细胞凋亡和细胞坏死

五、流式细胞分析
（Flow Cytometry，FCM）
利用流式细胞仪对处在快速、直线、 流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、 快速定量分析，同时对特定群体加以分选的 现代细胞分析技术。
FCM分析细胞凋亡的方 法
• 一. 细胞形态分析 • 二. 细胞膜结构与功能改变分析 • 三. 细胞DNA含量分析 • 四. TUNEL法
ROS
mtDNA
cell
㈢ 细胞凋亡相关基因
• 抑制凋亡基因：bcl-2 • 促进凋亡基因： fas，P53 • 双向调控基因： c-myc，bclx
Bcl-2抗凋亡机制
①直接的抗氧化 ②抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质 ③抑制促凋亡的Bax，Bak细胞毒作用 ④抑制Caspases激活 ⑤维持细胞钙稳态
1.DNA的片段化“梯”状 条 带为细胞凋亡主要特 征
2.内源性核酸内切酶激活及其作用
• 由一系列胞内信号转导环节激活， 执行染色质DNA切割
3. Caspase 9 激活，需要通过CARD （caspase-recruitment domain)、Apaf-1、 细胞色素c、ATP等多个因子的参与
受 体
死 亡 信 号
Dnase 激活 Capases 激活
巨噬细胞 吞噬细胞 凋亡细胞
诱导期
执行期
消亡期
凋亡时细胞的主要变 化
一、细胞凋亡的形态学改变
1.细胞膜的变化：微绒毛、细胞突起和细胞表面皱褶消失；
胞膜空泡化，内质网不断扩张并与胞膜融合形成芽状突起 （出芽）；
2.细胞质变化：胞质浓缩、细胞器变化（线粒体变大脊增多
• • •
四.
凋亡相关蛋白分析
• 1. Bcl-2家族 • 促进凋亡：Bax, Bal, Bcl-Xs, Bad, Bid, Bik, Bim, Hrk, Bok等 • 抑制凋亡：Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl1, A1/Bfl-1等 • 均含有BH(Bcl-2 homology)结构域，通过 此结构域以二聚体形式调控凋亡。 • 2. 其他相关蛋白 • p53, Myc, Fas等
(二) 细胞凋亡信号的转导
1.细胞凋亡的诱导因素
.生理活性因子：TNF家族（Fas-L,TNF)、 TGF、神经递质(谷氨酸、多巴胺)、生长 因子撤退、GC等 .损伤相关因子：热休克、病毒感染、自 由基、癌基因、抑癌基因、放射线等 .化疗药物 .毒素：乙醇、β -淀粉样肽
2.细胞凋亡的抑制因素
细胞凋亡的检测
随着研究技术的提高和对凋亡的认识不断深 入，检测凋亡的方法已从细胞、染色质到分 子水平日趋完善和成熟。 1.形态学检测
2.DNA降解分析
3.凋亡酶学分析 4.凋亡相关蛋白分析 5.流式细胞分析
一．细胞凋亡的形态学分 析
细胞凋亡的形态学变化主要表现 为：细胞皱缩(cell shrinkage)，失去细 胞连接(cell junction)，微绒毛 (microvilli)消失，发泡(blebbing)，染色 质浓集并靠近核膜，形成沿核膜收缩的 新月状体(crescents)，形成凋亡小体 (apoptotic body)等。
细胞凋亡的生物学意义
1.发育 从低等动物到高等动物的发育，都存在着 程序性细胞死亡的现象。 2.免疫系统 淋巴细胞发育分化成熟过程中，始终 伴随着细胞凋亡。 3.衰老 细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直接或间 接的联系。 4.损伤与修复 5.肿瘤发生 细胞增殖与死亡的速度平衡失调。 6.病毒致病 病毒表达抗凋亡蛋白。
细胞凋亡与细胞坏死
细胞凋亡（科普
似秋叶的凋零， 告别生命之辉煌； 那难以计数的攻击、诱导， 轻启着道道程序， 逼细胞步步走向生命的末端； 啊，活性氧处处肆虐， 钙波涛惊石裂岸， 线粒体把生命之光一点一点拧淡;
诗）
细胞凋亡（科普诗）
似秋叶的凋零， 告别生命之辉煌； 那难以计数的攻击、诱导， 轻启着道道程序， 逼细胞步步走向生命的末端； 啊，活性氧处处肆虐， 钙波涛惊石裂岸， 线粒体把生命之光一点一点拧淡;
可空泡化，内质网腔扩大提供包裹膜）； 3.细胞核变化：核内染色质浓缩边集
空泡化、固缩、出芽、边集、凋亡小体
（apoposis boby）
