α-淀粉酶产生菌株(细菌)的分离纯化及检测共22页
土壤中产α-淀粉酶菌株的分离和筛选
大理学院学报JOURNAL OF DALI UNIVERSITY 第12卷第10期2013年10月Vol.12No.10Oct.2013［DOI］10.3969/j.issn.1672-2345.2013.10.011α-淀粉酶（α-amylase），编号：EC3.2.1.1，作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，是一种只能催化水解直链淀粉的液化酶〔1〕。
通常采用酶活力（enzyme activity）来表示酶催化一定化学反应的能力〔2〕。
一般情况下，α-淀粉酶的作用温度范围60~90℃，最适宜作用温度为60~70℃，作用pH值范围5.5~7.0，最适pH值为6.0。
α-淀粉酶主要存在于人的唾液和胰脏中，也存在于麦芽、蟑螂涎腺、芽孢杆菌、枯草杆菌、黑曲霉和米曲霉中。
α-淀粉酶酶制剂大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，占酶制剂市场份额的25%左右〔3-4〕。
目前，工业生产上都以微生物发酵法大规模生产α-淀粉酶，最常用的方法是从自然界中筛选出可以产这种酶的目的菌种，大致可以分为以下4个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定〔5-6〕。
土壤是微生物生活的大本营，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到期望中的菌株，再对菌株进行发酵培养，生产出所需的酶〔7〕。
由于我国的α-淀粉酶制剂的品种和生产菌株都很单一，α-淀粉酶酶活力相对于国外同行业的较低〔8〕。
本研究旨在从富含淀粉类物质的土壤中分离纯化出产α-淀粉酶的菌株，通过水解圈直径和菌落直径的比值，结合酶活力大小进行比较，筛选出产酶活力较强的菌株，并对其所产的酶进行初步的酶学性质研究。
研究结果可为α-淀粉酶的生产提供种质资源，同时也为生产实践提供数据支持和理论参考。
1材料土壤中产α-淀粉酶菌株的分离和筛选杨杨，刘毕琴，张发，廖光辉，杨晓燕*（大理学院农学与生物科学学院，云南大理671003）［摘要］目的：从土壤中筛选产α-淀粉酶活力较强的菌株并对其酶学性质进行初步研究。
《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计
产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1. 掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2. 巩固十倍稀释法。
二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。
因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。
主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。
淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。
产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。
三、实验材料1. 菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2. 土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3. 培养基：淀粉液体培养基（50mL）：蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉0.1g，蒸溜水50mL。
淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl 1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉0.4g，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。
牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl 1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2。
4.其他用品：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各一个），电子天平、三角烧瓶（5个）、试管（10支）、培养皿（15个）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、无菌水（200mL）、微波炉、卢戈氏碘液。
四、试验方法1．样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。
（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2．富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。
用一支1mL的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37℃，培养24h。
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。
但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。
从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。
平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。
本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。
