DNA重组和转座
DNA转座(DNA TRANSPOSITION)
过程
a) 共合体形成 切口－连接－复制
b) 拆分
靶位点的DR形成
3） 非复制型转座（nonreplicative transposition)
转座子从供体一个位点转移到受体新位点处，供体 位点留下缺口，受到损伤（严重时致死）或宿主修复系 统识别修复。
只需转座酶
4） 保守型复制（conservative transpositionJ)
150bp
1.5kb
P att L C A B S U att R gin
G 倒位区 38kb
C repressor for A, B B 33 kd 与转座有关 A 70 kd 转座酶 U, S 毒性蛋白 attL, attR 与寄主同源，反向重复，转座必需 Gin G区倒位酶
Mu的插入途径
a） 侵入的Mu在溶源化 过程中任意插入寄DNA
e) 靶序列在转座因子两侧会形成正向重复
f) 转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应
4、转座子转座频率的调控 ♥ 每个转座子控制自身转座的核心----控制转座酶的水平
不到一个转座酶分子／世代／细胞
♥ 自发转座频率---10－7
1）、Tn10转座机制
♥ Tn10为复合型转座子 ♥ IS10R元件提供转座酶活性-----合成转座酶的序列 ♥ Tn10转座酶水平是控制转座的关键
Tn1681
IR IS1
大肠杆菌热稳
IR 定毒素I 基因 IR
552 bp
IR IS1
复合转座子结构示意图
♣ 两种类型 2.5 kb
20 kb
a) Tn / TnA family
l 具有IR、转座酶基因、 调节基因（解离酶）、 抗抗生素基因
Tn3 IR TnpA
重组和转座
细菌的attl位点称为att B，其序 列的成份是BOB′，在噬菌体上的att 位点，称为att P，含有POP′。“O” 序列是att B和att P共有的，被称为 核心（core）序列，长15bp，重组 就发生在此序列上。两侧序列B，B′ 和P，P′是作为臂（arms）；臂序列 各不相同。 在att位点的整合和切离并不涉 及反应序列的同源部分。整合需识 别att P和att B；而切离时需要att L和 att R。 整合和切离这两个反应所依赖 的蛋白不完全相同。整合（att B ×att P）反应需要噬菌体int基因的 产物和宿主的整合因子（integration host factor,IHF）。切离（att L × att R）反应需要噬菌体Xis基因的产 物以及Int和IHF蛋白的参与。两个 反应都需要Int和IHF，而Xis在控制 方向上起到重要的作用。它是切离 所需要的，对整合起抑制作用。
四、模板选择（copy chioce）性重组，适用 于RNA病毒，在这种重组中，聚合酶从一 个模板转换到另一个模板来合成RNA，结 果新合成的分子将含有两个不同亲本的遗 传信息
第二节 同源重组
一、Holliday连接： 1. 在同源染色体的相 同位点产生切口 2. 两条染色体的DNA 链发生交叉 3. 切口封闭，形成 holliday junction(或chi结构) 4. Branch migration （分枝迁移） 5. 在两对同源链的其 中任意一对上产生 切口，拆分中间体
非复制转座的断裂和 再连接过程： 在非复制转座方式中， “ strand transfer complex ”中 供体的未 断裂链被切开，转座 子两侧的靶链则被连 接
五、TnA家族转座需要转座酶和解离酶
DNA的重组
有些细菌在自然条件下不发生转化或转化 效率很低，但在实验室中可以人工促使转化。 例如大肠杆菌，用高浓度Ca2+处理，可诱导细 胞成为感受态，重组质粒得以高效转化。
转化过程涉及细菌染色体上10多个基因编码的功能。 转化过程涉及细菌染色体上10多个基因编码的功能。如：感受态因、 10多个基因编码的功能 感受态因、 与膜结合的DNA结合蛋白、自溶素、多种核酸酶等 DNA结合蛋白 与膜结合的DNA结合蛋白、自溶素、多种核酸酶等。感受态因子诱导与 感受态有关的蛋白质表达，自溶素使与膜结合的DNA结合蛋白、 DNA结合蛋白 感受态有关的蛋白质表达，自溶素使与膜结合的DNA结合蛋白、核酸酶 裸露，当游离DNA与膜结合的DNA结合蛋白结合后， DNA与膜结合的DNA结合蛋白结合后 裸露，当游离DNA与膜结合的DNA结合蛋白结合后，核酸酶使其中一条 链降解，另一条链被吸收，与染色体DNA重组。 DNA重组 链降解，另一条链被吸收，与染色体DNA重组。
3.细菌的转导 转导(transduction)是通过噬菌体将细菌基因 从供体转移到受体细胞的过程。 转导有两种类型 普遍性转导(generalized transduction):是指宿 主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗 DNA 粒DNA的一部分而被带入受体菌。 局限性转导(specialized transduction)：某些温 和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主染色体整合 部位的DNA切割下来取代病毒DNA。
小鼠： J λ C λ3 小鼠：Vλ2 人： Vλ～ 300 J λ C λ6 λ 小鼠重链基因族（ 号染色体 号染色体） 小鼠重链基因族（12号染色体）
