菌种的传代、保藏及菌液

微生物菌种的使用、保存与管理、验证。 微生物菌种的使用、保存与管理、验证。 一.制定菌种使用保藏管理程序 （1）做好菌种的来源登记，确保溯源性 清楚. 清楚. （2）菌种的接收与复活
标准菌种的保藏形式 我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式 包装于熔封的厚玻璃容器中。在这种容器中， 微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须 的环境条件，一般呈休眠状态。
铜绿假单胞菌
形态特征：G 形态特征：G-杆菌、直或微弯、较细长、散在排列、无 芽胞、有荚膜、单端有1 芽胞、有荚膜、单端有1～3根鞭毛。 培养特性：专性需氧，最适温度为35℃，但在42 ℃生 培养特性：专性需氧，最适温度为35℃，但在42 长是铜绿假单胞菌的一个特点。营养无特殊要求，普通 培养基上均能生长，菌落大小不一，扁平湿润，边缘不 齐，可产生各种水溶性色素，故使培养基变为蓝绿色。 在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长，常在其表面形成 菌膜。 分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基 生化反应：氧化酶试验（＋）（培养物呈粉红色渐变为 紫红色） 绿脓菌素试验（＋）（盐酸溶液呈粉红色）
大肠埃希菌—EMB平板菌落形态 大肠埃希菌—EMB平板菌落形态
大肠埃希菌— 大肠埃希菌—显微镜下菌体形态
大肠埃希菌— 大肠埃希菌—电镜下菌体形态
金黄色葡萄球菌
形态特征： G＋球菌、呈单个、成双、短链或排 列呈葡萄串样，无鞭毛、芽胞。 培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在普通营 养琼脂培养基上形成较大的圆形、光滑、湿润、 隆起、边缘整齐、不透明的菌落。菌落因种不同 而出现不同的色素。在营养肉汤培养基中呈均匀 混浊生长。 分离培养：高盐甘露醇培养基 生化反应：血浆凝固酶试验结果：＋ 生化反应：血浆凝固酶试验结果：＋
枯草芽孢杆— 枯草芽孢杆—琼脂平板的形态
枯草芽孢杆— 枯草芽孢杆查—显微镜检查 真菌的分离培养 ⑴.酵母型菌落：是单细胞真菌的菌落。形态与一般 细菌菌落相似，但较大些，菌落表面光滑、湿润、 边缘整齐，有部分单细胞真菌可在培养基中形成 假菌丝，此菌落称为类酵母型菌落。 ⑵.霉菌型菌落：是多细胞真菌的菌落。菌落成棉絮 状、绒毛状、粉末状，并产生不同的色素。 快速显色鉴别培养法：经37℃ 快速显色鉴别培养法：经37℃1～2d就能显示结 2d就能显示结 果。如白色念珠菌呈绿色或蓝绿色菌落，黑曲霉 呈白色丝状菌落，里面呈淡粉红色，一周后逐渐 变成黑色。
培养基的选择
细菌一般用营养琼脂培养基，特别指 出的是生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培 养基加琼脂制成的培养基进行传代。 真菌一般用改良马丁培养基。
菌种的传代
菌种的复苏 菌种的确认 菌种的接种 菌种的保藏
菌种的复苏
《中国药典》2005版规定，所用标准菌种 中国药典》2005版规定，所用标准菌种 的传代次数不得超过5 的传代次数不得超过5代。 从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为 第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种 后为第1代，直至到第3 后为第1代，直至到第3代为工作菌种。
菌种保藏标签的规范与要求 菌种保藏标签的规范与要求
菌种保藏标签必须规范、清晰， 菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏 保藏标签必须规范 的菌种容器表面均应贴有相应的标签， 的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标 签必须字迹清晰可见，应注明： 签必须字迹清晰可见，应注明：菌种的名 称，系列号， 称，系列号，传代次数，接种时间等。一 旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必 处理掉处理过程应记录。
金黄色葡萄球菌— 金黄色葡萄球菌—显微镜下菌体形态
金黄色葡萄球菌— 金黄色葡萄球菌—电镜下菌体形 态
沙门菌
形态特征： G-直 杆菌、无芽胞、无荚膜、多具有 周身鞭毛，能运动。有菌毛。 培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养 琼脂培养基上可生长，形成圆形、光滑、湿润、 半透明、边缘整齐的菌落。在营养肉汤培养基中 呈均匀混浊生长。 分离培养：沙门菌属志贺菌属琼脂(S.S)琼脂培养 分离培养： 培养 基 生化反应：三糖铁琼脂反应：碱/ 生化反应：三糖铁琼脂反应：碱/酸，葡萄糖产 气，H 气，H2S阳性 多价血清凝集试验：阳性
大肠埃希菌
形态特征： G-直短杆状杆菌、无芽胞、有周身鞭毛，能 运动。有菌毛。 培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养 基上生长良好，形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的 菌落。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。 分离培养：伊红美兰培养基（EMB平板） 分离培养：伊红美兰培养基（EMB平板） 生化反应：IMViC试验结果：＋＋－－ 生化反应：IMViC试验结果：＋＋－－ MUG 试验结果：荧光：＋
菌种的传代、 菌种的传代、保藏 及菌液制备
标准菌种的概念及其管理
标准菌种是指由国家授权机构制备的具有 稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌 种。 我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理 委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物 ）管理，涉及药品微生物 检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中 心（CMCC）提供
5.塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼 5.塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼 脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照 上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至 琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从 底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面 顶端，使细菌接种在斜面的表面上。 6.取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上 6.取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上 塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰 上烧灼灭菌。 7.将已接种好的细菌管置35～37℃细菌培养 7.将已接种好的细菌管置35～37℃ 箱培养22 24h，霉菌管置23～28℃ 箱培养22 ～24h，霉菌管置23～28℃霉菌 培养箱培养7 培养箱培养7天。