二、分离及纯化1、材料试剂:营养琼脂、淀粉、土壤、碘液等器皿：移液管、培养皿、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、接种环等仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱其他：报纸、纱布、棉花、面线绳2、方法2.1培养基与器皿的准备和灭菌（1）培养基的配制称量1.2克淀粉。
加少量水加热溶化，然后加入6.8克营养琼脂，加水至150毫升，煮沸后倒入250ml容量的三角瓶中，加棉塞后放入高温蒸汽灭菌锅内灭菌备用。
（2）无菌水的制备分别取9ml蒸馏水加入5支试管中，加塞后用报纸包扎捆绑，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌备用。
取90ml蒸馏水加入250ml三角瓶中，同样的操作，灭菌备用。
（3）器皿的准备将刻度吸管用报纸包扎，培养皿装入专用灭菌杯分别放入高温灭菌箱灭菌备用。
2.2菌悬液的制备和梯度稀释取10g土壤样品加入90ml无菌水中震荡, 然后静置2分钟。
取六只试管编号1—6分别加入9ml无菌水，从菌悬液中取1ml 上清液加入1号管后震荡摇匀，然后再从1号管中取1ml加入2号管震荡摇匀，依次操作六个试管，得到10ˉ1—10ˉ6六个稀释度的菌悬液。
土壤中产淀粉酶菌株的分离纯化及鉴定
土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一实验目的1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。
2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。
3．掌握分离纯化微生物的方法。
4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。
二实验原理在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。
在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。
24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。
然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。
枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。
三实验器材与材料3.1 实验仪器：培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3个，100ml 6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。
高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。
3.2 实验材料：1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。
2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml3.3 ：其它棉花、棉绳、纱布等3.4土壤采集：采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点土样采集时间：2012年5月12日土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围四实验步骤4.1 实验流程：配制培养基→土样采集→制备菌悬液→菌株的初选（涂布平板）→鉴定→平板划线纯化→选育→筛选高产淀粉酶菌株4.2初选：4.2.1 淀粉培养基的配制分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。
产淀粉酶菌株的分离和筛选
产淀粉酶菌株的分离及筛选摘要：【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。
2了解产淀粉酶菌株的分离方法。
3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。
【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂.。
【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。
2了解产淀粉酶菌株的分离方法。
3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。
【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域。
在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程均有重要价值，如添加高温淀粉酶可提高啤酒质量，中温蒸煮条件下添加适当耐高温a-淀粉酶可提高糖化率及酒精出酒率，降低甲醇含量，提高酒精质量，同时可提高设备利用率等。
淀粉酶在面包焙烤过程中分解淀粉产生的可溶性糖被酵母转化成酒精和CO2气体，不仅能增加面包体积，同时还有改善面包表皮色泽、提高面包软度、延长保质期的作用，对面包冷却和冷冻也有重要作用。
由于微生物数量多，繁殖快，工业生产主要采用向生物发酵法大量生产该制剂。
本实验从土壤中分离的淀粉酶产生菌从温度、pH值两方面探讨其产酶的最适条件。
通过平板培养法，从样品中初步分离出淀粉产生菌株，再通过单菌落培养从而获得比较纯的菌种。
然后对其进行二级扩大培养，最终测定液体培养基菌液中被酶分解得到的葡萄糖含量来讨论菌株的最适条件（温度、pH值等），为工业街道淀粉酶及饲料添加剂提供候选菌株。