细菌的结合作用
traS和traT基因编码表面排斥蛋白，阻止F+细胞之间的转移，F+细胞的性菌毛与F-细胞 基因编码表面排斥蛋白，阻止F 细胞之间的转移， 细胞的性菌毛与F
8-第八章--位点特异性重组与DNA的转座
反转录病毒生活周期
（2）反转录病毒基因组结构与功能
◆ 含有3-4个基因，实为编码区，每各编码区通过加工产 生多种蛋白（多聚蛋白），经酶切成为单一的蛋白质形 式。
◆反转录病毒mRNA通常结构，5 ’端加帽，3’端与polyA 相连。
◆全长的mRNA被翻译时，产物为gag和pol 蛋白。翻译 从第一个起始密码子开始而终止于第一个终止密码子， 产物为gag蛋白。表达pol 蛋白必需越过终止密码子，效 率为5%，因此，gag蛋白是gag-pol蛋白的20倍。
◆ 控制因子家族是通过这两种因子相互作用来划定 的。一个家族由单个类型的自主因子组成，这些因子 由很多种非自主因子相伴随。
◆ 玉米Ac-Ds系统的结构
☉Ac序列由含5个内含子的单个基因编码，其产物为转座酶， 末端有11bp的IR和8bp的DR。
☉Ds是由Ac缺失产生的，Ds9缺失194bp；Ds6只保留2Kb。 转座酶失活但保留完整的转座酶作用位点（包括末端）。
玉米色斑的形成
（2）玉米的控制因子家族
McClintock还发现了Spm-Dspm系统。每个家 族都有自主性因子和非自主性因子。
◆ 自主性因子有切离和转座能力。可插入任何位点 产生不稳定的或可“突变”（mutable）等位基因。自 主性因子的丢失，可使可变的等位基因变成稳定的等 位基因。
◆ 非自主性因子是稳定的，自身不能转座，来源于 失去反式作用功能的自主因子，而这种功能是转座所 必须的。
（2）P 因子
◆研究发现，杂种不育是由于在W位点插入P因子（P element）所致，P品系有P因子，M品系无P因子。
◆P因子长2.9 Kb ，有4个开放阅读框(ORF)，末端有 31bp反向重复序列，靶DNA产生8bp的正向重复序列。
分子生学技术-第七章 DNA的重组与转座
2、复合式转座子
它是一类较复杂的转座子，由两个重复序列 夹着一个或多个结构基因组成。除了含有转位相 关的功能外，还带有一些其他基因，如抗药性基 因、抗重金属离子基因等。 它们都具有末端反向重复序列、可编码基因 和插入位点的正向重复序列
TnA转座子：
结构较复杂，长度约5000bp。两端没 有IS结构，仅含有两个末端反向重复序列， 一般约38bp。内部通常含有转位相关的基 因和抗药性基因等，插入位点约5bp。
②果蝇中的转座子—P转座子 两端有31bp的反向重复序列,靶位点产生8bp 的正向重复序列,有四个外显子和三个内含子， 在体细胞中,只有前两个内含子被切除,产生一个 转座阻遏蛋白;在卵细胞中,三个内含子全部被切 除,可产生转座酶,导致P转座子转座和后代不育。
四、转座的遗传学效应
a、转座引起插入突变 各种IS、Tn转座子都可引起突变 b、转座产生新的基因 转座上存在一些抗药性基因或抗重金属基因 等
一、霍利迪结构(Holliday Structure)
霍利迪结构：它是DNA重组过程中的一个中间体， 重组时两个DNA双链体以四股DNA在连结点形成的十字 形DNA分子构象。
异源双链 (Hetero duplex)：指在重组部位，每条双 链中均有一段DNA链来自另一个双链中的相对链。
分支迁移（Branch migration）：一旦两个重组的 DNA分子形成霍利迪结构，交叉连接点很容易像拉链一 样移动，从而扩大异源双链体区域，这一过程叫分支迁 移。
2、Rec BCD核酸酶 Rec BCD蛋白具有DNA解螺旋酶、核 酸内切酶和外切酶的活性。它可以帮助有游 离末端的DNA形成单链DNA片段，从而有 利于RecA 蛋白作用。 它识别并切割Chi序列：5'GCTGGTGG-3'
DNA的重组与转座培训教材(PPT 93页)
同源，二者功能相关。 该基因的突变造成双链断裂积累，且无法形成 正常的联合复合物，但此蛋白不能在体外与单 链DNA形成纤丝，表明原核与真核的同源重 组机制可能不同。
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特异位点重组 广泛存在于各类细胞，有关主要过程：
某些基因表达的调节； 发育过程中程序性DNA重排； 有些病毒和质粒复制中发生的整合与切除。
666666666666第............111112333111.........六同特D123331233...λ.N切章源异同异细细1243噬A除重位源 源 菌 菌细遗细细菌重D组点重双基的菌传菌菌体组N重组链因特的转的的D技NA组的与转异接化转细术A的分基移位合导胞整子 因 与 点作融重合模转重重用合与组型换组组与转6666666666666.............4444444454444座...........D逆12223462351..逆逆逆N转转转转转转真12A转转转录座座座座座核插复的座座座转子子子子引生入合转子子子座的的转转起 物序转座的 的的子概分座座遗的列座结作生念类的的传转(子I构用物S机特学座(T特机学因制征效因n点制意)子应子义)
发重组； ③断裂后形成单链3‘游离端，后者侵
入到双链DNA内，寻找同源区域并 配对结合，产生短的链置换区； ④断裂单链游离端彼此交换，每条链 与另一对应链连接，形成Holliday 中间体
