基因工程试题

武汉大学生命科学学院2006-2007学年度第二学期期末考试<<基因工程>>A试卷姓名学号专业得分答案请写在答题纸上,写在试卷上无效.1.比较在大肠杆菌、植物和动物个体中表达真核生物基因时的优缺点。

(16分)2.谈谈核酸杂交的基本原理，并举例说明Southern blot在基因工程中的应用。

（12分）3.什么叫基因文库？既然基因文库是没有“目录的图书馆”，那为什么要构建基因文库？（10分）4.DNA测序中双脱氧酶法的原理(8分)5. 已知一个克隆在质粒载体上的500bpDNA 外源片段，请设计并用3种标记方法方案来对这个外源片段进行标记。

(18分)6.试述PCR技术的基本原理，如果想通过PCR技术从一个生物基因组中扩增一个约500bp的基因片段，再和载体连接克隆，然后转入大肠杆菌中，请描述其克隆过程（包括检测）。

（18分）7.叙述植物基因枪和农杆菌介导的转化DNA方法的原理，并比较两者的优缺点？（18分）老师给的重点：1.用DNA制备探针标记2.PCR相关问题3.转基因动物的安全性4.重组DNA与空载体自连5.噬菌体/农杆菌为基础的载体与质粒相关特点6.E.coli中高效表达外源真核基因的原理7.植物转基因方法（农杆菌、基因枪...)8.动物转基因技术9.Southern blot原理以及在基因工程中的应用10.PCR克隆in E.coli (PCR从基因组中扩增DNA片段+t载体转入大肠杆菌筛选双抗性蓝白斑菌落）11.比较以大肠杆菌、植物、动物作为外源真核基因表达系统的优缺点12. 用大肠杆菌作为受体细胞表达目的基因的原因1.用DNA制备探针标记。

a.切口平移法：控制DNaseI的浓度，就可以在双链DNA分子的一条链的有限位置上打开切口，形成3-OH末端（这条链即成为引物）。

DNA聚合酶I把一个带有标记物的dNTP就加在这引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性将切除5-单核苷酸，同时依次添加新的核苷酸到3一侧，其结果使切口沿着DNA平移，这就叫切口平移（Nick translation)b.随机引物标记。

能与任何DNA配对互补的一小段DNA序列叫随机引物。

DNA聚合酶klenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。

c.PCR法：标记物的dNTP ,dNTP. 引物（插入片段两端的序列）等扩增合成新的带有标记物的DNA。

d.末端标记法。

用磷酸酶去除DNA末端磷酸，再用磷酸激酶将32P加入DNA末端标记DNA。

2．PCR相关问题。

出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有：必要时重新设计引物。

减低酶量或调换另一来源的酶。

降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。

Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

3．转基因动物的安全性。

1．从基因工程的技术程序看，转基因动物性食品的食用安全性是可以保证的。

首先，转基因技术是把需要转移的目的基因注射到细胞核中，使之与细胞核DNA融合，而这个过程需要很严格的试验条件，这也正是转基因成功率较低的原因之一。

人们所吃的食物除了基因表达出来的蛋白，还包含基因的载体DNA本身，这些物质进入人体消化道之后被分解，即使没有完全分解，基因要进入人体细胞的细胞核并完成与DNA的融合而产生变异，也不会比实验室条件下容易。

其次，转入动物体内的基因都是天然存在的，人们平时的食物中就含有这些基因，用转基因技术只是把这种基因转入其他的动物体内进行生产后再食用，因此，从理论上讲，转基因动物食品是安全的。

但转基因动物性食品对人体健康也可能存在潜在的影响，如上述讲到的过敏原的问题，目的基因产物如果是潜在的过敏原，那么该转基因食品就有可能引起人体的过敏。

2；②转基因动物中的新基因给食物链其他环节造成了无意的不良后果；③。

强化转基因动物的生存竞争性对自然界生物多样性的影响4．重组DNA和空载自连5．噬菌体农杆菌为基础的载体与质粒相关的特点6．涉及三个方面：1强化蛋白质的生物合成（重组质粒的拷贝数，转录水平和翻译速率）；a，启动子。

高水平表达的最佳启动子必须具备的条件：（1）它必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10％-30％；（2）这种启动子应该是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。

B。

使用有效的终止子。

C。

SD序列。

D。

选用偏爱密码子。

E。

增加质粒的拷贝数。

2抑制蛋白质产物降解；以包涵体、分泌蛋白、或融合蛋白形式表达。

3恢复维持蛋白质特异性空间结构。

7．植物转基因的方法1．DNA直接转移法A．化学刺激法B. 电击法C．显微注射法D．脂质体介导法E．基因枪法。

F．微激光束法2．载体介导法。

农杆菌介导法8．动物转基因技术。

1．显微注射法。

在显微操作仪下用极细的微吸管将在体外构建的外源目的基因注射到处于原核时期的受精卵的原核中，外源基因在受精卵繁殖过程中通过DNA的复制而整合到动物基因组中，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体的子宫内继续发育，进而得到转基因动物2．逆转录病毒法。