【仪器、材料和试剂】（一）仪器1、恒温培养箱2、高压蒸气灭菌锅3、摇床4、恒温水浴锅5、生物显微镜6、电子天平（二）材料样品一：存放过久发霉的麦芽和周围粉尘样品二：米饭生产线附近草坪上的土壤（三）试剂与器材1、锥形瓶（50ml、100ml、500ml等）2、培养皿（25个左右）3、大小试管（30个左右）4、移液枪（1000μl、100μl）及大小枪头若干5、酒精灯、接种针等6、牛肉膏或酵母膏7、蛋白胨8、NaCl9、可溶性淀粉10、琼脂11、卢戈氏碘液11、草酸铵结晶紫12、碘液13、95%酒精14、蕃红染色液15、蒽胴试剂（现配）16、葡萄糖标准液(0.1 g/L)实验环节1 产淀粉酶菌株的初筛【实验步骤】1、称取一个样品5g，倒入盛有45mL无菌水带塞的三角锥形瓶中，摇床振荡30min制成样品悬液记为10-1土壤稀释液；2、用无菌移液管吸取10-1的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中吹吸数次混匀即为10-2稀释液，照此方法分别制成10-2~10-9稀释液；3、分别取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9土壤稀释液各0.5mL，涂布于平板培养基表面，一个稀释度涂布接种2块平板，37℃下恒温培养16h ；4、待长出菌落后滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，作为初筛菌株。
阿尔法淀粉酶产生菌的筛选
实验7-1 α-淀粉酶产生菌的筛选1目的要求掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种产酶微生物的完整操作步骤。
2实验原理α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶它的产生菌广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。
本实验利用淀粉与碘的显色反应，采用变色圈法筛选α-淀粉酶的产生菌。
3实验器材3.1 实验材料（1）分离培养基（g/L）蛋白胨10，NaCl 5，牛肉膏5，可溶性淀粉2，琼脂15，pH 7.2。
需注意的是先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状，再加到溶化好的培养基中，调匀。
（2）麸曲培养基麸皮7 g，玉米面1 g，（NH4)2SO4 0.04 g（4 %（NH4)2SO4加1 mL）；NaOH 0.08 g（8 % NaOH 加l mL），水10 mL，混合均匀，装入250 mL三角瓶中，121 ℃灭菌30 min。
3.2 试剂（1）Lugol氏碘液：碘1 g，碘化钾2 g，水300 mL。
配制时先将碘化钾溶于5～10 mL 水中，再加入碘，溶解后定容。
（2）碘原液：碘2.2 %，碘化钾0.4 %，加水定容。
（3）标准稀碘液：取碘原液15 mL，加碘化钾8 g，水定容至200 mL。
（4）比色稀碘液：取原碘液2 mL，加碘化钾20 mg，定容至500 mL。
（5）0.2 % 可溶性淀粉液：称取0.2 g可溶性淀粉，先以少许蒸馏水混合，再徐徐倾入煮沸蒸馏水中，继续煮沸2 min，冷却，加水至100 mL。
（6）磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH 6.0：称取Na2HPO4•12H2O 11.31 g，柠檬酸2.02 g，加水定容至250 mL。
（7）标准糊精液：称取0.3 g糊精，悬浮于少量水中，再倾入400 mL沸水中，冷却后，加水稀释至500 mL。
冰箱存放。
3.3 实验仪器小铁铲和无菌纸或袋，无菌水三角瓶（300 mL的瓶装水至99 mL，内有玻璃珠若干），无菌吸管（1 mL、5 mL等），无菌水试管（每支4.5 mL水），无菌培养皿。
淀粉酶的提取-α-淀粉酶的提取、分离及测定
α-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：试验一、色谱分离淀粉酶1.1 试剂及设备离子交换树脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计α-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chroma togra phy)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。
20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。
到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromat ograp hy, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。
但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。
20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。
自20世纪40年代以来以Mart in 为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。
20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。
而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。
α-淀粉酶产生菌株(细菌)的分离纯化及检测
1、菌落周围有透明圈 2、菌落粗糙、颗粒感强、 边缘不整齐、有丝状感 （正反面）
32℃培养 24hr
仔细观察 生长菌落
有无透明 圈（有）
选择12个单 菌落，编号
点接于平板 相应区域
加入检测 碘液显色
测量透明圈 和菌落直径
计算D/d比 值（排序）
选择最好 3-4株菌种
划线接种 斜面
培养好后冰 箱保存备用
本次实验基本流程
准备工作 灭菌 制备分离 用平板 冷却99mL 无菌水 加入分离 样品振荡
十倍梯度 稀释涂布 平板分离
培养
菌落计数 挑菌点接 平板培养 测量透明 圈及菌落 直径 需要留下 培养 留于以后 的，挑于 实验用 斜面保存
