农杆菌EHA105转化条件的优化及水稻愈伤组织遗传转化体系的初步建立

农杆菌EHA105转化条件的优化及水稻愈伤组织遗传转化体

系的初步建立

：以质粒PBI121和gfp作为外源DNA转化农杆菌EHA105，通过对EHA105生长状态的测定，并对重悬液Cacl浓度，速冻时间和热处理温度等实验条件逐一进行筛2

选，以确定EHA105的最优转化条件。然后，分别用被转化的农杆菌侵染水稻愈伤组

织。结果表明，农杆菌 OD值接近0.6经过20mmol/L Cacl2重悬细胞，液氮速冻5600

分钟后于28?处理5分钟，农杆菌的转化效率最高。愈伤组织经GUS染色或荧光观察，外源基因已经转入水稻种子中。

农杆菌；水稻愈伤组织；遗传转化

: Agrobacterium tumefaciens EHA105 was transformed by the plasmid PBI121 and gfp. To difine the best experimental conditions for transformation

of A.tumefaciens the growth rate of the A.tumefaciens EHA105 was measured ,and

the concentration of resuspension solution,freezing time and the thawing

temperature were tested. And then infected mature rice in order to induce

callus with Agrobacterium tumefaciens respective .Result: By resuspended in

Cacl

buffer, frozen in liquid nitrogen for 5 min and thawed in 28? for 5 2

min, the efficiency of transformation was the best. The callus was dyed by

GUS or seen by fluorescence, which can testify that exterior gene has been

transferred into rice.

Agrobacterium tumefaciens; rice callus; Genetic transformation

水稻是世界上重要的粮食作物，并已为分子生物学研究的模式作物之一。因此，

遗传转化已成为水稻分子生物学研究和基因工程的必需手段。虽然已有一些方法（如

基因枪法.PEG法.电极法等）可得到转基因植物（刘明华等1995，Christou等1992，Peng等1992），但由于这些方法有操作复杂.外源基因插入的多拷贝性和不完整性以

及较高比例的不育植株等缺点（Potrykus 1990,Finnegan和McElroy1994）,所以人们一直试图寻找一种更为有效的转化方法。鉴于农杆菌介导的基因转移是双子叶植物

中运用最为广泛而有效的遗传转化系统，因此有许多学者尝试将这一体系用于水稻的

基因转化（李宝健等1990，Li等1992，Chan等1993）。Raineri等（1990）曾报告

用农杆菌转化水稻得到转基因细胞并证明了T-DNA上的NPT?基因和GUS基因在受体细胞中的整合与表达。Chen等（1993）利用农杆菌法获得了一些转基因水稻植株，

Southern杂交证明T-DNA上的基因传递给了后代。由于当时转化效率还很低，加之

一些报告缺乏必要的分子证据或分析数据，因此人们对农杆菌转化法尚有疑问（Potrykus 1990）。

近年来，在根瘤农杆菌转化单子叶植物方面取得了长足的进步。水稻是单子叶植物基

因组研究的模式植物,近年来水稻基因组研究取得了很大进展, 构建了遗传图谱和物

理图谱, 完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测序, 以及第1 号和第4 号染色体的精细测序, 并对第10 号染色体的结构进行了详细分析。Hiei等（1994）报告利用根瘤农杆菌转化粳稻得到大量转基因植株,并提供了详细的分子生物学证据；Rashid等.dong等.Aldemita hodges以及Ishida等于1996年利用Hiei(1994)的转化体系分别在籼稻.爪哇稻.籼粳稻和玉米上获得转基因植株,再次证明根瘤农杆菌介导转化水稻

的可行性和有效性。

本研究利用农杆菌LBA105为测试菌，通过改进和优化冷冻法转化条件，并结合氯

化钙法或TSS法制备感受态细胞，通过分析比较细胞生长状态，重悬液浓度，冻融时

间，热处理温度等条件对农杆菌转化效率的影响，筛选出了方法简单.步骤简便。易操作，并具有较高转化率的实验方案。最后将携带有报告基因质粒PBI121和GFP外源

O ry z a sativa L. ssp. jap 基因的农杆菌EHA105转入以水稻基因组测序品种日本晴(

)水稻中，探索建立起水稻的遗传转化体系。 onica

大肠杆菌DH5α，根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105, 质粒GFP

（携带绿色荧光蛋白基因GFP）和质粒PBI121（携带β - 葡萄糖苷酸酶基因GUS）均

由本实验室保存。

PEG4000 分析纯；DMSO，分析纯；Cacl2, 分析纯 ;Mgcl2, 分析

纯;Nacl 分析纯;j均为西安化学试剂厂产品。利福平（Rif）:工作浓度为

50mg/L,卡

那霉素(kan):工作浓度为50mg/L，均为Sigma产品。

台式高速离心机（Eppendorf）,Centrifuge 6900 型离心机,数显振

荡培养厢，TU-1800型紫外可见光分光光度计（北京美菱），超净工作台（江苏），

WD-9403型紫外分析仪， KUBOTA Corpora2 tion Japan ;PCR仪,PCR System 270 型,Singapore ;电泳仪（北京鼎国1100型）,GeneGenuis 型GYNGENE ,UK。

1.1.4.1 溶液

TE: Tris-HCL 10mmol/L,1mmol/L EDTA,PH8.3。