生物工程酶工程实验
酶工程实验教学的改革与实践
①教改 项 目 ： 国家大 学生 创新 基金 （ 同编号０ １ ５ ３ ８ ； 西大学 实验 教改 项 目（９ ３ １； 世纪 广西 高等 教 育改革 工程 项 目（０ ０ Ｇ ０ ３ 。 合 ９ ０ ９ １ ）广 ０ ２ ０ ）新 ２ １Ｊ Ｂ ０ ）
２ ２
中 国科 教创新 导刊 Ｃｈｎ Ｅ ｕ ａ ｉｎ ｎ ｏｖ ｔｏ Ｈ ｒ ｌ ｉａ ｄ ｃ ｔｏ Ｉｎ ａ ｉｎ ｅ ａｄ
从 目 前 酶 工 程 实 验 课 的 教 学 现 状 来 看 ， 论 是 教 学 内 容 ， 学 理 念还 是 教 学 方 无 教
法， 都需 要 部 分 调 整 和 创 新 ， 适 应 制 定 的 以 实验 教 学是 创新 人 才培 养过 程 不可 缺 少
效 果 和 总 结 经 验 后 ， 铺 开 至 其 它 研 究 项 再
摘 要 ： 工程 实 验 课 具 有很 强 的 专 业 性 和 实 践 性 。 充 分 调 动 学生 自主 学 习 的 积 极 性 ， 宽 学 生 获 取 知 识 的 空 闽 ， 养 学生 的 创 新 能 力 ， 酶 为 拓 培 体现教 学 与科研 结合 ． 学 与科研 并举的 高校 办学理念 ， 们采取整合教 师科研 成果 ， 教 我 开设开放 型 实验 选修课 的方 式， 对酶 工程 实验教 学 进 行 改 革 。 践 证 明 ，它克 服 了 以 验 证 性 实 验 为 主 的 传 统 教 学 模 式 固 有 的 诸 多 弊 端 ，实 施 后 成 效 显 著 。 实 关键 词 ： 酶工程 实验 酶 工程 教 学改革
酶工程1-3影响酶催化作用的因素详解
四点假设： ①、②、③ 同“快速平衡法”； ④中间复合体[ES]在一开始浓度增高后，可在相当一段 时间内保持浓度的恒定；在这段时间里，[ES]的生成速度 和[ES]消失（包括分解成 E+S 和 E+P）的速度相等，达 到动态的平衡，即“拟稳态”。
c[ES]不随时间而变化
dc[ES ] dt
k1cE cS
k1c[ES ]
k2c[ES ]
0
c
cE0 cE c[ES ]
vP
dcP dt
k2c[ES ]
cS c[ ES ]
c[ E ]
拟稳态
cp t
vP
k2cE0 cs Km cs
vP ,max cs Km cs
Km
k1 k2 k1
为米氏常数（mol/L）
Km
Ks
k2 k1
当k+2远小于k-1时，Km=Ks
每一种酶的催化反应都有其最适宜的温度范围及最 适温度。
添加酶的作用底物或者某些稳定剂可以适当提高酶 的热稳定性。
4、pH值的影响
在不同的pH值条件下，酶分子和底物分子中的基 团的解离状态发生改变，从而影响酶分子的构象以 及酶与底物的结合能力和催化能力。 在极端的pH值条件下，酶分子的空间结构发生改 变，从而引起酶的变性失活。 每种酶都有其各自的适宜pH值范围和最适pH值。
k1cEcS k1c[ES ]
cE0 cE c[ES ]源自vPdcP dtk2c[ES ]
vP
k2cE0 cs Ks cs
vP ,max cs Ks cs
Ks
k 1 k 1
为解离常数（mol/L）
M-M 方程的修正
1925年，Brigg 和 Haldane 认为：许多酶有很大的催化 能力，当[ES]形成后，即迅速转化成产物P而释放出酶， 即当k+2>k-1时，M-M 方程不成立。
酶工程4
组分（酶、溶剂、底物和产物）的а
• 最佳水活度与溶剂的极性几乎无关
w
是相同的。
华东理工大学 ECUST
表征必需水作用的参数---热力学水活度
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获得恒定水活度的方法：
• 向反应体系中直接加水。 ×
• 用一个饱和盐水溶液分别预平衡底物溶液和酶制剂。 • 直接向反应体系加入水合盐：Na2HPO4（二、七、十 二水合盐）
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3 专一性
枯草杆菌蛋白酶催化在水溶液中催化N-乙酰-L-丝氨酸乙酯和N-乙酰-L
苯丙氨酸乙酯与丙醇的转酯反应，在二氯甲烷或苯中：丝氨酸>苯丙氨
酸；在吡啶或季丁醇中：苯丙氨酸>丝氨酸 原因：溶剂改变底物分配系数
有些在水中不能实现的反应途径，在有机介质中却成为主 导反应。
华东理工大学 ECUST
华东理工大学 ECUST
酶活性丧失的可能原因：
有机溶剂与底物或产物相互作用
• 直接作用：氯仿显著减少过氧化物酶催化苯酚的氧化，原因在于氯仿 是苯酚基的淬灭剂； • 影响底物或产物的分配
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2 活性
在反向微团体系中，微团效应使某些酶活性增加 超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活性 （Super-activity）。 表面活性剂刚性壳层能缓冲酶结构波动性，保证酶结构的稳定； 保护酶避免与有机溶剂直接接触； 为酶催化反应提供巨大相界面，减小传质阻力
剂（如吡啶或二甲基甲酰胺） 例：在己烷中聚苯酚氧化酶的催化反应，极性的苯醌产物不溶于己烷，
导致在酶周围的水层发生不需要的聚合，该聚合物缠住酶，降低酶活，