4.取1支（第二代）冷冻保存管转种于平板 4.取 和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻 保存管（第三代）斜面养基适当温度培养 后作为工作用菌种（第三代） 5.将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将 5.将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将 生长、转种后的第二代菌种灭菌处理。 6.当工作用用菌种代数小于5时，可直接用 6.当工作用用菌种代数小于5 上代工作用菌种转接下代工作用菌（第三 代）可直接 转接第四代，直至四代转为五代。
严格控制菌种的传代
避免频繁购买菌种及复壮等费时、耗力的工作。 1.复溶菌种并转种 按菌种说明书要求复溶所转 1.复溶菌种并转种 菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代） 2.鉴定菌种后制甘油冷冻管 经菌种特性鉴定后， 2.鉴定菌种后制甘油冷冻管 挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管 ， 保存管（为第二代）同时挑取纯菌落接斜面，工 作用菌种（为第三代） 3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于 3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于 试验
和培养条件、保藏方法、储存条件及保存 库址等。
3.在操作过程中，必须严格遵守实验室安 3.在操作过程中，必须严格遵守实验室安 全防护措施规程，采取有效预防措施进行 自我保护。 4.为了防止菌种污染或将污染传播到别处， 4.为了防止菌种污染或将污染传播到别处， 其他部门的人员未经允许不得进微生物实 验室。所有的意外情况，都必须立即向主 管部门报告以便得到及时解决。 5相关记录 在菌种的使用制备与保藏过程 中，应建立菌种制备、保藏和使用的记录 格式。
沙门菌—SS平板菌落形态 沙门菌—SS平板菌落形态
沙门菌— 沙门菌—显微镜下菌体形态
沙门菌— 沙门菌—血清凝集试验结果
枯草芽孢杆菌
形态特征： G＋直杆菌、多呈链状排列，有鞭毛、有芽胞， 位于菌体中心或次极端，不小于菌体。 培养特性：为需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通营 养琼脂培养基上形成较大的圆形或不规则的、表面粗糙、 可有皱褶、菌落下面可形成红色色素的灰白色菌落。在营 养肉汤培养基中形成菌膜, 养肉汤培养基中形成菌膜,很少混浊或不混浊。 分离培养：营养琼脂平板 血琼脂平板
菌种处理的注意事项与有关记录
菌种是特殊的标准品，在一定条件下，许多种类 都是病原菌，这就要求处理菌种时有一些有别于 其他标准品的特殊要求。 1.根据菌株对人和动物的致病力、毒性流行传染 1.根据菌株对人和动物的致病力、毒性流行传染 的危害程度，要实行严密安全的保藏管理。 2.所有的与菌种有关联的事情，例如菌种的接收、 2.所有的与菌种有关联的事情，例如菌种的接收、 检查和保藏等都应有专门的微生物分析员处理和 控制，建立进出账目，填写菌种纪录，纪录内容 包括：菌种名称、编号、来源、形态特征、培养 特性、生化检定、传代次数、最适培养基
菌种的名称
铜绿假单胞菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４］ 生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］ 大肠埃希菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）４４１０２］ 金黄色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］ 沙门菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）５００９４］ 枯草芽孢杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３５０１］ 白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］ 黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３］
3.关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将 3.关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将 管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环 烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧 烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧 灼，往返通过三次。 4.右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口 4.右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口 在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种 环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后 再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将 菌种管口移至火焰上方。
白色念珠菌— 白色念珠菌—显微镜下菌体形态
黑曲霉
形态特征： 单层和双层瓶梗、孢子头球形 放射状、褐至黑色、孢子梗无色至褐色。 培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成 菌落初为白色羊毛状 ，继而黑色或黑褐色， 粗绒状。 分离培养：快速显色培养基
黑曲霉— 黑曲霉—显微镜下菌体形态
黑曲霉— 黑曲霉—电镜下菌体形态
霉菌各种菌落形态
白色念珠菌
形态特征： G＋、圆形或卵圆形、着色不均匀、 在玉米培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子。 培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成灰白色、 表面光滑、带有浓重酵母气味的典型的类酵母菌 落。培养稍久，菌落增大。在改良马丁培养基中 呈沉淀生长。 分离培养：快速显色培养基