平板点接检测流程 （尽量不要打开平板，无菌操作）
平板底部 “十字”划 分 四区域对 应编号
第二种 分离和检测用平板培养基 ——300mL/组
可溶性淀粉 30g； Na2HPO4 .12H2O 8g； （NH4）2SO4 4g； NH4Cl 1.5g； 3%豆粕粉浸出液 1000mL 琼脂 20g 121.3℃灭菌20分钟 注：如果还想使用自已组的设计培养基或其它培 养基也可以。 每组200mL培养基制备10个平板。
记录结果 填表计算
1、测量透明圈直径 2、测量菌落直径 3、计算透明圈与菌落直径比值（D/d） 4、根据D/d值大小排序（挑取4株于 斜面培养后备用）
平板菌落计数
总菌落数 计数 有透明圈 菌落计数
记录结果 填表计算
平板放入 冰箱保存
根据碘液 检测结果
挑取单菌 菌于斜面
清洗干净 平板（字）
1、细菌总数 2、产淀粉酶的菌数 3、产淀粉酶菌株占总菌数的比例
α-淀粉酶产生菌的分离筛选及酶学性质研究
安徽农业科学１６０ｒ／ｖａｉｎ摇床培养１２ｈ／’种子液以１０％的接种量接种于产酶发酵培养基上，３７℃、１６０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２４ｈ后发酵液５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液测酶活力。
选取酶活力较高的菌株作为试验菌种。
１．４．Ｌ３酶活力的测定一１。
仅一淀粉酶能将淀粉水解为长短不一的短链糊精和少量的还原糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应逐渐消失，可以用这种显色消失的速度来衡量酶的活力。
用ＹｏｕｎｇＪ．Ｙ００改良法：取５ｒＩｌｌ０．５％可溶性淀粉溶液，在４０℃水浴中预热１０ｍｉｎ，然后加入适当稀释的酶液０．５ｍｌ，反应５ｍｉｎ后用５Ｉｌｌｌ０．１ｍｏｌ／ＬＨ２Ｓ０４溶液终止反应。
取０．５ｍ１反应液与５ｌＩｌｌ工作碘液显色，在６２０ｎｍ波长处测光密度。
以０．５ｍｌ水代替０．５ｒＩｌｌ反应液为空白，以不加酶液（加相同的水）的管为对照。
，酶活力单位定义为：在４０℃、５ｖａｉｎ内水解ｌｎ蟮淀粉（０．５％淀粉）的酶量为１个活力单位。
酶活力计算公式如下：酶活力（ｕ／ＩＩｌｌ）＝（民一Ｒ）／ＲｏＸ５０ＸＤ式中，尺。
、Ｒ分别为对照、反应液的光密度；Ｄ为酶的稀释倍数，调整Ｄ使（Ｒ一尺）／民在０．２～０．７。
１．４．２酶学性质的研究。
１．４．２．１酶反应最适温度的确定。
设置４０、６０、８０℃３个温度梯度，测定反应体系在不同温度下的酶活力，确定酶反应的最适温度。
１．４．２．２酶反应最适ｐＨ值的确定。
用不同的缓冲液设置ｐＨ值为４、６、ｌＯ３个梯度值，测定反应系在不同ｐＨ值下的酶活力，确定酶反应的最适ｐＨ值。
１．４．２．３ｃａ２＋对酶热稳定性的影响。
在１００℃下调整酶液中Ｃａ２＋的不同浓度，测定不同时间Ｆ的酶活力，确定ｃｄ＋对酶热稳定性的影响。
２结果与分析２．１Ｏｒ＂淀粉酶生产菌株的分离筛选２．１．１初筛结果。
采用碘熏法从淀粉筛选平板｝＝挑出ｌＯ株有明显淀粉水解圈（图１）的菌株。
图１菌种的水解圈Ｆｉｇ．１Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｃｉｒｃｌｅｏｆｓｔｒａｉｎ２．１．２复筛结果。
耐酸性α-淀粉酶产生菌的分离筛选
耐酸性α-淀粉酶产生菌的分离筛选耐酸性α-淀粉酶是一种可以在较低的pH值条件下水解淀粉的酶类，其最适pH值为4-5，而普通α-淀粉酶的最适pH值为6.0左右，由于其显著的耐酸性被广泛应用于青贮饲料、酿造、药物生产等多种领域。
我国传统的白酒酿造是固态发酵，其特点是边糖化边发酵，随着发酵的进行，可发酵性糖不断被利用，酸度不断降低，导致普通α-淀粉酶活性也随之降低，淀粉水解不彻底，造成原料利用率低下，发酵周期延长。
耐酸性α-淀粉酶因其能在极端酸性环境中保持较高的活性受到酒类酿造企业的广泛关注翻。
国外对耐酸性α-淀粉酶的研究比较早，发现产耐酸性α-淀粉酶的菌株多为芽孢杆菌和曲霉；我国开展相关研究起步较晚，目前主要集中在菌种选育和构建基因工程菌等方面。
鉴于此，本试验从酒曲中筛选一株产耐酸性α-淀粉酶的菌株。
1材料与方法1．1材料1．1．1样品来源酒曲。
1．1．2试剂与培养基（1）缓冲液：pH4.0的醋酸一醋酸钠缓冲液。
（2）底物溶液：用缓冲液配制1％可溶性淀粉溶液。
（3）碘液：称取碘0.5g、碘化钾5.0g，定容至100mL，取1mL，再定容至100mL。
（4）富集培养基：蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏5g，葡萄糖2g，蒸馏水1000mL，pH4.0。
（5）平板分离培养基：蛋白胨10g，NaCI 5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH4.0。
（6）种子培养基：同富集培养基。
（7）固态产酶培养基：麸皮8g，豆饼粉2g，MgCl2 0.1％，水10mL。
（9）斜面保藏培养基：蛋白胨10g，NaCI 5g，牛肉膏5g，葡萄糖2g，蒸馏水1000mL, 琼脂15g，pH4.0。
培养基都在121℃灭菌20min。
1．2试验方法1．2．1耐酸性α-淀粉酶产生菌株的筛选初筛：称取1g酒曲放到装有25mL富集培养基的三角瓶中，30℃、150r／min摇床培养24h。
将富集培养液用无菌水梯度稀释，取一定量涂布于平板分离培养基，30℃培养3d，在平板上喷洒碘液，将有透明圈的单菌落挑出，进一步划线分离后，挑至斜面上保存。
一株产酸性α-淀粉酶产生菌的分离鉴定及所产酶学特性的初步研究