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⑤ 通 过 RuvA和 RuvB 引发分支迁移，产生 异源双链DNA； ⑥通过RuvC形成拆分 口 ， 将 四 链 DNA 复 合 体按不同方向拆分， 形成片段重组体和拼 接重组体。
选择
1、紫外线照射对DNA分子的损伤主要是: ( D )
A.碱基替换； B.磷酸酯键断裂； C.碱基丢失； D.形成共价连接的嘧啶二聚体。
3 遗传重组与转座(第3节至第4节)
双转座子插入所引起的外显子改组示意图
8、真核生物的转座成分
根据转座机制目前分为两类： a) 转座机制与细菌的转座子类似 遗传信息： DNA→DNA
♥ 玉米的Ac-Ds元件、果蝇的P元件和FB元件等
b) 转作机制类似逆转录病毒 遗传信息： RNA→DNA→RNA
♥
如：逆转录病毒、果蝇的Copia元件、酵母的Ty元件
不准确切除：留下转座子残迹，产生插入突变，但 转座子标志消失。
转座子切离所造成的序列变异
⑥外显子改组
当二个转座子被同一转座酶识别而整合到染色体的邻
近位置时，则位于它们之间的序列有可能被转座酶作用而 转座，如果这DNA序列中含有外显子，则被切离并可能 插入另一基因中，这种效应称为外显子改组(exon shuffling)( 图)。 外显子改组将导致基因组中新基因的产生。
得1983年的诺贝尔奖。
玉米地中的先知 Barbara McClintock （芭芭拉· 麦克林托克）：1902-1992
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转座子的定义
1）转座子(元)或转座元件 (transposon or transposable element): 即能够反复插入到基因中许多位点的特殊DNA片段， 它们可从一个位点转移到另一个位点，从一个复制子到另 一个复制子。
M型（母本贡献的，maternal contributing）
M（♂）×P（♀） P（♂）×M（♀） 后代不育 后代可育。
阻遏P因子的转座
转座酶
雄性染色体 P 因子
ORF0 ORF1 ORF2 ORF3
P 品系 (P♂×P♀) 雌性染色体 P 因子
ORF0 ORF1 ORF2 ORF3
P 细胞型 66KD 阻遏物
8 第八章__位点特异性重组与DNA的转座
（2）P 因子 ◆ 研究发现 ， 杂种不育是由于在 W 位点插入 P 因子 （ P element）所致， 品系有P因子， 品系无P因子。 element）所致，P品系有P因子，M品系无P因子。 因子长2 个开放阅读框(ORF) (ORF)， ◆ P 因子长 2.9 Kb ， 有 4 个开放阅读框 (ORF) ， 末端有 31bp反向重复序列， DNA产生 bp的正向重复序列 bp反向重复序列 产生8 的正向重复序列。 31bp反向重复序列，靶DNA产生8bp的正向重复序列。 一个P品系果蝇带有30 50拷贝的 因子，其中1 30- 拷贝的P ◆一个 P 品系果蝇带有30-50 拷贝的 P因子，其中1/3具完 整结构， 不完整的P因子是由于缺失而产生的， 整结构 ， 不完整的 P 因子是由于缺失而产生的 ， 丧失转 座能力。 座能力。 因子的激活有组织特异性，它仅发生在生殖细胞中。 ◆P因子的激活有组织特异性，它仅发生在生殖细胞中。 因子在体细胞和生殖细胞中都转录。 但 P 因子在体细胞和生殖细胞中都转录 。 组织特异性表 现在不同的细胞中转录的方式不同（剪接方式不同） 现在不同的细胞中转录的方式不同（剪接方式不同）。
2. 位点特异性重组酶利用共价蛋白-DNA中间体切割 位点特异性重组酶利用共价蛋白-DNA中间体切割 分离与连接DNA。 分离与连接DNA。
--位点特异性重组酶有两个家族：丝氨酸重组酶与酪氨酸 --位点特异性重组酶有两个家族： 位点特异性重组酶有两个家族 重组酶。 重组酶。
丝氨酸重组酶与酪氨酸重组酶使用的共价蛋白-DNA中间体。 丝氨酸重组酶与酪氨酸重组酶使用的共价蛋白-DNA中间体。
玉米色斑的形成
（2）玉米的控制因子家族
McClintock还发现了 Spm-Dspm系统 McClintock 还发现了 Spm-Dspm 系统 。 每个家族都 还发现了Spm 系统。 有自主性因子和非自主性因子。 有自主性因子和非自主性因子。 自主性因子有切离和转座能力。 自主性因子有切离和转座能力 。 可插入任何位点 产生不稳定的或可“突变” mutable）等位基因。 产生不稳定的或可“突变”（mutable）等位基因。自 主性因子的丢失， 主性因子的丢失 ， 可使可变的等位基因变成稳定的等 位基因。 位基因。 非自主性因子是稳定的，自身不能转座， ◆ 非自主性因子是稳定的 ， 自身不能转座 ， 来源于 失去反式作用功能的自主因子， 失去反式作用功能的自主因子 ， 而这种功能是转座所 必须的。 必须的。 ◆ 控制因子家族是通过这两种因子相互作用来划定 一个家族由单个类型的自主因子组成， 的 。 一个家族由单个类型的自主因子组成 ， 这些因子 由很多种非自主因子相伴随。 由很多种非自主因子相伴随。
分子生物学第7章 DNA的重组与转座
Barbara McClintock 芭芭拉·麦克林托克) (芭芭拉 麦克林托克) 19021902-1992
C基因-Ds基因-Ac基因： Ac-Ds 控制系统 基因-Ds基因-Ac基因： Ac基因 基因 《玉米易突变位点的由来与行为》(1950)，《染色体结构和基 玉米易突变位点的由来与行为》(1950)， 因表达》 因表达》(1951)
