缩的 新月状体(crescents)，形成凋亡小体 (apoptotic body)等。
Caspases在凋亡中的主要作用
1.灭活细胞凋亡的抑制物（如Bcl-2）； 2.水解细胞的蛋白质结构，导致细胞解体，形成凋亡 小体（apoposis boby）； 3.在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白，使该蛋白获 得或丧失某种生物学功能
细胞凋亡的调控
（一）细胞凋亡相关因素
1.诱导性因素 2.抑制性因素
五、流式细胞分析
（Flow Cytometry，FCM）
利用流式细胞仪对处在快速、直线、 流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、 快速定量分析，同时对特定群体加以分选的 现代细胞分析技术。
FCM分析细胞凋亡的方 法
• 一. 细胞形态分析 • 二. 细胞膜结构与功能改变分析 • 三. 细胞DNA含量分析 • 四. TUNEL法
危难中的细胞啊， 你沉稳不乱， DNA片片切割， 化云梯直通天堂； 细胞体分团相聚， 把生命的凝重浓集在小体上； 分别了朝夕相处的伙伴， 再见了快乐美好的时光； 这一切的一切又融入临近的胞体， 腾出的空间再写生命的篇章。
细胞死亡形式
1. 细胞坏死 由于比较强烈的有害刺激 或细胞内环境的严重紊乱而导致的细 胞死亡。 2. 细胞凋亡 由体内外因素触发细胞内 预存的死亡程序而导致的细胞死亡过 程称为细胞凋亡（apoptosis),又称程 序性细胞死亡（programmed cell death,PCD)。
• • •
四.
凋亡相关蛋白分析
• 1. Bcl-2家族 • 促进凋亡：Bax, Bal, Bcl-Xs, Bad, Bid, Bik, Bim, Hrk, Bok等 • 抑制凋亡：Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl1, A1/Bfl-1等 • 均含有BH(Bcl-2 homology)结构域，通过 此结构域以二聚体形式调控凋亡。 • 2. 其他相关蛋白 • p53, Myc, Fas等
可空泡化，内质网腔扩大提供包裹膜）； 3.细胞核变化：核内染色质浓缩边集
空泡化、固缩、出芽、边集、凋亡小体
（apoposis boby）
最早期形态学改变是细胞间的间接 丢失 与邻近细胞脱离并失去微绒毛
胞浆浓缩及核质密度增高
断裂） 凋亡小体
（DNA
识别、吞噬（无
炎症反应）
• 典型的凋亡小体（apoposis boby）：由透亮空泡和不透
2.不该“死”的细胞（如神经元、心肌细胞）死
了，这与老年性痴呆、心肌缺血/再灌注损伤等
发病有关。——细胞凋亡过度
细胞凋亡的过程
1.凋亡信号转导 2.凋亡基因激活
3.细胞凋亡的执行 4.凋亡细胞的清除
凋亡过程及分期
凋 亡 诱 导 因 素
cAMP Ca2+ 神 经 酰 胺 凋 亡 相 关 基 因 激 活
光的浓密的核碎片两部分
组成。
胸腺细胞
正常
凋亡
胸腺细胞
正常 凋亡
细胞凋亡的生化改变
1.DNA的片段化“梯”状条带
2.内源性核酸内切酶激活及其作用
3.凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用
①几乎所有凋亡细胞均有核小体间的裂 解，导致DNA 的断裂； ②DNA降解过程的特异性：不伴有组蛋 白和其它核蛋白的降解； ③染色质在核小体间的裂解是凋亡细胞 和形态改变的基础； ④DNA 片段化是凋亡的“黄金标记”。
• (三) ELISA法 •
原理：以抗组蛋白抗体包被微孔板 壁，加入标本，凋亡细胞的核小体可与 抗体结合，再加入抗-DNA片断-POD复 合物，与核小体中的DNA片断结合，最 后加入POD显色底物，以酶标仪测定光 密度以进行定量分析。
三. 凋亡酶学分析
• 1. 内切核酸酶(endonuclease, DNase) • 种类：DNase Ⅰ （内质网、高尔基体), DNase Ⅱ（溶酶体、胞核)，NUC18（胞核， 胸腺细胞中) 等 • 作用：使DNA断裂成180－200bp或其 倍数的片断 • 激活机制：CAD(caspase-activate DNase) • ICAD(inhibtor of CAD) • 检测：Western Blotting
细胞凋亡的生物学意义
1.发育 从低等动物到高等动物的发育，都存在着 程序性细胞死亡的现象。 2.免疫系统 淋巴细胞发育分化成熟过程中，始终 伴随着细胞凋亡。 3.衰老 细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直接或间 接的联系。 4.损伤与修复 5.肿瘤发生 细胞增殖与死亡的速度平衡失调。 6.病毒致病 病毒表达抗凋亡蛋白。
ROS
mtDNA
cell
㈢ 细胞凋亡相关基因
• 抑制凋亡基因：bcl-2 • 促进凋亡基因： fas，P53 • 双向调控基因： c-myc，bclx
Bcl-2抗凋亡机制
①直接的抗氧化 ②抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质 ③抑制促凋亡的Bax，Bak细胞毒作用 ④抑制Caspases激活 ⑤维持细胞钙稳态
5.DNA电泳 6. 炎症反应
7.凋亡小体 8.基因调控
弥散性降解，电泳呈均一 DNA片状