“酶工程”_暑期科研实践_实习_报告_总结 2100字 - 总结范文
三一文库（）〔“酶工程”_暑期科研实践_实习_报告_总结 2100字 - 总结范文〕“酶工程”暑期科研实践总结报告生物科学与工程学院生物工程2班黄义林20xx30742333这次暑期科研实践，我和李洋、黄文潘都参加了有张俊辉师兄所负责的酶分子改造的项目，实际参加实验的时间是7月13至29号，以及8月16至19号。
在此之前，我们还参加了有郑穗平老师和林影老师讲授的关于酶的发展、现状以及前景的讲座，以及内容为负责各个项目的师兄对其项目讲解的培训。
参加实践前的讲座和培训都让我对酶的发展概况、研究方向有了更深刻全面的认识。
实验中，张俊辉师兄让我们从实验的开头开始，逐步学习实验过程中各阶段的实验操作，同时对专业知识进行讲解，让我们更好地掌握实验操作的原理。
在实验流程中，我们的操作都没有出现能直接导致实验失败的失误，但实验最后并没有得到想要的产物，原因应该是多方面的，也和我们的实验操作有很大关系。
实验没有得到很好的成果，但在实践过程中，我学习和掌握了一些基本实验操作技能及操作规范，并对实验室内的规章制度有了更多的了解。
下面说一下我在实验中学到的知识和其他心得体会。
首先是酶分子改造实验的思想：获得待改造酶分子的三维结构后，对其进行分析，从而确定可能改善酶某一方面性能的突变位点，通过反编译获得改造后的酶的基因，把这段基因再表达出来，就得到改造后的酶分子。
思想比较直接，但是实际操作却比较迂回，因为某些步骤看起来不复杂，但在现实中要实现就没有那么简单，比如要确定突变位点和突变的方向，目前的理论对蛋白质结构和功能的研究还达不到可以直接指导酶分子改造的那个层次，所以在改造的时候需要结合理性突变和随机突变，即理性确定突变位点，然后在那个位点进行全突变，或者增加突变位点；要获得反编译后的酶的基因，直接合成成本太高（1bp 要几块钱），所以需要对原来的基因进行操作（设计引物，通过PCR对酶基因进行全突变）；对改造后的酶的基因进行表达，需要利用基因工程技术，我们在实际操作中是先把基因和质粒连接，先转化大肠杆菌以增殖质粒，再从大肠杆菌中提取质粒，转化毕赤酵母进行最终的表达；因为设置多个突变位点以及每个突变位点都有二十种氨基酸，所以需要进行大量的筛选（筛选量随着突变位点的增长而呈指数增长）；基因既看不见有摸不着，在实验过程中需要对每一步的成果进行检测，比较多的就是依靠跑胶来检测DA分子的长度，确定是否得到目的基因，与突变后的酶基因进行连接的质粒上面要有抗生素抗性标记，转化后的大肠杆菌或毕赤酵母要用含抗生素的平板进行培养，以筛选出成功转化的菌落。
《酶及实验设计》课件
酶的专一性是由酶的活性中 心决定的
酶的专一性是酶的重要特性 之一，决定了酶在生物体内
的作用和功能
酶的活性调节
酶的活性调节 酶的合成调节： 酶的降解调节： 酶的修饰调节：
机制：包括酶 包括基因表达 包括酶的降解、 包括酶的磷酸
的合成、降解、 调控、转录后 清除和回收等 化、乙酰化、
修饰、激活和 调控和翻译后
酶的分类
氧化还原酶：催 化氧化还原反应
的酶
水解酶：催化水 解反应的酶
转移酶：催化转 移反应的酶
裂解酶：催化裂 解反应的酶
合成酶：催化合 成反应的酶
修饰酶：催化修 饰反应的酶
酶的结构和功能
酶的功能：催化生物化学反 应，提高反应速率
酶的结构：由氨基酸组成的 蛋白质，具有特定的空间结 构
酶的活性：受温度、pH值、 离子强度等因素影响
温度：温度越高，反应速率越快
激活剂：激活剂可以提高酶活性，从而提 高反应速率
酶促反应的动力学方程式
米氏方程：描述酶促反应的速率与底物浓度的关系 汉密尔顿方程：描述酶促反应的速率与酶浓度的关系 米氏-汉密尔顿方程：综合考虑底物浓度和酶浓度对酶促反应速率的影响 酶动力学参数：包括Km、Vmax等，用于描述酶促反应的动力学特性
实验结果：酶活性、反应速率、产物生成量等
数据分析：使用统计方法，如t检验、方差分析等
结果解释：根据实验结果，分析酶的活性、反应速率、产物生成量等 结论：根据数据分析，得出实验结论，如酶的活性、反应速率、产物生成 量等与实验条件的关系。
实验结论和讨论
实验结果：酶活性与反应条件之间的关系 讨论：酶活性的影响因素及优化方法 结论：酶在生物体内的作用及应用前景 建议：进一步研究酶的催化机制和酶工程在生物技术中的应用
酶工程实验
实验一考马斯亮蓝G-250测蛋白含量一、实验目的：学习常用的测定蛋白质含量的方法。
二、原理考马斯亮蓝G250（R250）具有红色和蓝色两种色调。
在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质中碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族的氨基酸残基通过疏水作用结合后变为蓝色，染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm。
它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。
反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。
在0.01 ～1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595值成正比。
