柱前衍生化高效液相色谱法测定细胞培养液中的前列腺素E2

’ ’ 前列腺 素 （ >C2 ） 参 与 体 内 多 种 病 理 生 理 过 程， 其含量
的微小变化会产生很大的生理效应差异， 因此准确测 定 生 物 样本中 >C2 的含量具有重要意义。高效液相色谱 , 荧光检测 法 （ =>?@,DE ） 逐渐用于检 测 >C- ! 等 >C2
［$］
节 下 复 溶 后 的 !"" ! ? 乙 腈 溶 液 中 温避光下保存。在 “$* &” 分别加入 % ..() L ? B%FF@ 和 % ..() L ? 双 环 己 基 ,$, , 冠 醚 ,# 的乙腈溶液 +" ! ? ， 再 加 入 无 水 碳 酸 钾 ! .: （文献 ［!］ 中 加入 $ .: ） ， 混匀后避光下在 +" M 水浴中反应 $+ ./# ， 冷 却反应液， 取上清液 &" ! ? 进样测定。 " " &# 标准曲线的制作 ’ ’ 在 $" .? 离心管 中 加 入 空 白 细 胞 培 养 液 ". + .? ， 再加 入经倍比稀释的 >C- ! 储备 液 适 量， 使 >C- ! 对 照 品 的 最 终 质量浓度分 别 为 ". $ ， ". ! ， ". + ， $* "， $. % ， ! * " .: L ? 。 提 取 及 节和 “$* %” 节操作处理。 衍生按照 “$* &”
通讯联系人： 叶笃筠， 男， 教授， 博士生导师， -,."/) ： &01& ( ."/)2* 34.$* 01$* 5#* 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （ +(* &"")"*!* ， &"!""&)&?@,DE 法测定 生 物 样 本 中 >C2 含 量 的 报 道。 本 实 验 采用以 % , 溴甲基 ,) , 甲氧基 , 香豆素 （ B%FF@ ） 为衍生试剂， 碳 酸钾、 双环己基 ,$, , 冠醚 ,# 为催化剂的柱前衍生化 =>?@,DE 法成功地分离并测定了细胞培养液中的 >C- ! 。
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柱前衍生化高效液相色谱法测定细胞培养液中的前列腺素 !!
吴 ’ 涛， ’ 叶笃筠， ’ 张 ’ 力， ’ 周晓燕， ’ 吴’ 萍
（ 华中科技大学同济医学院病理生理学系，湖北 武汉 %&""&" ） 关键词： 柱前衍生化 （ 6%05()$.# 10%/7"3/8"3/(# ） ； 高效液相色谱法 （ 9/:9 60%;(%."#50 )/<$/1 59%(."3(:%"69& ， =>?@ ） ； 前列腺素 -! （ 6%(23":)"#1/# - ! ） ； 细胞培养液 （ 50)) 2$60%#"3"#3 ） 中图分类号： A#+, ’ ’ 文献标识码： B ’ ’ 文章编号： $""" ,,)$& （ !""# ） "$ ,"$"% ,"$ ’ ’ 栏目类别： 技术与应用
收稿日期： !""% ,$! ,$& 第一作者： 吴 ’ 涛， 男， 硕士研究生 *
!# 结果与讨论
! " "# 特异性 ’ ’ 在选定的色谱条件下， 衍生化 后 的 >C- ! 与 细 胞 培 养 液 （ 图略） 。 中其他生理杂质分离良好， 其保留时间为 #. , ./# ! " !# 线性关系及最低检测限 ’ ’ 以 >C- ! 衍 生 物 的 峰 面 积 （ !） 对 >C- ! 的 质 量 浓 度 （ "， .: L ? ）拟 合， 得 线 性 回 归 方 程 为 ! 2 $+ #&, $"$ * + " 3 （ # 2 ". *** ） ， >C- ! 为 ". $ 1 !. " .: L ? 时线性关系良 #%$ ,"& * ! 好。对细胞培养液中 >C- ! 的最低检测限为 ". $ .: L ? 。 ! " $# 回收率及精密度 ’ ’ 在 ". + .? 空白细胞培养基中分别加入适量 的 >C- ! 储 $. " ， !. " .: L ? 。提取 备 液， 使 >C- ! 的最终质量浓度为 ". $ ， 和衍生按照 “ $* & ” 和 “ $* % ” 节 操 作 处 理。 另 用 相 同 浓 度 的 >C- ! 对照品溶 液 不 经 萃 取， 直 接 吹 干 重 溶 后 进 行 衍 生 化， 最后进样测定。 >C- ! 在细胞培养基中的低、 中、 高 & 种浓度 水平下的平均 萃 取 回 收 率 （ $ 2 +） 分别为 （ *". + 4 !$. ) ） J、 （ $"". ! 4 !. % ） J、 （ *+. ) 4 $. * ） J。 ’ ’ 低、 中、 高浓度水平下测定的日内精密度 （ 以相对标准偏 差 （ HKE ） 表示 ） （ $ 2 +） 分 别 为 *. !! J ， #. !" J ， !. *% J ； 日间 分别为 ,. #% J ， $&. !" J ， +. )$ J 。 精密度 （ $ 2 +） ! " %# 细胞样品测定 ’ ’ 将培养细胞分为 空 白 组 （ 用生理盐水处理） 和 ?>K 处 理 组 （ 用 $" ! : L ? 的 ?>K 处 理 ） 。分 别 处 理 !% 9 后 进 行 测 定， ?>K 处理组与空白组的 HGO!#% * ) 细胞培养液 中 >C- ! 含 量 分别为 （ " * !++ 4 " * ",& ） .: L ? 和 （ " * $"+ 4 " * $!# ） .: L ? ； ?>K 处理组的 >C- ! 含量显著高于空白组 （ % 5 " * "$ ， $ 2 $" ） 。 参考文献：
"# 实验部分
" " "# 仪器、 药物与试剂 ’ ’ ’GHIG+ >%(23"% 高 效 液 相 色 谱 仪， 包 括 %$" 自 动 进 样 器、 >%(23"% &#& 荧光检测器、 !&" 泵。 ’ ’ >C- ! 对照 品 （ 纯 度 为 ** J ， B/(.() 公 司 ） ， B%FF@ 、 双 （ K/:." 公 司 ） ； 无 水 碳 酸 钾、 盐 酸、 乙酸乙 环己 基 ,$, , 冠 醚 ,# 酯 （ 均为分析纯， 上海化学试 剂 公 司 ） ； 乙腈 （ 色 谱 纯， 天津科 密欧公司） 。 EF-F 培 养 基 （ =&5)(#0 公 司 ） ， 胎牛血清 （浙 江三利 生 物 制 品 厂 ） ， 脂多糖 （ ?>K ， -2590%/59/" 5()/ "$$$ ： B% ） 。实验用水为双蒸去离子水。 ’ ’ >C- ! 对 照 品 储 备 液 的 配 制： 精 密 称 取 >C- ! 对 照 品 $ .: ， 溶于 $ .? 乙 腈， 充 分 混 匀， 得到 $ :L ? 的对照品储备 液。置于 - !" M 冰箱中保存。 " " !# 色谱条件 ’ ’ N%(."2/) @,$, 反相色谱柱 （ %. # .. /* 1* / $+" .. ，+ ； 流 动 相 为 乙 腈 , 水（ 体 积 比 为 #" 0 %" ） ， 流 速： ". , !.） .? L ./# ； 荧光检测器激发波长 &$& #. ， 发射波长 &)" #. 。 " " $# 细胞样本的制备及前处理 ’ ’ 小鼠巨噬细胞株 HGO !#%* ) （ 购自中国科学院上海细胞生 物学研究所） 用 EF-F 培养液培养在 # 孔培养板 （ $. " / $"# 1 中。 EF-F 中 加 入 $"J 的 胎 牛 血 清、 $"" $. + / $"# 细 胞 L 孔） P L .?青霉素和 $"" P L .? 链霉素， 细胞在 &) M 、 +J @A! 培养 箱中培养， 以 $" !: L ? ?>K 处理， 刺激细胞产生 >C-! 。处理 !% 9 后， 取细胞培养液的上层清液 ". + .?， 于 - !" M 下保存待测。 ’ ’ 取细胞培养上清液 ". + .? 置于 $" .? 离心管中， 于 ! """ % L ./# 速率下离心 $" ./#， 加入 )+ !? $ .() L ? 的 =@) 进行酸 化， 充分混匀后再加入 % 倍体积的乙酸乙酯进行提取， 旋涡混合 & ./#， 于& """ % L ./# 速率下离心 $" ./#， 取乙酸乙酯层并干燥 除水， 于室温下用氮气吹干， 复溶于 !"" !? 乙腈中， 于 - !" M 下 保存备用。测定时， 室温下融化后加入衍生试剂进行衍生化。 " " %# 衍生试剂的配制及衍生化方法 ’ ’ 精密称 取 一 定 量 的 B%FF@ 和 双 环 己 基 ,$, , 冠 醚 ,# ， 分 别溶于适量的乙 腈 中， 使 之 均 为 % ..() L ? 的 乙 腈 溶 液， 低