最早期形态学改变是细胞间的间接 丢失 与邻近细胞脱离并失去微绒毛
胞浆浓缩及核质密度增高
断裂） 凋亡小体
（DNA
识别、吞噬（无
炎症反应）
• 典型的凋亡小体（apoposis ）氧化损伤
（二）钙稳态失衡 (三) 线粒体损伤
（一）氧化损伤机制
• 氧自由基可破坏机体正常的氧化/还原
的动态平衡，造成生物大分子的氧化
损伤，干扰正常的生命活动，形成严 重的氧化应激状态——后果：诱导细 胞凋亡。
（二）钙稳态失衡引起细 胞凋亡的可能机制
1.激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶(DNase)，降 解DNA链； 2.激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的酰 基转移，在肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋 白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成； 3.激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转 录； 4.Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露出核 小体之间的连接区内的酶切位点，有利于 DNA内切酶切割DNA。
细胞凋亡与坏死的比较
坏死
1.性质 2. 诱导因素 3. 生化特点 4. 形态变化 病理性,非特异性 强烈病理性刺激,随机发生 被动过程,无新蛋白合成,不 耗能
凋亡
生理性或病理性，特异性 生理性或较弱病理性刺激,非随机发生 耗能的主动过程，有新蛋白合成
细胞结构全面溶解、破坏、 胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核 细胞肿胀 固缩,膜可发泡成芽,形成凋亡小体
(二)细胞凋亡信号的转导 -凋亡信号转导系统特点
① 多样性：不同种类的细胞系统不同 ② 偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶联 ③ 同一性：多因素，共用同一系统触发 ④ 多途性：同一诱导因素启动多条信号转导 途径
㈡细胞凋亡信号的转导
诱导信号
神经酰胺
R R
多途径 SAPK/JNK
NF-kB,JNK/AP-1途径 P53 基因 激活bax or 下调bcl-2
.凋亡相关基因的抑制作用：p53、bcl-2、 bcl-XL等。 .生理性抑制剂：生长因子、细胞外基质、 锌、雄激素、雌激素等 .病毒基因：腺病毒E1B、杆状病毒p35、棒 状病毒IAP、牛痘病毒CrmA、EBV BHRF1等 .药物：Calpain抑制剂、caspases抑制剂、促 癌剂、佛波豆蔻乙脂(PMA)等
2.不该“死”的细胞（如神经元、心肌细胞）死
了，这与老年性痴呆、心肌缺血/再灌注损伤等
发病有关。——细胞凋亡过度
细胞凋亡的过程
1.凋亡信号转导 2.凋亡基因激活
3.细胞凋亡的执行 4.凋亡细胞的清除
凋亡过程及分期
凋 亡 诱 导 因 素
cAMP Ca2+ 神 经 酰 胺 凋 亡 相 关 基 因 激 活
• (二)原位标记法
• TUNEL(TdT mediated dUTP nick end labeling)终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原 位缺口末端标记技术。
• 原理：在TdT的作用下，带有标记物的dUTP 被连接在断裂DNA3’末端，然后通过相应的方 法检测标记物，从而判断是否有凋亡发生。 • 应用范围：石蜡包埋的组织切片、冰冻组织切 片、培养细胞、组织中分离的细胞
细胞/衰老细胞)、生理器官内分泌调控（子
宫产后复员/月经期子宫内膜脱落）、受损
不能修复细胞或突变细胞清除；
3.发挥积极的防御功能：病原微生物的宿主细
胞发生主动凋亡。
细胞凋亡与疾病发生机制的新认识
1.该“
死”的细胞（如肿瘤细胞、自身反应性免疫细胞） 未死，是造成肿瘤、自身免疫性疾病的主要发病机制
之一。——细胞凋亡不足
光的浓密的核碎片两部分
组成。
胸腺细胞
正常
凋亡
胸腺细胞
正常 凋亡
细胞凋亡的生化改变
1.DNA的片段化“梯”状条带
2.内源性核酸内切酶激活及其作用
3.凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用
