基因工程试题

武汉大学生命科学学院

2006-2007学年度第二学期期末考试

<<基因工程>>A试卷

姓名学号专业得分

答案请写在答题纸上,写在试卷上无效.

1.比较在大肠杆菌、植物和动物个体中表达真核生物基因时的优缺

点。(16分)

2.谈谈核酸杂交的基本原理，并举例说明Southern blot在基因工

程中的应用。（12分）

3.什么叫基因文库？既然基因文库是没有“目录的图书馆”，那为什

么要构建基因文库？（10分）

4.DNA测序中双脱氧酶法的原理(8分)

5. 已知一个克隆在质粒载体上的500bpDNA 外源片段，请设计并用

3种标记方法方案来对这个外源片段进行标记。(18分)

6.试述PCR技术的基本原理，如果想通过PCR技术从一个生物基因

组中扩增一个约500bp的基因片段，再和载体连接克隆，然后转入大肠杆菌中，请描述其克隆过程（包括检测）。（18分）

7.叙述植物基因枪和农杆菌介导的转化DNA方法的原理，并比较两

者的优缺点？（18分）

老师给的重点：

1.用DNA制备探针标记

2.PCR相关问题

3.转基因动物的安全性

4.重组DNA与空载体自连

5.噬菌体/农杆菌为基础的载体与质粒相关特点

6.E.coli中高效表达外源真核基因的原理

7.植物转基因方法（农杆菌、基因枪...)

8.动物转基因技术

9.Southern blot原理以及在基因工程中的应用

10.PCR克隆in E.coli (PCR从基因组中扩增DNA片段+t载体转入大肠杆菌筛选双抗性蓝白斑菌落）

11.比较以大肠杆菌、植物、动物作为外源真核基因表达系统的优缺点

12. 用大肠杆菌作为受体细胞表达目的基因的原因

1.用DNA制备探针标记。

a.切口平移法：控制DNaseI的浓度，就可以在双链DNA分子的一条链的有限位置上打

开切口，形成3-OH末端（这条链即成为引物）。DNA聚合酶I把一个带有标记物的dNTP就加在这引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性将切除5-单核苷酸，同时依次添加新的核苷酸到3一侧，其结果使切口沿着DNA平移，这就叫切口平移（Nick translation)

b.随机引物标记。能与任何DNA配对互补的一小段DNA序列叫随机引物。DNA聚合酶

klenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。

c.PCR法：标记物的dNTP ,dNTP. 引物（插入片段两端的序列）等扩增合成新的带有标

记物的DNA。

d.末端标记法。用磷酸酶去除DNA末端磷酸，再用磷酸激酶将32P加入DNA末端标记

DNA。

2．PCR相关问题。

出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

3．转基因动物的安全性。

1．从基因工程的技术程序看，转基因动物性食品的食用安全性是可以保证的。首先，转基因技术是把需要转移的目的基因注射到细胞核中，使之与细胞核DNA融合，而这个过程需要很严格的试验条件，这也正是转基因成功率较低的原因之一。人们所吃的食物除了基因表达出来的蛋白，还包含基因的载体DNA本身，这些物质进入人体消化道之后被分解，即使没有完全分解，基因要进入人体细胞的细胞核并完成与DNA的融合而产生变异，也不会比实验室条件下容易。其次，转入动物体内的基因都是天然存在的，人们平时的食

物中就含有这些基因，用转基因技术只是把这种基因转入其他的动物体内进行生产后再食用，因此，从理论上讲，转基因动物食品是安全的。但转基因动物性食品对人体健康也可能存在潜在的影响，如上述讲到的过敏原的问题，目的基因产物如果是潜在的过敏原，那么该转基因食品就有可能引起人体的过敏。

2；②转基因动物中的新基因给食物链其他环节造成了无意的不良后果；③。强化转基因动物的生存竞争性对自然界生物多样性的影响

4．重组DNA和空载自连

5．噬菌体农杆菌为基础的载体与质粒相关的特点

6．涉及三个方面：1强化蛋白质的生物合成（重组质粒的拷贝数，转录水平和翻译速率）；a，启动子。高水平表达的最佳启动子必须具备的条件：（1）它必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10％-30％；（2）这种启动子应该是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。B。使用有效的终止子。C。SD序列。D。选用偏爱密码子。E。增加质粒的拷贝数。

2抑制蛋白质产物降解；以包涵体、分泌蛋白、或融合蛋白形式表达。

3恢复维持蛋白质特异性空间结构。

7．植物转基因的方法

1．DNA直接转移法

A．化学刺激法

B. 电击法

C．显微注射法

D．脂质体介导法

E．基因枪法。

F．微激光束法

2．载体介导法。

农杆菌介导法

8．动物转基因技术。

1．显微注射法。在显微操作仪下用极细的微吸管将在体外构建的外源目的基因注射到处于原核时期的受精卵的原核中，外源基因在受精卵繁殖过程中通过DNA的复制而整合到动物基因组中，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体的子宫内继续发育，进而得到转基因动物

2．逆转录病毒法。逆转录病毒法是将外源目的基因和逆转录病毒载体重组，再使之包装成为高滴度病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的。携带外源基因的反转录病毒DNA依靠逆转录病毒的整合酶及其末端特异性核苷酸序列可以整合到宿主染色体上，经过杂交筛选即可获得含有目的基因的动物。

3．胚胎干细胞法。将外源目的基因转移到ES细胞中，外源基因整合到ES细胞的基因组中，把ES细胞移入胚泡期的胚胎，再把这样的胚胎移植到假孕的代孕子宫内发育，产生出嵌合体动物，进一步获得生殖系携带外源基因的纯合转基因动物（嵌合体动物之间杂交，筛选出纯合转基因后代）。

4．精子载体法。它是直接用精子作为外源DNA的载体，精子直接与外源DNA混合培养时，外源DNA可直接进入精子头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。