DNA片段化（180-120bp）,电泳呈 “梯”状条带
溶酶体破裂，局部炎症反应 溶酶体相对完整，局部无炎症反应
无 无 有 有
细胞凋亡的生理和病理意义
1.确保正常发育、生长:指趾间隙形成；
2.维持内环境稳定:组织细胞更新(上皮组织/血
• (二)原位标记法
• TUNEL(TdT mediated dUTP nick end labeling)终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原 位缺口末端标记技术。
• 原理：在TdT的作用下，带有标记物的dUTP 被连接在断裂DNA3’末端，然后通过相应的方 法检测标记物，从而判断是否有凋亡发生。 • 应用范围：石蜡包埋的组织切片、冰冻组织切 片、培养细胞、组织中分离的细胞
细胞凋亡与细胞坏死
细胞凋亡（科普
似秋叶的凋零， 告别生命之辉煌； 那难以计数的攻击、诱导， 轻启着道道程序， 逼细胞步步走向生命的末端； 啊，活性氧处处肆虐， 钙波涛惊石裂岸， 线粒体把生命之光一点一点拧淡;
诗）
细胞凋亡（科普诗）
似秋叶的凋零， 告别生命之辉煌； 那难以计数的攻击、诱导， 轻启着道道程序， 逼细胞步步走向生命的末端； 啊，活性氧处处肆虐， 钙波涛惊石裂岸， 线粒体把生命之光一点一点拧淡;
细胞凋亡的形态学检测方法
检测方法
光学显微镜 相差显微镜 透射电镜 聚焦激光扫 描电镜 扫描电镜 流式细胞仪 缩时摄影术
可鉴定凋亡细胞特征
细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈 细胞发泡、凋亡小体
微绒毛消失、染色质沿核膜分布、新月体状核、 凋亡小体
凋亡细胞内固缩染色质及核碎片定位
细胞膜表面泡状鼓起 低前向散射光(FSC)、高侧向散射光(SSC) 凋亡细胞的形成过程
受 体
死 亡 信 号
Dnase 激活 Capases 激活
巨噬细胞 吞噬细胞 凋亡细胞
诱导期
执行期
消亡期
凋亡时细胞的主要变 化
一、细胞凋亡的形态学改变
1.细胞膜的变化：微绒毛、细胞突起和细胞表面皱褶消失；
胞膜空泡化，内质网不断扩张并与胞膜融合形成芽状突起 （出芽）；
2.细胞质变化：胞质浓缩、细胞器变化（线粒体变大脊增多
细胞凋亡发生机制
（一）氧化损伤
（二）钙稳态失衡 (三) 线粒体损伤
（一）氧化损伤机制
• 氧自由基可破坏机体正常的氧化/还原
的动态平衡，造成生物大分子的氧化
损伤，干扰正常的生命活动，形成严 重的氧化应激状态——后果：诱导细 胞凋亡。
（二）钙稳态失衡引起细 胞凋亡的可能机制
1.激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶(DNase)，降 解DNA链； 2.激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的酰 基转移，在肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋 白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成； 3.激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转 录； 4.Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露出核 小体之间的连接区内的酶切位点，有利于 DNA内切酶切割DNA。
• Caspases的检测
•
•
1. Caspase-3活性测定(FIENA法)
荧光测定免疫吸附法(flurometric immunosorbent enzyme assay, FIENA), caspase-3可作用于连接荧光素的特异底物－乙酰 化天冬氨酸-谷氨酸-颉氨酸-天冬氨酰胺(AcDEVD), 产生发荧光的裂解产物AFC，且 caspase-3活性与Ac-DEVD-AFC分解的量或自 由荧光AFC产生荧光的强弱成正比，故可定量检 测 2. 蛋白印迹法 Caspases作用底物的检测 PARP89kD的检测
细胞凋亡与坏死的比较
坏死
1.性质 2. 诱导因素 3. 生化特点 4. 形态变化 病理性,非特异性 强烈病理性刺激,随机发生 被动过程,无新蛋白合成,不 耗能
凋亡
生理性或病理性，特异性 生理性或较弱病理性刺激,非随机发生 耗能的主动过程，有新蛋白合成
细胞结构全面溶解、破坏、 胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核 细胞肿胀 固缩,膜可发泡成芽,形成凋亡小体
.凋亡相关基因的抑制作用：p53、bcl-2、 bcl-XL等。 .生理性抑制剂：生长因子、细胞外基质、 锌、雄激素、雌激素等 .病毒基因：腺病毒E1B、杆状病毒p35、棒 状病毒IAP、牛痘病毒CrmA、EBV BHRF1等 .药物：Calpain抑制剂、caspases抑制剂、促 癌剂、佛波豆蔻乙脂(PMA)等
细胞/衰老细胞)、生理器官内分泌调控（子
宫产后复员/月经期子宫内膜脱落）、受损
不能修复细胞或突变细胞清除；
3.发挥积极的防御功能：病原微生物的宿主细
胞发生主动凋亡。
细胞凋亡与疾病发生机制的新认识
1.该“
死”的细胞（如肿瘤细胞、自身反应性免疫细胞） 未死，是造成肿瘤、自身免疫性疾病的主要发病机制
之一。——细胞凋亡不足