生物工程酶工程实验

酶工程

预实验报告

授课班级：12生物工程

授课教师：孙万里

2015-05-02

实验一淀粉酶产生菌的筛选

1 实验目的：

学习从环境中筛选产酶微生物的基本步骤

2 实验基本原理：

淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖、糊精等还原性糖，可以利用淀粉的消耗或糖的生成来进行淀粉酶的筛选。

初筛：淀粉可与碘反应生成兰色化合物，而葡萄糖不能，可利用此反应可判断淀粉是否被水解而从样品中筛选出可产淀粉酶的微生物。

复筛：淀粉酶可水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：

3 实验试剂：

分离培养基（100mL）：可溶性淀粉0.5g，蛋白胨0.5g，酵母膏0.5g，KH2PO4 0.05g，MgSO4 0.01g，Cacl2 0.05g，琼脂3g，pH 5.0

发酵培养基（100mL）：可溶性淀粉2.0g，蛋白胨0.5g，酵母膏0.5g，KH2PO4 0.05g，MgSO4 0.01g，Cacl2 0.05g，(NH4)SO4 0.1g，pH 6.0

pH6.0缓冲液：磷酸氢二钠(0.2mol/L)12.6mL与柠檬酸(0.1mol/L)7.4mL混合。

Lugol碘液（鉴别平板筛选用）：碘化钾2g,用水溶解，加入碘1g，定容300mL(棕色瓶保存)

1%淀粉：取1g淀粉，用水加热沸腾至充分溶解，定容至100mL，当天使用当天配。

3,5-二硝基水杨酸钠:精取称取1g 3,5-二硝基水杨酸,溶于20ml 2mol/L氢氧化钠溶液中,加入50ml蒸馏水,再加入30g四水酒石酸钾钠(C4H4KNaO6·4H2O),待溶解后用蒸馏水定容100mL,盖紧瓶塞,勿使CO2进入。

4 实验步骤：

4.1 初筛

取不同地点的土样（5～10cm深）5g，放入45mL带有玻璃球的无菌水中，震荡约5～10min，制成10-1稀释液，然后再梯度稀释至10-210-310-4，从10-210-310-4稀释液中分别取0.1mL涂布，过夜培养，加入适量Lugol碘液观察，并从中挑选出三株形态不同且具水解圈的单菌落。4.2 复筛

挑取单菌落，接种液体培养基中，37℃ 200rpm 72h，取发酵液测定酶活力。

4.3 酶活测定

分别取发酵液约5mL，10000rpm离心10min得上清液。

在比色杯中加入1%淀粉1mL，再加入pH 6.0缓冲液3mL，60℃预保温5min，加入发酵液1mL，60℃反应15min，反应完毕取出加入3,5-二硝基水杨酸钠2mL，沸水中5min使显色完全，定容到25mL，于540nm处进行比色。

空白1：考虑到发酵液中可能含有的糖，故只加入发酵液而不加淀粉。（每发酵液对应一空白）

空白2：不加发酵液，也不加入淀粉作为调“0”用。（每小组对应一空白）

5 实验结果：

结果比较理想。

但复筛中有时会出现空白值比测定值还高的结果，原因暂不明。

3,5-二硝基水杨酸钠大约只能使用一周，存放时间太久显色不完全。

6 实验问题：

为何要进行复筛?

为何本实验没有经过富集培养?

7 实验安排：

第一天取样，涂布

第二天加碘液，初筛，接种发酵72h

第五天测定发酵液酶活

实验二淀粉酶的提取

1 实验目的：

学习从盐析法粗提取酶的步骤

2 实验原理：

盐离子破坏蛋白质表面的水化膜，使疏水基团暴露，引起蛋白质间疏水区域聚集而沉淀，表面疏水基团越多，其蛋白质越容易发生沉淀。

3 实验试剂：

使用的酶：1g溶解在200ml水中，离心去渣。（约20U/mL）

硫酸氨：用前先碾成小颗粒，用30%，50%，80%饱和度的硫酸氨进行沉淀。25度下100mL分别加入克数为17.6g、31.3g、56.1g；加入时候需要注意慢慢加入，使得盐全部溶解。过夜沉淀。

4 实验步骤：

1. 加硫酸氨：用前先碾成小颗粒，加入4mL酶液中，加入的时候需要注意慢慢加入（否则局部浓度提高，造成不需要的酶沉淀），使得盐全部溶解，过夜沉淀。

2. 次日离心收集沉淀10000rpm 10min，用4mL水溶解沉淀。

3. 计算回收率：沉淀液／原液

5 实验问题：

如何提高沉淀效果? 增加蛋白浓度，调pH至等电点。

请结合该实验思考如果进行分步盐析?

6 实验安排：

第一天加硫酸氨

第二天测定酶活

实验三淀粉酶的固定化

实验目的：

学习海藻酸钙包埋法固定酶的操作步骤

实验原理：

把游离态的水溶性酶限制在某一局部空间或固定载体上称为酶的固定化，固定化酶可以使酶重复利用，并且有利用产物分离；

海藻酸钙包埋法是其中应用最为广泛、研究最多的一种包埋固定化方法，方法是在海藻酸钠溶液中加入Ca离子，通过Ca离子取代Na离子而形成凝胶网络，从而实现酶的包埋。

加入试剂量的多少可以决定采用何种孔径大小的固定化凝胶

实验试剂：

海藻酸钠（2%、3%、4%）

酶：制备20U/mL的酶液（1g+200mL水）

Cacl2：2%

实验步骤：

制备不同浓度海藻酸钠，高温蒸汽灭菌，过夜消泡。

取不同浓度的海藻酸钠与酶混合，比例为3:1（3mL+1mL）。

将海藻酸钠酶混合液放入50mL的大头针里，慢慢滴入2%Cacl2中，使成为凝胶小球，继续浸泡约20min，润洗几遍，

将制备成的固定化酶全部加入比色管中，测定酶活。

实验结果：

海藻酸钠浓度太高，比较粘稠，不易进行操作。

其中有一个浓度的酶活会比较大。

实验讨论：

请分析什么原因造成不同浓度海藻酸钠所制备的固定化酶会有不同的酶活?