7.2.2 细菌的特异位点重组
鼠伤寒沙门氏菌H1鞭毛蛋白和 鞭毛蛋 鼠伤寒沙门氏菌 鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋 鞭毛蛋白和 白抗原表达的互变，称为鞭毛相转变， 白抗原表达的互变，称为鞭毛相转变， 这种转变是由H片段倒位决定的 片段倒位决定的， 这种转变是由 片段倒位决定的，此倒 位是由于特异重组位点hix发生重组后引 位是由于特异重组位点 发生重组后引 起的。 起的。
整合位点---attB、attP ◘ 整合位点 切除位点---attL、attR 切除位点 整合过程需要λ整合酶 ◘ 整合过程需要 整合酶 （integrase Int）（ 编码） ）（λ编码） ）（ 编码 和寄主的整合宿主因子IHF 和寄主的整合宿主因子 （integration host factor） ） 共同作用 ◘ 整合后的附着位点为 attL（BOP’） （ ） attR（POB’） （ ）
Ⅰ型：两末端有相同的IS序列，或正向，或反向。 两末端有相同的IS序列，或正向，或反向。 IS序列 Ⅱ型：末端有反向重复序列。如TnA家族 末端有反向重复序列。 TnA家族
Tn A家族: A家族: 家族
TnA是复制型转座的转座子，长约5kb左右 TnA是复制型转座的转座子，长约5kb左右 。 是复制型转座的转座子 5kb 两端具有末端反向重复序列（而不是IS），长约38bp左右 IS），长约38bp左右， 两端具有末端反向重复序列（而不是IS），长约38bp左右， 任一个缺失都会阻止转座。 任一个缺失都会阻止转座。 中部的编码区编码三个基因：转座酶，解离酶和抗性基因， 中部的编码区编码三个基因：转座酶，解离酶和抗性基因， TnA家族都带有抗性标记 TnA家族都带有抗性标记 。 靶位点具有5bp的正向重复序列。 5bp的正向重复序列 靶位点具有5bp的正向重复序列。 解离位点（ TnA家族特有的内部位点 家族特有的内部位点。 解离位点（res）是TnA家族特有的内部位点。
DNA的重组与转座
根据不同的机制，可将重组分成4类： • 同源性重组（homologous recombination） • 位点特异性重组（site-specific
recombination） • 异常重组（illegitimate recombination) • 转座重组（transposition recombination）
• Holliday连接体也能通过碱基之间氢键的断裂 和再连接而发生左右移动。这个过程称为支链 迁移（branch migration)。
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• Holliday认为在DNA分子上存在某些位点，特 殊的引发重组的酶能够识别这些位点，确保两 条链在相同的部位被切断。
• 目前还没有足够的证据证明这些位点的存在。
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• 一旦Holliday连接体形成后，它能进行重排从 而改变链的彼此关系。这种重排称为异构化， 因为在此过程中没有键的割裂。
• 一旦形成Holliday连接体后，就能被拆分。是 否发生重组依赖于拆分时Holliday连接体的构 象。
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• Holliday模型被称为双链侵入模型，因为由于 每一个DNA分子的一条链侵入到另一个DNA 分子，它解释了在重组时两个DNA分子的异源 双链是如何形成的。
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• 真核生物减数分裂时的染色体之间的交换， 某些低等真核生物及细菌的转化、转导、 接合，噬菌体的整合等都属于同源性重组 这一类型。
• 在整个基因组中，同源重组的频率并不恒 定，并且跟染色体的结构有关。例如在异 染色体附近遗传物质的交换要受到抑制。
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1. 进行同源重组的基本条件
DNA的重组(考研分子)知识点梳理
DNA的重组（考研分子）知识点梳理1.D NA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合称为遗传重组（genetic recombination）或基因重排（genetic rearrangement），重组产物为重组体DNA，DNA的重组广泛存在于各位生物中，真核生物多发生在减数分裂同源染色体之间的交换2.D NA重组能够迅速增加群体的遗传多样性，使有利的变异与有害的变异分开，通过优化组合积累有意义的遗传信息；为DNA的损伤或复制障碍提供修复机制；调控某些基因的表达或生物的发育过程3.D NA重组（recombination）●概念：指发生在DNA分子内或DNA分子之间的核苷酸序列的交换、重排和转移的现象，是已有遗传物质的重新组合过程，包括同源重组、位点特异性重组和转座重组，是基因变异和物种进化的遗传基础●作用：生物体利用重组产生新的基因或等位基因组合、病毒利用重组将自身DNA整合到宿主细胞DNA中；基因工程技术利用重组进行基因敲除和遗传作图、生物体利用重组进行重组修复●分类●同源重组（homologous