所以常用来测定蛋白质含量。
三、试剂与仪器①标准蛋白溶液（牛血清蛋白1.0mg/ml）②考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝G-250 100ｍg溶于50mL95%乙醇中，加100mL85%磷酸混匀，配成原液。
临用前取原液15mL，加蒸馏水至100mL，用粗滤纸过滤后，最终浓度为0.01%③仪器：分光光度计，旋涡混合器四、实验步骤1、配制标准蛋白溶液（牛血清清蛋白BSA：2.0mg/ml），每组10ml，2、考马斯亮蓝G-250溶液（终浓度0.01%），3、取12支试管，分为三组平行，按表中顺序加入标准蛋白溶液，水和试剂：即分别向各管中加入标准蛋白溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5ml；然后补充去离子水到0.1ml；最后各管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250。
每加完一管立刻在旋涡混合器上混匀（注意不要太剧烈）。
4、放置5min后，在分光光度计上测定样品的光吸收值A595（1号管为空白对照）。
5、用标准蛋白的量为横坐标，用A595为纵坐标，作标准曲线图，由此曲线，根据后续试验测出的未知样品的A595值，可查出未知样品的蛋白质含量。
6、实验结果分析：误差分析，为什么出现这样的结果，什么原因导致的？实验二3,5－二硝基水杨酸（DNS）法测定酶活力一、实验目的：学习DNS测定还原糖的方法二、实验原理：还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
酶工程实验报告三( 纤维素酶最适反应pH值的测定)
实验方式 小组合作
小组成员 XX XX XX XX
掌握酶最适 pH 值的测定方法及原理。
2、 实验仪器、试剂和溶液：
A 2 仪器： 紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅(4台)、试管架（1个）、1ml移液管（1 根）、10ml移液管（1根）、玻璃棒（1根）、1000ml烧杯（1个）、500ml烧杯（2个）、 1000ml容量瓶（1个)、洗耳球（1个）、标签（若干）等。
本科学生实验报告
学号 104120440 姓 名
孙永升
学院 生命科学学院 专业、班级 10 生物技术
实验课程名称
酶 工 程 <实验>
教师及职称
李俊俊 <讲师>
开课学期 2012 至 2013 学年 第二学期
填报时间 2013 年 月 24 日
云南师范大学教务处编印
1
实验名称 实验三 纤维素酶最适反应 pH 值的测定
5 实验处理
A 5 葡萄糖标准曲线如 图 1：
OD540nm值
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0
y = 0.7023x - 0.0747
葡萄糖标准曲线
R2 = 0.9992
系列1 线性 (系列1)
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
葡萄糖浓度(mg/ml)
图 1 标准曲线 葡萄糖标准曲线如上图所示，得回归直线方程 y=kx-0.0747，k=0.7023， R2=0.9992>0.99，该标准曲线相关性很好。式中 Y 表示表示测定的吸光度（OD）值，X 表示还原糖的浓度, 0.0747 表示补偿参数。
pH 与酶活性关系的测定是在其它条件（如底物浓度、酶浓度、反应温度等）恒定的 最适情况下，选用一系列变化的 pH 环境中进行初速度测定，其图形一般为钟形曲线。
酶工程实验指导
酶工程实验指导西南农业大学农学与生物科技学院2009年3月实验一产蛋白酶菌株的分离一、实验目的学习胞外生产微生物菌种的分离选择，熟悉分离菌种的基本操作。
二、实验原理工业上常用的生产酶的微生物有许多，重要的有枯草杆菌和真菌中的曲霉等等，它们都能产生耐热的芽孢或分生孢子，分离这类菌种时可采取先进行一定的热处理杀灭其它营养细胞，提高该菌株的相对数目。
根据胞外酶能分泌到培养基的特点，采用一定的方法在培养基上形成单菌落分泌的酶形成的“水解透明圈”，可对产酶的微生物的产酶能力（活力）进行初步估计、分离高产酶的微生物。
三、试剂、仪器高压灭菌锅，天平，无菌超净工作台，培养皿（8套/组）、试管（2支/组）、三角瓶、烧杯、酵母膏，蛋白胨，NaCl、琼脂粉，奶粉三、操作步骤1、带菌土壤的热处理称取1g带菌土壤湿润后放入80℃烘箱处理30min。
2、分离选择培养基的配制，各组按下列比例配制120ml培养基：奶粉2g ，自来水50ml，装入50ml三角瓶琼脂1.8g ，NaCl 0.5g，自来水70ml，装入100ml三角瓶自来水50ml，装入50ml三角瓶取50ml烧杯一个，放入5支带帽5ml离心管，灭菌备用。
分别封口，常规灭菌（121℃、20min）,灭菌后待冷却至不太烫手时混合上述液体，按无菌操作要领迅速倒平板8个，其中4个加有0.2ml不同稀释倍数（操作5）的样品液（菌悬液），迅速混合冷却形成平板，余4个平板冷却后用于涂布筛选。