逆转录病毒法是将外源目的基因和逆转录病毒载体重组，再使之包装成为高滴度病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的。

携带外源基因的反转录病毒DNA依靠逆转录病毒的整合酶及其末端特异性核苷酸序列可以整合到宿主染色体上，经过杂交筛选即可获得含有目的基因的动物。

3．胚胎干细胞法。

将外源目的基因转移到ES细胞中，外源基因整合到ES细胞的基因组中，把ES细胞移入胚泡期的胚胎，再把这样的胚胎移植到假孕的代孕子宫内发育，产生出嵌合体动物，进一步获得生殖系携带外源基因的纯合转基因动物（嵌合体动物之间杂交，筛选出纯合转基因后代）。

4．精子载体法。

它是直接用精子作为外源DNA的载体，精子直接与外源DNA混合培养时，外源DNA可直接进入精子头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。

5．经膜处理的携外源DNA精子的卵母细胞微注射6．体细胞核移植法。

将外源目的基因导入能传代培养的动物体细胞（包括动物成体体细胞、胎体成纤维细胞等），以这些动物体细胞为核供体，通过显微操作或电融合使核供体与相应的核受体（去核的原核胚或成熟的卵母细胞）不经过有性繁殖过程，在体外直接进行重组融合，对重组的胚进行胚胎移植，进而得到带有外源基因的转基因动物。

9．Southernblot 原理及在基因工程中的应用待分析的基因组DNA或其它DNA首先用一种或几种限制性核酸内切酶消化，消化后的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳按照分子量的大小进行分离，凝胶经碱变性处理，将DNA 分子变性成单链，经毛细管作用或物理方法将凝胶中的单链DNA分子从胶上转移到固相支持物上（一般使用的是尼龙膜和纤维素膜）。

然后用标记的DNA或RNA探针对附着于膜上的DNA进行杂交来检测这些被转移的DNA片段，与探针有同源性的DNA片段在膜上的位置可以通过特定的检测方法如放射自显影或显色而显示。

遗传病诊断，DNA图谱分析，检测样品中的DNA及其含量，PCR产物分析等检测重组子。

从基因文库中筛选目的基因。

Southern杂交可以确定外源基因在植物中的组织结构、外源DNA整和的位置及拷贝数、转基因植株F1世代外源基因的稳定性。

10．11．比较一大肠杆菌。

植物，动物作为外缘真核基因表达系统的优缺点。

大肠杆菌：优点结构简单，生理生化和遗传背景知识，尤其是其基因表达调控机制有了清楚的了解；(2)易于大规模培养，成本低廉；（3）经过了遗传改造，已发展为一种安全的基因工程实验系统，拥有各种不同的菌株和载体系列缺点：（1)真核基因具有内含子，所以只能用其cDNA；（2）许多真核生物基因仅在大肠杆菌中合成无特异性空间结构的多肽链；（3）许多真核基因的蛋白质产物，都要经受翻译后的加工修饰，而大肠杆菌缺乏蛋白质加工系统；（4）大肠杆菌内源性蛋白酶易降解外来的真核生物基因所表达的蛋白质分子；（5）大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，痕量的内毒素即可导致人体热原反应。

植物：优点1）可对表达产物进行转译后加工，保持了产物的天然特性。

2）转基因植物中的外源基因可通过植物杂交的方法进行基因重组而达到在植物体内积累多基因的目的。

3）植物表达系统的产物可以直接储存在植物种子和果实中，无需冷连系统设备进行储藏运输，故易于长距离运输和普及推广。

不仅降低了成本且方便。

4）疫苗抗原基因转入可食用的植物后，可供人直接服用或饲喂动物，不需要分离提纯。

这样可节约许多仪器设备，降低生产成本，使用方便。

5）粘膜免疫是病毒性腹泻的免疫保护机制，但在启动粘膜免疫方面尚属难题。

转基因植物细胞是可以启动粘膜免疫的有效途径。

缺点：1）生产周期长。

2）动物：优点：表达产物能充分修饰且具有稳定的生物活性，产品成本低，并可进行大规模的生产；产品质量高，可诱导分泌，易提纯，不污染环境。

缺点：1）转基因动物成功率低2）外源基因在动物基因组中的随机整合，可能会引起宿主细胞基因的插入突变、缺失突变及宿主基因的扩增重排和移位，也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因，从而导致动物表型的改变甚至造成动物不育或死亡。

3）外源基因表达水平不高4）安全性问题12．用大肠杆菌作为受体细胞表达目的基因的原因。

1．结构简单，生理生物背景和遗传背景清楚。

尤其是对其基因表达的调控机制有清楚的了解。

2。

易于大规模培养，成本低廉。

3。

经过遗传改造，已经发展成为一种安全的实验系统。

拥有不同的菌株及载体系列。