一株产酸性α-淀粉酶产生菌的分离鉴定及所产酶学特性的初步研究张大为，张洁，王能强，梁芳（湖南科技大学生命科学学院，湖南湘潭 411201）摘要：从食醋厂内土壤中分离得到一株产酸性α-淀粉酶能力较强的菌株，通过形态学和ITS区基因序列分析的手段对其进行鉴定，对其生长温度及发酵液初始pH值等生物学特性进行分析，并对其所产酶的特性进行研究，研究结果表明：通过形态学及分子生物学鉴定为黑曲霉，并命名为Aspergillus niger ZTL；菌株最适生长温度为35 ℃；最适产酶温度为40 ℃；最适生长pH值为6.0，最适产酶pH值为5.0；所产α-淀粉酶在pH值4.5~7.0时酶活性保持在80%以上；该酶的最适作用温度范围是40~50 ℃；通过测定该酶的热稳定性表明，在40~50 ℃时酶较稳定，但在60 ℃时保温一段时间后，酶稳定性显著下降；Ca2+对该酶有一定的激活作用，Na+对该酶的活性作用不明显，而Mg2+、Fe2+和Cu2+对酶的活性均有比较明显的抑制作用；该酶的Km值为4.52×10-3g/L。
从而确定该菌株所产的α-淀粉酶具有具有很大的开发价值。
关键词：淀粉酶；黑曲霉；鉴定；酶学；特性文章篇号：1673-9078(2015)2-93-99 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.2.017 Isolation, Identification and Preliminary Enzymology of an Acidicα-Amylase-producing FungusZHANG Da-wei, ZHANG Jie, W ANG Neng-qiang, LIANG Fang(College of Life Science, Hunan University of Science and Technology, Xiangtan 411201, China) Abstract: An acidic α-amylase-producing fungal strain was isolated from the soil near a vinegar factory and was identified by morpholog y and ITS sequence analysis. Growth characteristics such as growth temperature and pH of the initial fermentation solution as well as the characteristics of the enzyme produced by this strain were examined. The strain was identified as Aspergillus niger and was named Aspergillus niger ZTL. The optimal growth and enzyme-producing temperatures were determined as 35 ℃and 40 ℃, respectively, while optimum growth and enzyme-producing pH values were 6.0 and 5.0, respectively. The activity of α-amylase produced was above 80% within the pH range of 4.5 to 7.0. The optimum functional temperature range was between 40 ℃and 50℃, and the enzyme was stable within this range, as determined by thermal stability analysis. Additionally, the enzyme stability decreased significantly when kept at 60 ℃for some time. The enzyme was activated by Ca2+ to some extent and inhibited by Mg2+, Fe2+, and Cu2+, while Na+ showed no obvious effect. The K m value was 4.5×10-3 g/L. These results indicate that α-amylase produced by the strain isolated in this study has potential development value.Key words: amylase; Aspergillus niger; identify; enzymology; characteristics从古至今，我国都是世界上的农业大国，主要粮食作物的产量在世界上同样是名列前茅。
_淀粉酶产生菌的分离筛选与诱变选育
Animal Husbandry and Feed Science
2010 ，31 （9 ）:1-3
α- 淀粉酶产生菌的分离筛选与诱变选育
刘雅琴，陈海魁，孔令全 （北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏 银川 750021）
摘要：从土样、水样和面样中分离产 α-淀粉酶的芽胞杆菌，对 3 个样品进行淀粉平板分离和革兰氏染色 、芽胞染色，选
①土样照片
第9期
刘 雅 琴 等 ：α-淀 粉 酶 产 生 菌 的 分 离 筛 选 与 诱 变 选 育
3
③面样：菌落与土样、水样基本类似，只是在菌落中心 有蜡样圆心小斑。 2.2 产 α-淀粉酶菌株的筛选结果 土样、水样和面样 3 个 样品中分离出产淀粉酶的芽胞杆菌， 利用淀粉平板共分离 出 64 株单菌落，经稀碘液染色有水解圈且显微镜下观察和 芽胞染色后， 选出具有产淀粉酶能力的芽胞杆菌 47 株，筛 选 出 有 较 大水 解 圈 的 10 株 ， 其 中 ， 土 样 4 株 （菌 株 编 号 Ty1~Ty4）、面样 3 株（菌株编号 My1~My3）和水样 3 株（菌株 编号 Sy1~Sy3）。 10 株菌的菌圈比（即 HC 比值）见表 1。