3、稀释制备菌液，取5支灭菌带帽5ml离心管，各加入无菌水3.6ml备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水10ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入0.4ml微生物悬液，混合均匀后再取0.4ml到第二支试管中混合，从第二支试管中再取0.4ml到第三支试管中，以此类推。
4、斜面培养基配制：配制100ml LB培养基，加入1.5g琼脂粉、蛋白胨1.0g、酵母膏1.0g、NaCl、1.0g加水到100ml，调节pH=7,加热融化后，各组倒斜面培养基2 支，灭菌备用。
酶工程实验报告六(纤维素酶的固定化及其性质测定)
3、用注射器将上述混合液取20ml（各取四次）逐渐滴入200mlCaCl2溶液的三角瓶中
6、反应混合物物保温30min后，于各个浓度底物试管中加入3mLDNS试剂终止液，迅速振荡均匀。
（1）于游离酶对照中加入0.5 ml的酶液。
（2）于固定化酶对照中加入2.00mLCMC-Na溶液。
7、混合后将各个实验组的三支试管沸水浴5min，自来水冷却后，加蒸馏水19.5mL。摇匀，在540nm处读取OD值。
④精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
⑤避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；
5、实验结果与数据处理：
5.1实验数据与结果：
表一固定化酶（3.5%）与游离酶稳定性的比较
保温时间（min）
吸光度OD540、酶活（u/g）、相对酶活(%)
固定化纤维素酶酶
游离纤维素酶酶
10 0.0375 639.04 33.63 0.0585 7586.50 65.23
②酶稳定性比较：由图三可看出在反应30min以后，游离酶的酶活稳定性保持升高到40min达最大酶活，之后酶活（相对活性）急剧下降（曲线斜率较陡曲）；而固定化纤维素酶的酶活从20min后保持平缓的下降趋势（斜率较缓），即稳定性较高。
③不同浓度的海藻酸钙对固定化酶性质影响：随着海藻酸钙的浓度由：2.5%、3.5%、4.5%、5.5%升高，呈现增后减的趋势，固定化纤维素酶酶活性在3.5%达最大相对酶活性100%。
酶工程实验方案
酶工程实验方案一、实验目的通过本实验，学生将学会利用酶工程实验技术，熟悉酶的生产、纯化和应用过程，培养学生实验操作技能和科学研究能力，为学生今后的科研工作打下良好的基础。
二、实验原理酶工程是利用生物工程学原理和技术手段，对酶进行筛选、改造和工程应用。
酶在生产中扮演着极其重要的角色，它广泛应用于食品、医药、环保、能源、材料等领域。
酶工程实验的关键是酶的生产和纯化技术。
典型的酶工程包括：酶源的筛选、酶基因的克隆与表达、酶的纯化和酶的应用等。
三、实验内容本实验将包括以下内容：1. 酶源的筛选：选择一种具有较高酶活性的微生物菌株，进行培养、鉴定，筛选出所需酶。
2. 酶基因的克隆与表达：通过PCR技术扩增酶基因，将其克隆至适当的表达载体中，然后将其转化至表达宿主中，表达目的蛋白。
3. 酶的纯化：采用离心、柱层析、过滤等方法对表达蛋白进行酶的分离和纯化。
4. 酶的应用：将纯化的酶用于特定的生产或研究中，评价酶的性能。
四、实验步骤1. 酶源的筛选（1）选择合适的微生物菌株，进行培养并获得菌液样品。
（2）采集菌液样品，进行酶活性测试，筛选出具有较高酶活性的菌株。
2. 酶基因的克隆与表达（1）利用PCR技术扩增酶基因。
（2）将扩增出的酶基因克隆至表达载体中。
（3）转化表达载体至适当的表达宿主中，进行表达。
3. 酶的纯化（1）收集表达蛋白，进行细胞破碎，得到目的蛋白混合物。
（2）通过离心、柱层析、过滤等方法对蛋白混合物进行纯化。
4. 酶的应用（1）评价纯化酶的性能。
（2）将纯化的酶用于特定的生产或研究中。
五、实验材料和仪器1. 微生物菌株：待定2. 实验宿主：大肠杆菌等3. 载体：pET等4. 酶活性测试试剂盒5. PCR试剂盒6. 离心机、柱层析仪、过滤器等实验仪器七、实验结果1. 酶源的筛选结果：取得具有较高酶活性的微生物菌株。
2. 酶基因的克隆与表达结果：成功将酶基因克隆至表达载体中，并通过转化实现表达。
3. 酶的纯化结果：得到较纯的酶样品。
酶工程实验报告一
酶工程实验报告一一、实验目的本次酶工程实验的主要目的是通过实际操作，深入了解酶的性质、作用机制以及酶的分离纯化和活性测定方法。
同时，培养我们的实验操作技能、观察分析能力和科学思维方法，为今后从事相关领域的研究和工作打下坚实的基础。
二、实验原理酶是一种具有生物催化功能的蛋白质或 RNA 分子。
它们能够在温和的条件下高效地催化各种化学反应，具有高度的特异性和催化效率。
本实验中所涉及的酶主要是蛋白酶和淀粉酶。
蛋白酶能够水解蛋白质中的肽键，将蛋白质分解为小分子肽和氨基酸。
其活性可以通过测定水解产物的生成量或底物的消耗量来进行评估。
淀粉酶能够水解淀粉分子中的α-1,4 糖苷键，将淀粉分解为麦芽糖和葡萄糖等小分子物质。
其活性通常通过测定淀粉的水解程度来确定，常用的方法是碘量法。
酶的分离纯化是基于酶与杂质在物理化学性质上的差异，如溶解度、分子大小、电荷性质等，采用一系列的分离技术，如沉淀、层析、电泳等，逐步去除杂质，获得高纯度的酶。