recombination）●概念：又称为一般性重组（general recombination），它是由两条具有同源区的DNA分子，通过配对、链的断裂和再连接而产生片段交换的过程，不依赖序列的特异性，只依赖序列的同源性，包括细菌的接合、转化和转导真核生物同源染色体之间的交换等●同源重组的类型●解释同源重组机制的模型●Holliday 模型●内容1)两个同源染色体DNA相互靠近，排列整齐2)两条链在对应的位置上各产生一个单链的断裂3)被切开的链相互入侵、交换、连接形成Holliday中间体4)通过分支迁移产生异源双链DNA5)Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组DNA，根据切开方向分为片段重组体（切开的链与原断裂的链为同一条，产生的重组体有一段异源双链区，异源双链区两侧来自同一亲本DNA链，左）和剪接重组体（切开的链不是原来断裂的链，重组体异源双链区两侧不是来自同一亲本DNA，右）●不足：Holliday模型能够较好地解释同源重组现象，但是两个DNA 分子对应链的相同位置发生断裂的可能性很小●单链断裂模型1)两个同源染色体中某一个DNA分子的一条链发生断裂产生3'末端，入侵另一个DNA分子的同源区的互补链并与之配对，●双链断裂模型1)在一个DNA分子中产生一个双链断裂，DNA外切酶在断裂处进行修剪，产生3'末端，3'末端入侵另一条DNA分子并与之配对，对应的链则被置换出来以原来断裂的链配对，经过修复合成和链的再连接形成两个交叉●细菌的基因转移与重组的机制●接合（conjugation）1)细菌的细胞相互接触时遗传信息从一个细胞转移到另一个细胞的过程2)供体细胞被定义为雄性，受体细胞被定义为雌性，转移DNA的过程由接合质粒完成，能促使染色体DNA基因转移的接合质粒称为F因子，F因子中与基因转移有关的转移区约占整个染色体的三分之一，其中的tra基因编码的蛋白质是构成F性菌毛的亚基，F性菌毛接触受体细胞表面后接合过程被活化，tra S和traT基因编码表面排斥蛋白（防止与F⁺细菌接合），F⁺细菌与受体细胞靠近后，TraD蛋白（一种内膜蛋白）作为DNA的转移通道，Tra I在Tra Y的协助下结合到接合质粒的转移起点切开一条链并与5'端共价结合，Tra I也有解旋酶活性，5'端进入受体细胞内便开始合成互补链，因此受体细胞变为F⁺细胞，而供体中的单链也合成互补链3)F因子也能整合在大肠杆菌染色体DNA上，当F因子启动接合时，质粒基因中转移起点被切开，其前导链引导染色体DNA单链转移，至于转移DNA链长短取决于转移过程的时间，转移到受体中的DNA单链先互补配对成双链，然后与受体DNA发生重组，外源基因的插入需要在两端分别形成交叉连接，即发生两个位点的重组4)整合在染色体DNA中的F因子也可能被切下来，不精确切割使切下来的F因子常带有宿主的染色体基因，称为F'因子，F'细胞与F⁻细胞杂交，供体部分的染色体基因随F'因子进入受体细胞，无需整合就能表达（因为接合质粒上有转录起始点），实际上形成部分二聚体，此时受体细胞变为F'，该过程叫性导（sexduction）●遗传转化（genetic transformation）1)是指细菌品系由于吸收了外源DNA（转化因子）而发生遗传性状改变的现象，具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞（competence cell），感受态是暂时的，与特定的生理状态有关2)感受态因子可以诱导与感受态有关的蛋白的表达，如自溶素能使细胞表面的DNA结合蛋白和核酸酶暴露，当游离的DNA与DNA结合蛋白结合后，核酸酶使其一条链降解，另一条链被吸收进入细胞，并与感受态特异蛋白结合整合到染色体DNA中发生重组3)也有少数细菌可以吸收双链DNA4)用高浓度Ca²⁺处理大肠杆菌可以使其转化为感受态●转导（transduction）1)是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程，包括普遍性转导和局限性转导2)普遍性转导：宿主细胞基因组任意一段DNA组装到成熟噬菌体颗粒内而被代入受体菌3)局限性转导：某些温和的噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主的染色体整合部分的DNA切割下来取代病毒DNA●细胞融合（cell fusion）1)由于细菌细胞质膜融合导致基因转移和重组，实验室内可以通过使用溶菌酶将去除细菌细胞壁的肽聚糖使之成为原生质体进而完成融合●与重组有关的酶1)RecA蛋白●此蛋白可以诱发SOS反应和促进DNA单链的同化（单链与同源DNA分子双链发生链的交换）从而使重组过程中DNA配对、形成Holliday中间体和分支移动等过程能够实现●机理：数千个RecA蛋白单体与DNA单链结合形成螺旋状纤丝，此复合物与双链DNA作用使其部分解旋，然后迅速扫描单链DNA的互补序列，一旦找到，互补区双链进一步解旋与单链DNA沿5'——→3'方向互补配对，直到交换终止（ATP提供能量）●该基因突变会导致双链断裂积累，无法形成正常的联会复合体●真核生物中RecA的类似物：酵母中的Rad51和Dmc1蛋白；人体中的BCRA1和BCRA2蛋白，若编码这俩蛋白的基因突变会导致乳腺癌2)RecBCD蛋白●多功能酶：依赖于ATP的核酸外切酶活性、可被ATP增强的核酸内切酶活性（内外切都有）、ATP依赖的解旋酶活性●DNA分子发生双链断裂后，RecBCD结合在游离端，使DNA双链解旋并降解，当其移动到χ 