①几乎所有凋亡细胞均有核小体间的裂 解，导致DNA 的断裂； ②DNA降解过程的特异性：不伴有组蛋 白和其它核蛋白的降解； ③染色质在核小体间的裂解是凋亡细胞 和形态改变的基础； ④DNA 片段化是凋亡的“黄金标记”。
危难中的细胞啊， 你沉稳不乱， DNA片片切割， 化云梯直通天堂； 细胞体分团相聚， 把生命的凝重浓集在小体上； 分别了朝夕相处的伙伴， 再见了快乐美好的时光； 这一切的一切又融入临近的胞体， 腾出的空间再写生命的篇章。
细胞死亡形式
1. 细胞坏死 由于比较强烈的有害刺激 或细胞内环境的严重紊乱而导致的细 胞死亡。 2. 细胞凋亡 由体内外因素触发细胞内 预存的死亡程序而导致的细胞死亡过 程称为细胞凋亡（apoptosis),又称程 序性细胞死亡（programmed cell death,PCD)。
细胞凋亡的形态学检测方法
检测方法
光学显微镜 相差显微镜 透射电镜 聚焦激光扫 描电镜 扫描电镜 流式细胞仪 缩时摄影术
可鉴定凋亡细胞特征
细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈 细胞发泡、凋亡小体
微绒毛消失、染色质沿核膜分布、新月体状核、 凋亡小体
凋亡细胞内固缩染色质及核碎片定位
细胞膜表面泡状鼓起 低前向散射光(FSC)、高侧向散射光(SSC) 凋亡细胞的形成过程
• (三) ELISA法 •
原理：以抗组蛋白抗体包被微孔板 壁，加入标本，凋亡细胞的核小体可与 抗体结合，再加入抗-DNA片断-POD复 合物，与核小体中的DNA片断结合，最 后加入POD显色底物，以酶标仪测定光 密度以进行定量分析。
三. 凋亡酶学分析
• 1. 内切核酸酶(endonuclease, DNase) • 种类：DNase Ⅰ （内质网、高尔基体), DNase Ⅱ（溶酶体、胞核)，NUC18（胞核， 胸腺细胞中) 等 • 作用：使DNA断裂成180－200bp或其 倍数的片断 • 激活机制：CAD(caspase-activate DNase) • ICAD(inhibtor of CAD) • 检测：Western Blotting
Caspases在凋亡中的主要作用
1.灭活细胞凋亡的抑制物（如Bcl-2）； 2.水解细胞的蛋白质结构，导致细胞解体，形成凋亡 小体（apoposis boby）； 3.在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白，使该蛋白获 得或丧失某种生物学功能
细胞凋亡的调控
（一）细胞凋亡相关因素
1.诱导性因素 2.抑制性因素
5.DNA电泳 6. 炎症反应
7.凋亡小体 8.基因调控
弥散性降解，电泳呈均一 DNA片状
DNA片段化（180-120bp）,电泳呈 “梯”状条带
溶酶体破裂，局部炎症反应 溶酶体相对完整，局部无炎症反应
无 无 有 有
细胞凋亡的生理和病理意义
1.确保正常发育、生长:指趾间隙形成；
2.维持内环境稳定:组织细胞更新(上皮组织/血
二.
DNA降解分析
• DNA降解过程的特点： • 1. 发生于凋亡早期，由内源性核酸内切 酶激活引起 • 2. DNA在核小体连接部位断裂，产生 180－200bp为最小单位的单体或寡聚 体片断 • 3. DNA碎片可被细胞膜包裹，形成凋亡 小体
• (一) DNA凝胶电泳 • 原理：凋亡细胞降解产生一系列 规则的DNA片断，其电泳结果呈典型的 “ 梯状带”(ladder)；而坏死或凋亡后 坏死细胞的DNA分解是随机的，产生的 碎片分子量大小不一，在电泳时形成 “ 涂片状”(smear)。 • 普通琼脂糖凝胶电泳、Southern blotting、放射自显影(32PdATP或 32PdCTP连接到DNA片断的3’ 端)
• Caspases的检测
•
•
1. Caspase-3活性测定(FIENA法)
荧光测定免疫吸附法(flurometric immunosorbent enzyme assay, FIENA), caspase-3可作用于连接荧光素的特异底物－乙酰 化天冬氨酸-谷氨酸-颉氨酸-天冬氨酰胺(AcDEVD), 产生发荧光的裂解产物AFC，且 caspase-3活性与Ac-DEVD-AFC分解的量或自 由荧光AFC产生荧光的强弱成正比，故可定量检 测 2. 蛋白印迹法 Caspases作用底物的检测 PARP89kD的检测