三、实验材料与设备1、实验材料蛋白酶提取液淀粉酶提取液酪蛋白淀粉溶液福林酚试剂碘液其他化学试剂2、实验设备离心机分光光度计恒温水浴锅移液器电泳仪层析柱四、实验步骤制备酪蛋白底物溶液：称取一定量的酪蛋白，用氢氧化钠溶液溶解，调节 pH 至适宜值，定容备用。
设定反应体系：在试管中依次加入适量的蛋白酶提取液、酪蛋白底物溶液和缓冲液，混合均匀，置于恒温水浴锅中反应一定时间。
终止反应：反应结束后，加入三氯乙酸溶液终止反应。
测定吸光度：离心去除沉淀，取上清液，加入福林酚试剂显色，在分光光度计上测定吸光度。
计算蛋白酶活性：根据标准曲线计算出反应生成的酪氨酸量，从而计算出蛋白酶的活性。
2、淀粉酶活性的测定制备淀粉溶液：称取一定量的淀粉，用缓冲液溶解，加热糊化，冷却后定容备用。
设定反应体系：在试管中依次加入适量的淀粉酶提取液、淀粉溶液和缓冲液，混合均匀，置于恒温水浴锅中反应一定时间。
终止反应：反应结束后，加入碘液终止反应。
[工学]《酶工程》教案
![[工学]《酶工程》教案](https://img.taocdn.com/s3/m/9fe9e605a31614791711cc7931b765ce05087abe.png)
《酶工程》教案安排：本课总学时为48，其中理论课40，实验课8，周学时为3学时。
要求：要求同学们课前预习教材，带着问题听课，这样学习效果好；学生上课作笔记，动动脑；学生课后复习和整理笔记，教师作课后小结和布置作业，达到教学相长的目的。
绪论1教学目标：使学生掌握酶、酶工程的概念，酶的化学性质与催化特性，了解酶的分类与命、酶活力测定、酶的生产方法。
2教学内容：主要讲酶和酶工程的基本概念与发展史、影响酶催化作用的因素、酶的分类与命名、酶的化学性质与催化特性、酶活力测定、酶的生产方法。
3重点和难点：酶、酶工程、酶活力有关的概念；酶的化学性质与催化特性、酶活力测定。
4教学方法：采用讲授式、启发式、图示法、问答式相结合的教学方法。
5板书设计:从上至下，从左至右；大标题始终留在黑板的左边；书写规范。
6学时分配：理论3学时，实验2学时。
7教学进程：第一节酶和酶工程的基本概念与发展史1酶的基本概念酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。
按化学组成分：蛋白类酶（Enzyme proteins）和核酸类酶（Ribozyme RNAs）。
a蛋白类酶（Enzyme proteins）酶是由生物体产生的具有催化活性的蛋白质。
b核酸类酶（Ribozyme RNAs）本身就是一段RNA，不需要额外的蛋白酶就可以对自身进行剪切。
提问：酶一定是蛋白质吗？2酶的发展史1.2.1酶在中国的发展史人们对酶的认识起源于生产与生活实践。
夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。
公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。
春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。
酶者，酒母也。
1.2.2酶在西方的发展史1878年, 给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个字来自希腊文，其意思“在酵母中”。
1896年,日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得高峰淀粉酶,用作消化剂,开创了有目的的进行酶生产和应用的先例。
西方国家19世纪对酿酒发酵过程进行了大量研究。
酶工程教学方法的探讨与体会
农业科学在科学技术高度发展的21世纪,现代生物技术的快速发展极大地推动了生命科学各学科的发展,生物工程作为一门综合性技术,正以前所未有的深度和广度迅速发展[1]。
酶工程作为生物工程(细胞工程、基因工程、酶工程、发酵工艺)的重要组成部分,是生物工程领域的基础和核心,具有很强的实践性和广泛的应用性,是当前世界各国最为迅猛的工程技术之一,在工业、农业、医药、保健、环保及其他各方面发挥着重要作用[2]。
作为生物类相关专业的一门重要的专业课,如何使酶工程的教学适合时代发展的需要以及提高教学效果,让学生及时扎实地掌握最新的酶工程理论知识和应用技术,培养合格的从事酶工程研究及生产的适用型人才,增强他们的竞争力,为将来的工作打下良好的基础,已成为酶工程教学工作所面临的根本任务。
现本人根据在教学工作中的体会,特别是实验教学,培养学生动手能力这方面从教学内容、教学方法、教学手段等[3]进行一些探索。
1 选用合适的实验教材,优化教学内容教材是体现教学内容和教学方法的知识载体,是进行教学的基本工具。
在整个教学活动中占有重要位置,因此教材的选择成为首要问题,一本好的教材,既能提高教学质量,还能有助于引发学生的学习兴趣,教材内容既要紧紧跟上生物技术发展前沿,还要有一定的基础性、延续性,这样才能更好的用于教学实践。
酶工程理论和技术发展迅速,信息量大,为了保持教学内容的合理性、前沿性,参照国内外其他优秀教材和酶工程的发展前沿,重视前沿知识和相关学科知识的渗透,对教学内容要不断更新充实、优化调整,使学生及时了解酶在各行各业中的最新发展及研究趋势。
当然动手实践是检验理论知识最好的方法,故实验的教学也尤为重要。