位点（5'-GCTGGTGG-3'），在其3'端4—6个核苷酸处切开，产生有3'端的DNA单链，之后结合有RecA和SSB的DNA单链入侵双链DNA形成D环结构，RecA协助寻找同源区，互补配对后RecA和SSB被释放3)Ruv A、Ruv B和Ruv C蛋白●Ruv A蛋白能够识别Holliday 连结体的交叉点并结合，使其变成四方平面构象，并帮助Ruv B蛋白六聚体在交叉点上游结合在DNA双链上，通过水解ATP使双链解旋，并使异源链螺旋化，最后Ruv C蛋白切开联结体（分支迁移就是为了找到ATTG序列，才能切开）●减数分裂时的同源重组●启动重组的机制不同：双链断裂模型，但重组仅出现在断裂的一侧，杂合DNA只出现在同一条染色单体上●特异位点重组（site-specific recombination）●只发生在DNA的特异位点之间，依赖于序列的特异性，对序列的同源性要求低●λ噬菌体与大肠杆菌的位点特异性重组●特征：基本步骤同同源重组（链的交换、形成Holliday中间体、分支迁移、拆分），但是不需要RecA参与，分支迁移距离较短，依赖于特定的蛋白质识别重组位点，催化重组反应。
基因组重组和转座子活动
基因组重组和转座子活动作为生命的基本单元，细胞在生长发育、适应环境等过程中需要不断地调控基因表达。
而基因组重组和转座子活动作为基因表达中的一个重要过程，也在细胞发育和进化过程中发挥着重要作用。
一、基因组重组基因组重组是指在细胞分裂过程中，染色体上一段DNA序列与另一段DNA序列交换位置的现象。
这一过程可以发生在减数分裂过程中，也可以发生在有丝分裂过程中。
在减数分裂过程中，有趣的是，同源染色体之间的互换过程可以促进基因的多样性，对在进化过程中的适应性有重要作用。
同样，在有丝分裂过程中，由于在细胞周期的S期复制中，丝粘连复合物的结构可以导致同源染色体之间的交叉而重组，从而形成新的基因组序列。
基因组重组既重要又复杂，因此，它需要细胞中的一些特殊酶来协助完成，包括重组酶、拼接酶和核酸酶等。
二、转座子活动转座子是指在基因组中具有自主转移能力和引起基因组重组的DNA片段。
插入到一个基因区域可以革命性地改变基因的表达，所以转座子的活动可以起着丰富、多样化物种基因组的作用。
然而，由于转座子的位置特异性和非特异性种族特异性的现象时有喜见，转座子也可以带来某些负面效应，如遗传疾病和基因突变。
转座子可以通过不同的机制来使它们移动和影响基因组。
其中，一种被称为复制粘贴转移机制。
这种机制涉及在高危核酸中逆转录酶的作用下，从转座子中复制DNA片段，并插入到宿主的相同或不同部位。
另一种机制被称为切-粘式转移机制，其中转座子内部的酶可以切除DNA，然后插入到宿主某个区域的特定位点。
三、基因组重组和转座子活动协同作用基因组重组和转座子活动是不可分割的。
转座子的运动和基因组的重新组合是一个复杂的动态过程，对于各种生命现象都有很大的影响，包括不同物种之间的进化、种群的遗传多样性、染色体数目的变化、疾病的产生等。
例如，转座子可以插入到调控基因的区域，导致这些基因的表达被调节。
基因组重组可以导致整个基因和调控区域之间的距离发生变化，从而影响基因组的整体表达。
第五讲 DNA的重组与转座
插入突变失活是转座的最直接效应，但转座 也可以通过干扰宿主基因与其调控元件之间的关
系或改变DNA的结构而影响基因的表达。
转座子插入靶序列后在受体DNA中形成3~12bp 的正向重复序列，在切离后可能就给DNA留下一小 段多余的靶位序列，从而导致编码的突变。
Meselson-Radding 模型
DNA单链形成可在一条DNA双链中首先产生， 随着缺刻处DNA链的修复合成，游离出的单链末端
侵入相邻DNA双链中，与同源部分配对结合，被替
换的DNA链形成一个逐渐增大的D-loop。D-loop断
开后产生的单链末端交叉侵入相邻DNA双链中，
DNA自由末端共价连接形成Holliday结构。
第五讲
DNA的同源重组与转座
基因重组概念
新的DNA分子中含有原来的两个DNA 分子 的片段。所有DNA均是重组DNA。 DNA分子内或分子间发重型遗传信息的重新 组合，称为遗传重组或基因重排。重组产物称
为重组DNA。
减数分
裂时，同源染色体在每一代都发生于有相同
RuvA RuvB
RuvC
特异位点重组
特异位点重组是指在重组酶介导下，在特异的重组位点间
发生重组，导致重组位点间交互交换的一种精确重组形式。
λ噬菌体的整合与切除
λ噬菌体编码λ整合酶（integrase），这个酶 能指导噬菌体DNA插入E.coli染色体中。
细菌的特异位点重组
如果一个DNA分子上两个特异位点之间发生重组，其后果 有两种可能性：两个位点之间的节段或被丢失，或被颠倒。有 些生物能够利用这种重组倒置来控制基因的表达。
真核生物的转座子
1.玉米的Ac-Ds调控系统
DNA的重组与转座
主要功能 1.诱发 诱发SOS反应和促进单链 反应和促进单链DNA与同源双链 与同源双链DNA分子发 诱发 反应和促进单链 与同源双链 分子发 生链的交换； 生链的交换； 2.具有多种酶促活性，包括具有蛋白水解酶的活性。 具有多种酶促活性， 具有多种酶促活性 包括具有蛋白水解酶的活性。 外切核酸酶活性，参与 外切核酸酶活性，参与DNA重组 重组 与双链DNA和单链 和单链DNA结合 与双链 和单链 结合 促进互补的单链DNA的复性 的复性 促进互补的单链 参与DNA的修复与重组 的修复与重组 参与
