基因克隆步骤完整版学习资料

1 总RNA 提取

(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol 加到离心管中待用

(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置 5 min ;打开离心机预冷

(3) 力卩200卩氯仿，振荡15 sec室温放置3 min，分层；

⑷ 4°C, 12,000g，离心15 mi n；

(5) 取上清，加500卩异丙醇，混匀，室温放置10 min;

(6) 4°C, 12,000g，离心10 mi n；

(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗

(8) 4o C，7,500g，离心5 min ；

(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50卩L DEPC 水，—80°C保存。

此操作中所用到的器皿均需经过DEPC 灭活RNA 酶处理。提取的总RNA 需经RNA 电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD260 值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。RNA浓度计算公式：总RNA浓度

(卩g/mL =A260 >稀释倍数>40。

2 反转录/cDNA 第一链的合成

纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reage nt with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为：

Total RNA1yg

5X gDNA Eraser Buffer2yL

gDNA Eraser1yL

RNase Free dH2O补齐至10yL

条件为：42o C, 2min；

RNA 纯化后,即可进行反转录。其体系为：

5 x PrimeScript Buffer 2( for Real Time)4yL

PrimeScript RT enzyme mix I1yL

RT Primer Mix1yL

上一步的反应液10yL

RNase Free dH2O补齐至20yL

操作条件为：

(1) 37o C 放置15 min；(2) 85o C, 5 sec；(3) 4o C 保存。

3 PCR

按TaKaRa公司的Premix TaqVersion 2.0操

PCR反应体系如下：

作，，

Premix Taq25 yL

模板5yL

引物1 (10 y M) 1 yL

引物2 (10 y M) 1 yL

ddH2O18 yL PCR 反应条件为：94° （预变性5min; 94°C 变性30s, 53 °C退火30s, 72 °C 延伸30s,循环36次；72°C延伸10min。

PCR反应完毕，取反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10 yL反应产物）

4 基因克隆及测序

4.1 PCR 产物切胶回收

将PCR 产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的DNA 片段。使用TIANGEN 公司的Universal DNA Purification Kit 割胶回收试剂盒进行纯化，步骤如下：

⑴平衡吸附柱：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500 Z平衡液BL , 13,400X g离心1 min,倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；

(2) 按100 mg agarose胶加入100卩L溶液PC,置于50°C中10 min左右，中

途混匀几次，至胶完全融化；

(3) 将样品倒入一个吸附柱CB2 中(吸附柱放入收集管中) ，室温下13,400 x g离心1 min,倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；

(4) 向吸附柱CB2中加入600卩L漂洗液PW (加乙醇)，室温下13,400x g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；

(5) 重复上一步骤；

⑹将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400x g离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；

(7) 将柱子套入一新的灭菌1.5 mL 离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加

50卩L洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,400x g室温离心2 min,收集到的洗脱液即为回收的DNA 纯化液；

(8) 取5 Z的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并测量溶液中

DNA 含量。

4.2目的片段与载体连接

(1)胶回收产物与T载体连接体系，参考Takara公司pMD18-T载体的试剂盒说明书。在灭菌的0.5 mL离心管中配制如下溶液(10卩》：

回收DNA

Ligation Solution pMD18-T Vector

⑵16°C反应30分钟，所得产物保存于—4°C冰箱备用

4.3连接产物转化E.coli DH5a

(1)将5卩1连接产物加入到100 ^E.coli DH5a感受态细胞中，轻轻旋转离心管

混匀内容物，冰上静置30 min；

⑵42°C水浴热激转化90 sec立即放回冰上，放置3 min;

(3)每管加入500卩LLB 培养基 (室温放置),37o C 160-180 rpm振荡培养45-60 min，使菌体复苏并表达抗性基因；

⑷在含有Amp (100卩g/mL的选择性平板上加入60-100卩L菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用Parafilm 膜封好；

(5)将培养皿正放，37o C约50 min,待液体全部吸收后，倒置平板继续培养10-16 h。

4.4转化子的筛选及鉴定

(1) 用无菌枪头挑取LB 平板上3-5个单菌落，分别接种到3.5 mL LB 液体培养基中(含100 卩g/mL Amp，37o C，165rpm振荡培养10-12 h;

⑵用5卩菌液做模板，进行PCR鉴定(50卩L体系)，操作步骤同3。阳性菌液由Invitrogen 生物公司测序鉴定，余下的菌液4o C 保存备用；

(3)测序结果在Genbank数据库中进行比对分析。