作为培养新型人才的需要,要以学生的素质培养为主体,精选对其学习和发展必备的理论知识,努力体现教育内容的现代化,并根据学生自身发展目标,采用循序渐进的教学方式,对前沿知识通过渗透的方法,根据教学内容有机的添加实验内容这一块,加强学生对酶工程的进一步理解。
酶工程实验指导
生物工程实验指导（酶工程部分）海南师范大学生命科学学院2010-10实验一 木瓜蛋白酶的分离纯化及酶活检测一、概述以半胱氨酸内肽酶为主（包括木瓜蛋白酶，简称PAP、木瓜蛋白酶Ω， 简称CAR、木瓜凝乳蛋白酶，简称CHP和木瓜凝乳蛋白酶M，简称GEP）的木瓜蛋白酶是从植物番木瓜中分离纯化而得的一种混合酶。
这种酶广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中以为成熟的果实乳汁中含量最高，约占乳汁干中的40%。
其最大的用途是在食品工业方面，防除啤酒冷藏混浊，嫩化肉类，生产调味品，烘烤面包，乳酪制品及谷类和速溶食品的蛋白质强化生产。
在动物饲料加工方面，用于鱼蛋白浓缩物和油籽饼处理，能提高氮的可溶性指数和蛋白质的可分散指数。
少量在皮革工业作软化剂、纺织工业作丝织品脱胶清洁剂和废胶卷回收报等。
在医药方面，主要用于治胃炎、消化不良以及用于肉赘摘除、伤痕处理、脱毛、清洁皮肤和新近的裂腭整形外科及制木瓜凝乳蛋白酶注射剂治疗脊骨盘脱出症等。
木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶，其专一性较差，能分解比胰脏蛋白酶更多的蛋白质。
木瓜蛋白酶是单条链，有211个氨基酸残基组，相对分子量23000。
木瓜凝乳蛋白酶，相对分子量36000，约占可溶性蛋白质的45%。
溶菌酶，相对分子量2500，约占可溶性蛋白质的20%。
木瓜蛋白酶为白色、淡褐色无定型粉末或颗粒。
略溶于水、甘油，不溶于乙醚、乙醇和氯仿。
水溶液无色至淡黄色，有时呈乳白色。
最适pH为5.0～8.0，微吸湿，有硫化氰臭。
最适温度65℃，易变性失活。
木瓜蛋白酶等电点pH＝9.6。
半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和EDTA是木瓜蛋白酶激活剂，巯基试剂和过氧化氢是木瓜蛋白酶的抑制剂。
二、实验目的1、学习和掌握木瓜蛋白酶分离纯化的原理、方法和工艺过程，包括盐析、酶活力保护、结晶与重结晶。
2、掌握木瓜蛋白酶活力的测定方法和原理。
三、能力培养目标1、蛋白质分离纯化的工艺流程，特别是盐析操作技术的熟练掌握；2、酶活力检测方法的掌握。
《酶工程》课程实验教学大纲
《酶工程》课程实验教学大纲一、实验课程基本情况二、实验课程简介《酶工程》是制药工程的主要内容之一，是现代酶学和生物工程学相互结合而发展起来的一门新的技术学科。
它将酶学、微生物学的基本原理与化工、发酵等工程技术有机结合起来，并随着酶学研究的迅速发展，特别是酶的广泛应用而在国民生产生活中日益发挥着越来越重要的作用。
酶工程实验课是制药工程等本科实验教学的一个重要组成部分，通过实验教学可以加强学生对酶工程基本知识和基本理论的理解，掌握现代酶学与相关技术的有关的基本的实验原理与技能。
在实验过程中要求学生自己动手，分析思考并完成实验报告。
酶工程实验性质有基础性、综合性、设计（创新）性三层次。
三、实验教学目的和基本要求本实验课程主要根据酶工程的三大块内容即酶的生产、酶的改性与酶的应用来设计安排实验，通过这些实验内容，使学生深入理解酶工程课程的基本知识；巩固和加深所学的基本理论；掌握酶工程中基本的操作技能。
同时，通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学生的科学素养。
四、实验内容与学时分配课堂教学与实验教学结合。
课堂教学合班上课，实验课分小班进行，每4人一组。
实验设计尽量从实际生产中提出问题，增加学生对实际动手操作的兴趣，安排每个人动手。
通过实际操作巩固掌握教材相关理论知识。
六、考核方法实验成绩占课程总成绩的20%。
主要考察学生每次实验的表现：动手操作能力，观察能力，解决问题的能力等。
其次检查实验报告的书写情况是否认真准确。
七、实验内容安排【实验一】淀粉酶动力学分析（4学时）一、实验目的：了解并掌握米氏常数的意义和测定方法。
二、实验要求：掌握米氏常数的意义和测定方法，掌握酶反应的动力学分析方法。
三、实验步骤：1、酶反应：取13支干燥的18×180 mm试管，按下表编号，实验组做两份平行实验，加入pH5.0的淀粉溶液和α-淀粉酶溶液，50℃反应10分钟2、酶反应速度测定：酶反应液稀释一定倍数（约5倍，取1 mL反应液，加4 mL蒸馏水，混匀），取1 mL稀释液加DNS试剂，于沸水浴中加热2 min进行显色，取出后在盛有冷水的500 mL烧杯中冷却（注意换冷水），各加入蒸馏水9.0 mL，摇匀，以空白管为调零点，在540 nm波长测定吸光度值，从标准曲线查出葡萄糖的含量，算出酶反应速度（mol/（L·min））。
糖化酶固定化实验报告
1、实验用乳化机WL500CY、注射用筒50mL6号针头、冰箱、其他实验常用玻璃仪器
2、糖化酶、海藻酸钠、明胶
四、试剂配方
1、2%可溶性淀粉
称取可溶性淀粉碎2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至100ml，此溶液需当天配制。
