【CN110184256A】耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910384386.3

(22)申请日 2019.05.09

(71)申请人 齐鲁工业大学

地址 250353 山东省济南市长清区大学路

3501号

(72)发明人 徐振上　王婷　张夙夙　

(74)专利代理机构 济南竹森知识产权代理事务

所(普通合伙) 37270

代理人 朱家富

(51)Int.Cl.

C12N 9/18(2006.01)

C12N 15/70(2006.01)

C12N 15/55(2006.01)

C12P 7/42(2006.01)

C12R 1/225(2006.01)

(54)发明名称

耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用

(57)摘要

本发明公开了一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的

制备方法及其应用，属于生物技术领域。所述耐

热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，包括：步骤1：以

卷曲乳杆菌的DNA为模板，制备含有阿魏酸酯酶

基因的重组大肠杆菌，所述阿魏酸酯酶基因的核

苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；步骤2：将所述重

组大肠杆菌经IPTG诱导发酵，去除菌体，制备得

到阿魏酸酯酶。本发明制备的阿魏酸酯酶的最适

反应条件为65℃和pH 7.0，具有良好的耐热性和

耐碱性特点，使其在造纸、食品、制药与饲料等领

域中具有应用潜力。权利要求书2页 说明书7页序列表2页 附图3页CN 110184256 A 2019.08.30

C N 110184256

A

权　利　要　求　书1/2页CN 110184256 A

1.一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：以卷曲乳杆菌的DNA为模板，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤2：将所述重组大肠杆菌经IPTG诱导发酵，去除菌体，制备得到阿魏酸酯酶。

2.根据权利要求1所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌的步骤包括：

(1)以卷曲乳杆菌的DNA为模板，PCR扩增阿魏酸酯酶基因片段，PCR扩增所使用的上下游引物分别为：

上游引物FaeLcr-F 5′-atacatatgtcccgcgttacaattg-3′

下游引物FaeLcr-R 5′-gcgctcgagaaataatggttttaaaaattg-3′；

(2)将所得阿魏酸酯酶基因片段经NdeI和XhoI双酶切，与相同酶切线性化的表达载体pET-22b(+)连接，构建得到重组表达载体pET-FaeLcr；将重组表达载体pET-FaeLcr转化至宿主菌种大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌。

3.根据权利要求2所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，卷曲乳杆菌的DNA获得方法为：取过夜活化的卷曲乳杆菌菌液1ml，6000rpm,4℃离心3min收集菌体，重悬于567μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)，添加25μL 50mg/ml溶菌酶，混匀，37℃水浴处理1h；加入30μL 10％(质量百分比)SDS、3μL 20mg/ml的蛋白酶K，65℃条件下水浴1h，再加入预冷的氯仿3mL，混匀后离心收集上清；加入等体积预冷的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)溶液，颠倒混匀后离心，取上层水相加入等体积的24：1 (氯仿：异戊醇)，再次离心，取上层水相加入0.6倍体积的预冷异丙醇，室温水浴醇沉1h，离心收集沉淀；最后用70％乙醇清洗沉淀2次，吹干，取40μL TE缓冲液溶解沉淀，即得卷曲乳杆菌DNA。

4.根据权利要求2所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增条件：2×Taq Master Mix 25μL，上下游引物(10μM)各2μL，DNA模板1μL,add ddH2O至50μL；

PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

5.根据权利要求2所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，酶切条件为37℃，3h，酶切体系为：NdeI 5 μL，XhoI 5μL，10×K Buffer 10μL，0.1％BSA 10μL，阿魏酸酯酶DNA/pET-22b(+)质粒DNA 5μg，无菌水补足至100μL；将经过双酶切的阿魏酸酯酶DNA片段和pET-22b(+)载体DNA按照10:1的摩尔比例混合，加入T4 DNA连接酶，16℃过夜连接；将10μL连接产物加入100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰上孵育30min，42℃水浴热激60s，后加入900μL LB液体培养基37℃孵育1h；150rpm将菌液离心去掉上清液800μL，用剩余的菌液重悬菌体，涂布于加有100μg/mL氨苄霉素的LB平板；转化，得到重组大肠杆菌。

6.根据权利要求1所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，将重组大肠杆菌接种至LB液体培养基，37℃过夜培养，取菌液，以1％-2％接种量加入到100mL的LB液体培养基中，37℃培养，生长至菌液OD为0.5-0.8时，加入终浓度0.1-1mM的IPTG，继续诱导发酵16-24h；将诱导表达的大肠杆菌培养液，13000rpm离心10min，去除菌

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