基因工程实验设计

基因工程实验设计DNA重组分子的构建及筛选检测

实验原理：Bt蛋白中的"Bt"是苏云金芽孢杆菌"Bacillus thuringi ensis"的缩写。"毒蛋白"是其产生的一种伴胞晶体，有时也称为"de

是指其对特定的物种有毒性，并非对所有的生物体都有毒性。而且不同的Bt菌系产生的毒蛋白的特异性也不同。Cry14-4是从苏云金芽孢杆菌中获得的一中新的杀虫晶体蛋白样基因，对棉铃幼虫有较强的杀虫活性。

实验步骤

一．目的基因的获得

1.在NCBI网站上查找目的基因的核心序列

1 atgtatatgg ctgaaattaa acgtttagat tattatttag gtgccttgcc ttttggtaat 61 ttttatgtag atgattgtga tactttaaaa aattttatag atagcctttt agatggtaaa 121 ccttctacaa tgaataatac tcctctaaca ggtaatgtaa atgttacaaa tcaaagtgtt 181 actatcttag atgatttaga ttccatagca accctaaccc cagaatatgt atatgataat 241 tatttttcta atgatacaag tactgaaaaa acttatcaaa ccttatcttt tgagaaagat 301 gtacaaacaa cagttagtac aactgttacc catggattcc aaattggagg gaaacttgga 361 gctgaagtaa aaggaagtgt aagtattcct ttcgttgcag atggtggggt tactgtaagt 421 gcagaaattt ctggacaata taatttttct tcagcagata cagaaacaac aacaacttct 481 caaaaattaa ttattccttc tcagtccggt aacattcgac ctggttatac aacaagggtt 541 caaattatgt tagcaaaaat taatattcca caaacagcag ttcatttttc tggttctatg 601 tcaggaacag tacatcggga tccaatccct agtagtgtaa taggtttggt agactacgat 661 ttatatgatg aagtaaggtc tctagaaaat aattgttcaa attcaacagt aggtagagat 721 acaggtttag tattaaataa cgctaatcaa agtgtagatt tttcaggaag tggatttttt 781 actggttcaa ttactgcatt taatttttat gtaaaaatta ctgaatatcc aattaataat 841 tcttcccaag aaaatataag atggtactca atagaaccaa aagtattaaa tcaatcaatt 901 atacgacatc gttttccttc aaattcttct gtgaatactt gtaattgcta a

2.根据所查序列运用primer 5.0进行引物设计

3.确定适合引物的序列及位置,设计酶切位点及加保护碱基

上游引物：5’C CCCGGG ATGTATATGGCTGAAA3’

Sma1

下游引物：5’C GAGCTC TTAGCAATTACAAGTACC3’

Sac1

所选限制性内切酶酶切序列及酶切点:

Sma1:CCC↓GGG

Sac1:GAGCT↓C

4.菌体培养：将获得的苏云金芽孢杆菌于YT液体培养基，于30℃振荡培养过夜，获得足够的菌体。收集菌体(注意吸干多余的水分)。辅助裂解：如果是G+菌，应先加溶菌酶100μg/mL 50μL。37℃处理1h。

运用CTAB法提取DNA。将提取的DNA用PCR扩增获得目的片段。二．构建克隆载体质粒（pEASY-T1质粒）

1.连接T载体，转化大肠杆菌，涂平板（LB固体培养基加Kan和A mp），37℃培养12-16小时后，菌检（M13引物）。

附图：质粒pEASY-T1图谱

原理：很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链D NA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pEASY-T1载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pE ASY-T1载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pEASY-T1载体中，形成含有目的片断的重组载体。

反应体系：T 载体，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液10 x buffer，无菌dd Water

2.从菌检正确的菌落上挑菌摇菌（LB液体培养基加Kan和Amp）12 -16h后，提取质粒，送去检测。

三．表达载体的构建（pBI121质粒）

附图：pBI121质粒图谱

酶切体系：30°C

Tango TM buffer 1X

Sma1

Sac1

1.将目的片段确定正确的T质粒酶切，跑胶，切胶回收，获得带酶切位点的的目的片段，目的载体PBI121也进行酶切，跑胶，切胶回收。

2.将酶切片段和酶切后的载体连接。

四．目的基因的检测与筛选

1.将表达载体运用CaCl2法转化大肠杆菌，涂平板（LB固体培养基加Kan），12-16h后，菌落PCR（所设计的引物）。

2.从菌检正确的菌落上挑菌摇菌（LB液体培养基加Kan和Amp）12 -16h后，提取质粒。进行酶切验证。将酶切验证结果正确的菌落的质粒转化农杆菌，涂平板（YEB固体培养基+Kan+Rif），长出菌落后，菌检（所设计的引物），将菌检正确的菌落挑菌，摇菌，提取质粒，进行酶切验证，将酶切验证正确的菌落，保存菌液。

3.从检测正确的菌斑上挑菌，摇菌（YEB液体培养基+Kan+Rif），转化拟南芥，筛选转基因植物。

4.对筛选出来的纯合子，稳定遗传的转基因植株检测其抗虫性，确定该基因的抗虫功能（农杆菌侵染转化法）。