（3）我们测定酶活的方法是采用滴定硫代硫酸钠法，由于我们操作的不够熟练，在滴定的过程中会多滴一两滴，这使我们的一些数据会偏大。
（4）测固定化酶活与固定化酶的回收率，没有在同一天做，固定化酶放置了一天，这使固定化酶的回收率测定出现偏差。
⑵计算
酶活(mg/ml)=(A-B)*N*90.05*V1/V2
A—空白所消耗的Na2S2O3的毫升数；
B—样品所消耗的Na2S2O3的毫升数；
90.05—1毫升1N的Na2S2O3相当的葡萄糖毫克数；
V1—反应液总体积(32.20毫升)；
V2—吸取反应液样品体积(5毫升)；
N—Na2S2O3的当量浓度(0.1mol/L)。
五、实验步骤
1、酶活测定
⑴操作步骤
取2％可溶性淀粉溶液25毫升加pH4.5醋酸缓冲液5毫升混匀于比色管，在40℃恒温水浴中预热5－10分钟加入待测酶液2毫升(空白以蒸馏水代替酶液)准确计时1小时。取出加入4滴20％NaOH终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液5毫升于定容瓶中，先加入0.05mol/L碘液10毫升，再加0.1 mol/LNaOH 10毫升，摇匀暗处静置15分钟。加入2N硫酸2毫升。用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在4~6之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。
3、糖化酶的固定化
酶工程实验大纲
湖北大学酶工程实验（0818800193）实验教学大纲（第2版）生命科学学院生化教研室2014年7月前言课程名称：酶工程实验实验学时：16学时适用专业：生物工程课程性质：必修一、实验课程简介酶工程是生物工程的主要内容之一，是现代酶学和生物工程学相互结合而发展起来的一门新的技术学科。
它将酶学、微生物学的基本原理与化工、发酵等工程技术有机结合起来，并随着酶学研究的迅速发展，特别是酶的广泛应用而在国民生产生活中日益发挥着越来越重要的作用。
酶工程实验课是生物工程等本科实验教学的一个重要组成部分，通过实验教学可以加强学生对酶工程基本知识和基本理论的理解，掌握现代酶学与相关技术的有关的基本的实验原理与技能。
在实验过程中要求学生自己动手，分析思考并完成实验报告。
酶工程实验性质有基础性、综合性、设计（创新）性三层次。
二、课程目的本实验课程主要根据酶工程的三大块内容即酶的生产、酶的改性与酶的应用来设计安排实验，通过这些实验内容，使学生深入理解酶工程课程的基本知识；巩固和加深所学的基本理论；掌握酶工程中基本的操作技能。
同时，通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学生的科学素养。
三、考核方式及成绩评定标准考核内容包括实验过程中的操作情况，实验记录及结果的准确性，实验报告的书写及结果分析，思考题的回答情况，仪器设备的使用情况及遵守实验室规章制度的情况等，根据这些方面进行成绩评判和记录，综合给出实验总成绩。
四、实验指导书及主要参考书1．魏群：生物工程技术实验指导，高等教育出版社，2002年8月。
2．禹邦超：酶工程（附实验），华中师范大学出版社，2007年8月五、实验项目实验项目一览表（可选）实验类型：演示性、验证性、综合性、设计性、其它实验一双酶法制备淀粉糖（3课时）一、实验原理目前国内外淀粉糖的生产大都采用双酶法。
酶工程 第四节 酶分析法
2）、测反应的初速度
随着反应的进行，底物浓度下降和产物增加导 致逆反应从无到有，逐渐变得显著起来； 酸、碱、热等也在慢慢地使酶失活变性。
因此，这种情况下测的反应速度只是一种表观 的、各种因素影响下的综合结果，不能代表酶的真 正活性，真正能代表酶催化活力的是反应初始阶段 的速度。 通过制作进程曲线来确定初速度范围的时间
化学法:
是取样法的一种,比较古老,但目前仍普遍 使用。一是因为此法不需要特殊仪器，而且几 乎所有的酶反应都可以根据产物或底物的化学
性质找出具体的有特异性的测定方法。
例：腈水合酶丙烯酰胺测定 （工作量大、含误差大、不够准确）
光学法（灵敏度高、快速、简便） 它是一种连续测定法，是根据底物 和产物在某一波长或波段上有明显特征 吸收差别而建立起来的方法。 光学法又可分为三种： 光吸收法； 荧光法； 旋光测定法。
所以：酶的单位数与速度值数值上相等
（一）、测定原理：
测酶活力就是在确定的最适反应条件下 测定酶促反应速度，
酶促反应速度取决于那些因素 ——速度方程
？
米氏方程
Michaelis & Menten根据中间产物学说推 导出表示酶促反应中底物浓度与反应速度 关系的公式称为—— 米氏方程： V [S]
V = K max[S] m+
先不加底物L-Ala 测定空白值；
L-Ala + -酮戊二酸 丙酮酸 + NADH + H+ GPT LDH 丙酮酸 + L-Glu 乳酸 + NAD+
但是，血清中含有谷氨酸脱氢酶（GluDH)，
那么就有可能产生干扰，因为：
-酮戊二酸 + NADH + NH4 +
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酶工程
预实验报告
授课班级：12生物工程
授课教师：孙万里
2015-05-02