转 化 Transformation Transformation
Heat transformation Electroporation PEG mediated Exogenous DNA insert into vector
for cells
Competent cell
Gene gun (Microprojectile bombardment) Agrobacterium mediated Resteiction Enzyme- mediated DNA Intergration (REMI)
5
与DNA重组有关的酶 与 重组有关的酶
名称 Rec A（重组 （ 作用蛋白A） 作用蛋白 ） Rec E Rec F Rec O RecR Rec BCD (重 重 组酶BCD) 组酶 Ruv A (DNA 重组与修复蛋 白） 编码基因 rec A
(Enzyme in the DNA recombination)
根据转座过程中是否发生复制分为复制型转座和非 根据转座过程中是否发生复制分为复制型转座和非 复制型转座。 复制型转座。 24
非 复 制 型 转 座
形成融合基因的原理
形成融合基因的原理
形成融合基因的原理主要包括两个过程：基因重组和转座。
基因重组是指在染色体中不同基因之间的DNA片段互相交换，并在新的个体中形成新的组合。
基因重组可以发生在同一染色体上的不同位点，也可以发生在不同染色体之间。
这个过程通常发生在减数分裂的过程中，即性生殖细胞的分裂过程中。
通过基因重组，不同基因之间的DNA片段可以重新组合，形成新的基因组合，从而产生新的基因型和表型。
转座是指某些特定的DNA片段（称为转座子）在基因组中的不同位置之间的移动。
转座子可以通过自身编码的酶活性，将自己从一处DNA位置切割并插入到另一处DNA位置中。
转座是一个广泛存在于生物界的现象，可以发生在细菌、真核生物和质粒等生物体的基因组中。
通过转座作用，转座子可以将特定基因从一个基因组位置转移到另一个基因组位置，从而改变基因组的结构和功能。
这两个过程的相互作用，可以让基因组中不同基因之间的DNA片段进行重组和移动，从而形成融合基因。
融合基因的形成既可能是自然界中的随机事件，也可能是人为诱导的实验操作。
融合基因的形成是基因多样性的来源之一，也是生物进化和遗传变异的主要驱动力之一。
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第一节 DNA重组（recombination）
一）、DNA重组
1、概念：是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA分子的过程。
2、意义：重组是遗传学的灵魂，没有重组就没有生物的进化；没有重组也就没有现代的分子克隆技术
二）、DNA重组的类型
1、同源重组（Homologous Recombination）
2、位点特异性重组（Site-specific Recombination）
3、DNA的转座（transposition）
同源重组
一、概述
1、定义：两个DNA分子同源序列之间进行的重组
2、条件：
（1）两个DNA分子有同源序列
（相关的酶可以用任何一对同源序列为底物）
（2）两个DNA分子必须紧密接触
3、发生：
真核生物: 非姐妹染色单体交换相对应的区域。
原核生物: 依赖recA蛋白，并形成 Holliday 结构
Holiday模型（1964年）
二、大肠杆菌同源重组的分子基础
（一）RecA
1、作用：可促进单链同化或单链吸收
RecA具有使DNA单链置换双链中同源链的能力
2、单链同化发生的三个条件
（1）其中一个DNA必须存在单链区
（2）其中一个DNA必须有一个自由3’末端
（3）此单链区和3’末端必须位于两分子之间互补的区域内
（二）RecBCD复合体
1、酶的活性：
（1）核酸酶
（2）解旋酶
（3）ATPase
2、作用：在CHi位点处产生含3`游离末端单链。
（三）CHi位点——RecBCD识别的靶位点
5`GCTGGTGG3`
3`CGACCACC5`
是重组频率较高的部位
E.coli每隔约5~10kb有一个拷贝，
Holliday 结构的形成：
1. 同源序列排列在一起；
2. 酶切。
通过核酸酶和RecBCD蛋白复合体的作用在一对同源DNA上产生切口；
3.入侵。
含有3’端切口的ssDNA被recA蛋白包裹形成recA蛋白-ssDNA细丝；RecA-ssDNA
细丝寻找相对的DNA双螺旋上的相应序列。
4. 游离端交叉连接，形成Holliday 结构
5.通过分支迁移产生异源双链DNA。
6. 空间重排。
十字型两臂旋转180度
7. 解离(两种不同方式)
8. 修补连接
附：基因敲除( Gene knockout)
是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。
位点特异性重组
一、定义：
不依赖于DNA顺序的同源性，而依赖于能与某些酶相结合的特异的DNA序列的存在。
二、噬菌体λ对E.coli DNA的整合
（一）λDNA存在两种形式
裂解状态
溶源状态
（二）通过位点特异性重组实现两种类型间的转换
λDNA整合到宿主DNA 进入溶源状态
