DNA重组和转座

第一节 DNA重组（recombination）

一）、DNA重组

1、概念：是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA分子的过程。

2、意义：重组是遗传学的灵魂，没有重组就没有生物的进化；没有重组也就没有现代的分子克隆技术

二）、DNA重组的类型

1、同源重组（Homologous Recombination）

2、位点特异性重组（Site-specific Recombination）

3、DNA的转座（transposition）

同源重组

一、概述

1、定义：两个DNA分子同源序列之间进行的重组

2、条件：

（1）两个DNA分子有同源序列

（相关的酶可以用任何一对同源序列为底物）

（2）两个DNA分子必须紧密接触

3、发生：

真核生物: 非姐妹染色单体交换相对应的区域。

原核生物: 依赖recA蛋白，并形成 Holliday 结构

Holiday模型（1964年）

二、大肠杆菌同源重组的分子基础

（一）RecA

1、作用：可促进单链同化或单链吸收

RecA具有使DNA单链置换双链中同源链的能力

2、单链同化发生的三个条件

（1）其中一个DNA必须存在单链区

（2）其中一个DNA必须有一个自由3’末端

（3）此单链区和3’末端必须位于两分子之间互补的区域内

（二）RecBCD复合体

1、酶的活性：

（1）核酸酶

（2）解旋酶

（3）ATPase

2、作用：在CHi位点处产生含3`游离末端单链。

（三）CHi位点——RecBCD识别的靶位点

5`GCTGGTGG3`

3`CGACCACC5`

是重组频率较高的部位

E.coli每隔约5~10kb有一个拷贝，

Holliday 结构的形成：

1. 同源序列排列在一起；

2. 酶切。通过核酸酶和RecBCD蛋白复合体的作用在一对同源DNA上产生切口；

3.入侵。含有3’端切口的ssDNA被recA蛋白包裹形成recA蛋白-ssDNA细丝；RecA-ssDNA

细丝寻找相对的DNA双螺旋上的相应序列。

4. 游离端交叉连接，形成Holliday 结构

5.通过分支迁移产生异源双链DNA。

6. 空间重排。十字型两臂旋转180度

7. 解离(两种不同方式)

8. 修补连接

附：基因敲除( Gene knockout)

是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。

位点特异性重组

一、定义：

不依赖于DNA顺序的同源性，而依赖于能与某些酶相结合的特异的DNA序列的存在。

二、噬菌体λ对E.coli DNA的整合

（一）λDNA存在两种形式

裂解状态

溶源状态

（二）通过位点特异性重组实现两种类型间的转换

λDNA整合到宿主DNA 进入溶源状态

λDNA从宿主DNA 中切离进入裂解状态

（三）催化重组的酶

1、整合酶 Int (integrase)：有拓扑异构酶活性

2、整合宿主因子（IHF，integration host factor ）

3、切除酶（excisionase）/ 终止重组

（四）重组位点：

附着位点（attachment site）

attP（ POP’）和attB（ BOB’）有15bp核心序列配对

（五）重组过程：

1、整合： POP’ + BOB’→BOP’—POB

2、切离：BOP’—POB’→ POP’ + BOB’

1、整合的过程

（1）具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与attP和attB位点结合。

（2）Int的拓扑异构酶活性，使两条双链各自断开一条单链，瞬间旋转然后交换连接。（3）同时在另两条单链之间发生同样的断裂重接，从而完成双链间的重组。

第二节 DNA的转座

一、概念：

转座子（transponsn,简称Tn）, 又称易位子，是指存在于染色体DNA上可以自主复制和位移的一段DNA顺序。

转座子可以在不同复制子之间转移，以非正常重组方式从一个位点插入到另外一个位点，对新位点基因的结构与表达产生多种遗传效应。

二、转座因子的发现和检出

McClintock：

1938年，提出转座基因概念

1944-1950，阐明“Ds-Ac调控系统”

1983年，获诺贝尔生理医学奖

J.Shapiro等：

1980年，证实了可移位的遗传基因存在

三、转座子的基本结构特点

1、自身携带有转座酶基因

2、末端有反向重复序列（IR）

3、转座后两端有正向重复序列（DR）

四、转座子的类型

（一）细菌转座子

1、IS （插入序列, insertion sequences）

特点：

（1）比较小，0.75~1.5kb;

（2）只有转座酶基因

（3）两端有反向重复序列;

2、Tn （复合转座子, composite transposons）

特点：

（1） 2-10kb;;

（2）两端有两个相同或高度同源IS序列

（3）含转座酶基因 / 抗生素基因

3、TnA （TnA family）

特点：

（1）5~25kb;

（2）两端IR（30~40bp）相似或相同；两端无IS组件; （3）转座酶基因 / 解离酶基因 / 抗生素基因

Tn的转座过程（4）Res位点：与共整合体的解离有关

（二）真核生物转座子

1、特点：

（1）两端有IR，

（2）内部有转座酶等基因；

2、举例：