实验一淀粉酶产生菌的筛选
1 实验目的：
学习从环境中筛选产酶微生物的基本步骤
2 实验基本原理：
淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖、糊精等还原性糖，可以利用淀粉的消耗或糖的生成来进行淀粉酶的筛选。
初筛：淀粉可与碘反应生成兰色化合物，而葡萄糖不能，可利用此反应可判断淀粉是否被水解而从样品中筛选出可产淀粉酶的微生物。
复筛：淀粉酶可水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：
3 实验试剂：
分离培养基（100mL）：可溶性淀粉0.5g，蛋白胨0.5g，酵母膏0.5g，KH2PO4 0.05g，MgSO4 0.01g，Cacl2 0.05g，琼脂3g，pH 5.0
发酵培养基（100mL）：可溶性淀粉2.0g，蛋白胨0.5g，酵母膏0.5g，KH2PO4 0.05g，MgSO4 0.01g，Cacl2 0.05g，(NH4)SO4 0.1g，pH 6.0
pH6.0缓冲液：磷酸氢二钠(0.2mol/L)12.6mL与柠檬酸(0.1mol/L)7.4mL混合。
Lugol碘液（鉴别平板筛选用）：碘化钾2g,用水溶解，加入碘1g，定容300mL(棕色瓶保存)
1%淀粉：取1g淀粉，用水加热沸腾至充分溶解，定容至100mL，当天使用当天配。
3,5-二硝基水杨酸钠:精取称取1g 3,5-二硝基水杨酸,溶于20ml 2mol/L氢氧化钠溶液中,加入50ml蒸馏水,再加入30g四水酒石酸钾钠(C4H4KNaO6·4H2O),待溶解后用蒸馏水定容100mL,盖紧瓶塞,勿使CO2进入。
4 实验步骤：
4.1 初筛
取不同地点的土样（5～10cm深）5g，放入45mL带有玻璃球的无菌水中，震荡约5～10min，制成10-1稀释液，然后再梯度稀释至10-210-310-4，从10-210-310-4稀释液中分别取0.1mL涂布，过夜培养，加入适量Lugol碘液观察，并从中挑选出三株形态不同且具水解圈的单菌落。
4.2 复筛
挑取单菌落，接种液体培养基中，37℃ 200rpm 72h，取发酵液测定酶活力。
4.3 酶活测定
分别取发酵液约5mL，10000rpm离心10min得上清液。
在比色杯中加入1%淀粉1mL，再加入pH 6.0缓冲液3mL，60℃预保温5min，加入发酵液1mL，60℃反应15min，反应完毕取出加入3,5-二硝基水杨酸钠2mL，沸水中5min使显色完全，定容到25mL，于540nm处进行比色。
空白1：考虑到发酵液中可能含有的糖，故只加入发酵液而不加淀粉。
（每发酵液对应一空白）
空白2：不加发酵液，也不加入淀粉作为调“0”用。
（每小组对应一空白）
5 实验结果：
结果比较理想。
但复筛中有时会出现空白值比测定值还高的结果，原因暂不明。
3,5-二硝基水杨酸钠大约只能使用一周，存放时间太久显色不完全。
6 实验问题：
为何要进行复筛?
为何本实验没有经过富集培养?
7 实验安排：
第一天取样，涂布
第二天加碘液，初筛，接种发酵72h
第五天测定发酵液酶活
实验二淀粉酶的提取
1 实验目的：
学习从盐析法粗提取酶的步骤
2 实验原理：
盐离子破坏蛋白质表面的水化膜，使疏水基团暴露，引起蛋白质间疏水区域聚集而沉淀，表面疏水基团越多，其蛋白质越容易发生沉淀。
3 实验试剂：
使用的酶：1g溶解在200ml水中，离心去渣。
（约20U/mL）
硫酸氨：用前先碾成小颗粒，用30%，50%，80%饱和度的硫酸氨进行沉淀。
25度下100mL分别加入克数为17.6g、31.3g、56.1g；加入时候需要注意慢慢加入，使得盐全部溶解。
过夜沉淀。
4 实验步骤：
1. 加硫酸氨：用前先碾成小颗粒，加入4mL酶液中，加入的时候需要注意慢慢加入（否则局部浓度提高，造成不需要的酶沉淀），使得盐全部溶解，过夜沉淀。
2. 次日离心收集沉淀10000rpm 10min，用4mL水溶解沉淀。
3. 计算回收率：沉淀液／原液
5 实验问题：
如何提高沉淀效果? 增加蛋白浓度，调pH至等电点。
请结合该实验思考如果进行分步盐析?
6 实验安排：
第一天加硫酸氨
第二天测定酶活
实验三淀粉酶的固定化
实验目的：
学习海藻酸钙包埋法固定酶的操作步骤
实验原理：
把游离态的水溶性酶限制在某一局部空间或固定载体上称为酶的固定化，固定化酶可以使酶重复利用，并且有利用产物分离；
海藻酸钙包埋法是其中应用最为广泛、研究最多的一种包埋固定化方法，方法是在海藻酸钠溶液中加入Ca离子，通过Ca离子取代Na离子而形成凝胶网络，从而实现酶的包埋。
加入试剂量的多少可以决定采用何种孔径大小的固定化凝胶
实验试剂：
海藻酸钠（2%、3%、4%）
酶：制备20U/mL的酶液（1g+200mL水）
Cacl2：2%
实验步骤：
制备不同浓度海藻酸钠，高温蒸汽灭菌，过夜消泡。
取不同浓度的海藻酸钠与酶混合，比例为3:1（3mL+1mL）。
将海藻酸钠酶混合液放入50mL的大头针里，慢慢滴入2%Cacl2中，使成为凝胶小球，继续浸泡约20min，润洗几遍，
将制备成的固定化酶全部加入比色管中，测定酶活。
实验结果：
海藻酸钠浓度太高，比较粘稠，不易进行操作。
其中有一个浓度的酶活会比较大。
实验讨论：
请分析什么原因造成不同浓度海藻酸钠所制备的固定化酶会有不同的酶活?。