外酸性淀粉酶还可应用于青贮饲料发酵饮料废液的处理等多种领域近年来我国酶制剂工业蓬勃发展品种和产量也不断增加但是同国外酶制剂行业相比尚有一定的差距我国淀粉酶剂型品种和生产菌株都很单一由于我国淀粉资源丰富淀粉酶应用范围广泛淀粉酶工业发展也必将促进我国其他工业的迅速发展为了适应经济发展的需要应进一步扩大淀粉酶的产量和品种通过对淀粉酶生产菌进行分离筛选将有助于发现因此该研究从富含淀粉的地方采集面样土样水样进行试验以期获得在某些方面性能优良如耐高温耐强酸耐强碱等的粉酶生产菌从而为将来改良淀粉酶生产菌以及满足不同行业的需要奠定理论基础材料与方法11培养基和菌种淀粉培养基g可溶性淀粉mpa灭菌min产淀粉酶发酵培养基
高产淀粉酶菌株的分离鉴定及酶学性质研究PPT课件
06
结论
研究成果总结
确定了该菌株的最佳生长条件，包括温度、pH 和培养基成分。
通过基因工程技术对菌株进行改造，提高了淀粉酶的 产量和性能。
成功分离出高产淀粉酶的菌株，经过鉴定为革 兰氏阳性菌。
酶学性质研究表明，该菌株产生的淀粉酶具有较 高的活性和稳定性，适用于多种淀粉类物质的降 解。
对实际生产的指导意义
针对市场需求，研究开发具有 更高活性和稳定性的淀粉酶突 变体，提高产品的竞争力。
谢谢观看
菌株分离方法
采用适当的培养基和培养条件， 通过划线分离、涂布分离、稀释 分离等方法，将菌株从样本中分 离出来。
分离得到的菌株鉴定
形态学鉴定
观察菌落的形状、大小、颜色、 质地等特征，以及菌体细胞的形 态、染色反应等，初步确定菌株 的分类地位。
生化鉴定
通过测定菌株对碳源、氮源、维 生素等物质的利用以及产生的代 谢产物，进一步确定菌株的分类 学特征。
高产淀粉酶菌株的分离鉴定及酶学 性质研究ppt课件
目录
• 引言 • 高产淀粉酶菌株的分离 • 酶学性质研究 • 菌株遗传特性研究 • 实验结果与讨论 • 结论
01
引言
研究背景与意义
淀粉酶在食品、造纸、纺织等工业领 域具有广泛应用，因此高产淀粉酶菌 株的分离鉴定及酶学性质研究具有重 要的实际意义。
酶活力的测定
在确定的发酵条件下，测定菌株产淀粉酶的 活力，为后续的酶学性质研究提供依据。
03
酶学性质研究
酶活力的测定
酶活力定义
酶活力是指酶催化特定化学反应的能 力，通常以单位时间内底物消耗或产 物生成的量来表示。
酶活力测定方法
通过在一定条件下，测定酶促反应的 初速度来计算酶活力，常用的方法有 紫外可见吸收法、荧光法、电化学法 等。
淀粉酶产生菌的分离
7
2(2.0 %) 1
0 1
1
01
酶活力测定取稀释的粗酶液也按照下表中七号管的要 求配置混合液，测得吸光度后，在标准曲线上查出相
应的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量。
02
酶活力测定： 酶活力以每毫升粗酶液在40摄氏度，
pH6.0的条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。
淀粉产生菌的筛选：
演讲完毕，感谢观看
酶活力测定：
选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培 养，将菌溶于5ml无菌生理盐水中， 吸取此培养液加入淀粉培养液中， 30摄氏度摇瓶培养72h。
酶液稀释： 取发酵液进行 4000r/min离心5min，取上清液， 用缓冲液适当稀释。
标准曲线制作： 准备七支试管，按照下 表配置混合液。使用分光光度计策规定 各管溶液在660nm下的OD值。然后以 淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标， 做标准曲线。
管号
1
2
3
4
5
6
淀粉稀释液/ml
2(0 %)
2(0.2 %)
2(0.5 %)
2(1.0 %)
2(1.5 %)
2(2.0 %)
缓冲液/ml
1
1
1
1
1
1
40摄氏度水浴保温5min
蒸馏水/ml
1
1
1
1
1
粗酶液/ml
0
0
0
0
0
0
40摄氏度水浴保温30min，然后放入沸水浴5min
稀碘液/ml
1
1
1
1
1
1
0 种产淀粉的能力。
2
实验器材料及试剂： 材料：河南科技学院花园土壤。 培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏 3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中， 再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min， 待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板） （2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝 酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸 镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调 整pH值到7.2～7.4。） （3）摇瓶培养：淀粉培养液。
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化
Admin [选取日期]土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一、实验目的1、掌握从土壤中分离产淀粉酶菌株的方法2、掌握平板法分离与纯化微生物的技术3、进一步熟练和掌握无菌操作技术二、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。
但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。
从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。
平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。
本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。