λDNA从宿主DNA 中切离进入裂解状态
（三）催化重组的酶
1、整合酶 Int (integrase)：有拓扑异构酶活性
2、整合宿主因子（IHF，integration host factor ）
3、切除酶（excisionase）/ 终止重组
（四）重组位点：
附着位点（attachment site）
attP（ POP’）和attB（ BOB’）有15bp核心序列配对
（五）重组过程：
1、整合： POP’ + BOB’→BOP’—POB
2、切离：BOP’—POB’→ POP’ + BOB’
1、整合的过程
（1）具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与attP和attB位点结合。
（2）Int的拓扑异构酶活性，使两条双链各自断开一条单链，瞬间旋转然后交换连接。
（3）同时在另两条单链之间发生同样的断裂重接，从而完成双链间的重组。
第二节 DNA的转座
一、概念：
转座子（transponsn,简称Tn）, 又称易位子，是指存在于染色体DNA上可以自主复制和位移的一段DNA顺序。
转座子可以在不同复制子之间转移，以非正常重组方式从一个位点插入到另外一个位点，对新位点基因的结构与表达产生多种遗传效应。
二、转座因子的发现和检出
McClintock：
1938年，提出转座基因概念
1944-1950，阐明“Ds-Ac调控系统”
1983年，获诺贝尔生理医学奖
J.Shapiro等：
1980年，证实了可移位的遗传基因存在
三、转座子的基本结构特点
1、自身携带有转座酶基因
2、末端有反向重复序列（IR）
3、转座后两端有正向重复序列（DR）
四、转座子的类型
（一）细菌转座子
1、IS （插入序列, insertion sequences）
特点：
（1）比较小，0.75~1.5kb;
（2）只有转座酶基因
（3）两端有反向重复序列;
2、Tn （复合转座子, composite transposons）
特点：
（1） 2-10kb;;
（2）两端有两个相同或高度同源IS序列
（3）含转座酶基因 / 抗生素基因
3、TnA （TnA family）
特点：
（1）5~25kb;
（2）两端IR（30~40bp）相似或相同；两端无IS组件; （3）转座酶基因 / 解离酶基因 / 抗生素基因
Tn的转座过程（4）Res位点：与共整合体的解离有关
（二）真核生物转座子
1、特点：
（1）两端有IR，
（2）内部有转座酶等基因；
2、举例：
玉米转座子Ac/Ds ，Spm/dSpm ；
果蝇 P因子
玉米转座子Ac/Ds作用机理
五、转座机制
（一）转座相关的酶
1、转座酶:
（1）识别转座子的两端序列和受体DNA的靶序列
（2）切割使转座子从供体DNA中释放出来
（3）在靶位点上作出交错的切割(类似限制酶)
（4）催化一对转酯反应，使转座子3’端与靶位
点相连
2、解离酶:
（1）TnA家族转座必须
（2）催化两个转座子拷贝间的位点特异性重组
（二）非复制型转座
1、非复制型转座定义
转座子作为一个可移动的单位直接被移位，留下一个供体位点（通常产生一个双链断裂的缺口）。
2、非复制型转座过程
（1）转座酶使转座子从供体DNA中释放出来；
转座酶使受体DNA靶位点形成交错切口；
（2）转座子插入交错切口(转座酶--转酯反应) ，
（3）连接并修复缺口单链，受体DNA产生同向重复序列。
（三）复制型转座
1、定义：整个转座子被复制，所移动和转位的仅仅是原转座子的拷贝。
2、复制型转座过程：
（1）转座酶使转座子和受体DNA双链形成交错切口；
（2）转座子两端形成复制叉，复制、连接补齐缺口，形成共整合体；
（3）位点特异性重组（解离酶）；
（4）受体DNA产生同向复序列。
六、转座频率和转座抑制
（一）转座频率
不同转座元件的转座频率不同。
一般为每代10-3 ~10-4次/元件，可能与转位酶的水平有关。
（二）转座抑制
1、DNA甲基化抑制转座子的活动
2、RNA silencing 抑制转座子的活动
七、转座的特点
1. 不需要序列同源性，也不是位点特异性的
2. 效率较低
3. 需要转座子编码的转座酶
4.可发生在同一染色体内或不同染色体之间
5.可以转移到一个新的基因组中的几乎任何部位处，但它们也不能完全随机转移，而是对
某些DNA序列有倾向性
八、转座作用的遗传学效应
1、可引起基因突变——插入或切离；
2、可以产生新基因；
如携带抗药性基因的转座子，既可引起插入突变，也使该位点产生抗药性。
3、转座产生染色体畸变（缺失、倒位等）
4、产生新的变异，有利于进化。
转座直接或间接促进基因组的重排，使相距较远的基因组合到一起，构建成一个操纵子或表达单元，可能产生一些具有新的生物学功能的基因。
转座是产生变异的主要因素之一。
图转座的遗传学效应
九、转座生物学效应举例
自主性因子：能自主转座，如Ac
非自主性因子：不能自主转座，当基因组中存在与其同
家族的自主性因子时，才具备转座功能
十、转座子的应用
功能基因组研究
植物：转座子标签---拟南芥、水稻突变体库
动物：PB因子---小鼠突变体
十一、反转录转座子（retrotransposon）
转座经过RNA阶段。
DNA元件转录成RNA，再逆转录为DNA，然后插入基因组中某一新位点。
类似反转录病毒感染：果蝇 copia，酵母 Ty1，拟南芥菜 Ta1
3.6 本章小结
1. DNA重组
2. DNA转座。