分离得到的单个菌落还要进行性能的筛选,分为初选和复选.三、实验材料样品:张掖市甘州区青松村面粉厂周围采集的土样若干试剂:营养琼脂、淀粉、土壤、碘液等仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱 .移液管、培养皿、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、接种环等液体培养基:淀粉10 g、硫酸铵10 g、氯化钠5 g、硫酸0.5 g、磷酸氢二钾1 g、牛肉膏1 g，定容1 L四.实验步骤(一)培养基的配置1.称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。
牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。
2．溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。
待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，应控制火力并需不断搅拌,以防琼脂糊底烧焦。
a-淀粉酶高产菌株筛选实验
a-淀粉酶高产菌株的分离鉴定及固定化枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，是a-淀粉酶高产菌株之一，其菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
可利用蛋白质、多种糖及淀粉，在遗传学研究中应用广泛。
其芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
广泛生长在中性的的含淀粉多的环境中，如富含淀粉的面粉厂、土壤等。
淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。
淀粉酶家族包括α- 淀粉酶、β- 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。
α-淀粉酶为内切酶，以无规则的方式切开淀粉分子内部的α- 1，4 糖苷键，而使淀粉生成糊精和低聚糖，是一种钙离子依赖性酶。
β- 淀粉酶从非还原性末端顺次切下麦芽糖，为外切酶。
葡萄糖淀粉酶是一种作用于α- 1，4 糖苷键的外切酶，从非还原糖末端切下葡萄糖分子。
a-淀粉酶是一种胞外酶，由于酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题，其中α -淀粉酶的固定化交联法是目前比较理想的方法。
另可尝试探索用一定浓度的凝胶包埋枯草芽孢菌或用吸附法、交联法将枯草芽孢杆菌固定化，使菌体不能流动而酶可以存在反应液里。
凝胶柱底部可选用一定大小的半透膜使酶和淀粉不能流出反应凝胶柱，而产物可以流出。
【实验一】一、a-淀粉酶生产菌种的分离与培养、筛选二、【实验原理】大多数枯草芽孢杆菌好氧，最适生长温度为32℃,PH为7.2，转速为140r/min，接种量为9％，芽孢率生长最适温度36℃，最适PH为7.2，最适转速120r/min。
在以淀粉为碳源的固体培养基上用划线法分离纯化出产a-淀粉酶的菌株，根据是否可产生透明圈来筛选。
透明圈越大，产酶能力越强。
三、【实验仪器和材料】1、试剂：0.1%吕氏(Loeffier)美蓝染液配制方法：A 液：美蓝(methylene blue, 又名甲烯蓝)0.3 g, 95%乙醇30 ml；B 液：0.0l% KOH l00ml。
实验一：淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定
实验一：淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定指导老师：辛XX生命科学学院XX级生物技术班 XX同组人：XX,XX,XX,XX摘要：目的：从以分离到的细菌、放线菌和真菌中筛选出能产生生理活性物质的菌株并测出淀粉酶活力。
方法：利用土壤制成菌液，将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化，再用淀粉培养基培养，最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。
再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。
关键词：淀粉酶；透明圈；酶活力；分光光度计我们从学校的花坛中采集一些土壤样本，拿到实验室中，进行淀粉产生菌的筛选。
土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养，几天后在拼板上课长出细菌或者是其他的微生物，并繁殖形成菌落。
将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。
故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。
淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉遇到碘变蓝，这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。
随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。
因此可以根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。
1材料和方法1.1材料1.1.1实验材料长春师范学院家属楼前小菜园1.1.2实验药品碘液、2%可溶性淀粉、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水。
1.1.3实验仪器培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。
1.2方法1.2.1培养基的配置（1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板）（2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g,硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。