4第四章 基因克隆的载体-3柯斯质粒
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《基因克隆载体》PPT课件
显性质粒
Ｒ质粒：含有氨苄青霉素Ap、氯霉素Cm、
卡那霉素Km、四环素Tc、链霉素Sm等药物的 抗性基因，可作为选择标记。
Col质粒 Ｆ质粒 降解质粒 Ｔi质粒
隐蔽质粒 蓝藻内源质粒
二、 质粒克隆载体构建的基本策略
１、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝） ２、克隆位点——组装MCS连杆 ３、选择标记基因——抗性基因，Lac Z’基因 ４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率↓↓ ５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等
酵母染色体URA3基因→HindⅢ酶切
pBR322质粒
YEp24 （图3-11）
特征 （1）保留了pBR322的Ａｐｒ和Ｔｃｒ——筛选大肠杆菌克隆子 （2）含URA3标记——筛选酵母菌克隆子 （3）URA3基因——补偿酵母菌ura3突变
优点 （1）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制 （2）转化率高，1μgDNA可获得约104～105个克隆子 （3）稳定高拷贝复制
3．2 病毒（噬菌体）克隆载体
病毒基本结构：
DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为噬菌体。
分类（根据病毒与宿主的关系）： 温和性病毒：
溶原性增殖→构建病毒载体
烈性病毒：
溶菌性增殖→改造后
一、λ噬菌体克隆载体
（一） λ噬菌体性质
λDNA + 外壳蛋白 1、λDNA (48.5kb) 噬菌体中：线性 宿主细胞：环状(cos位点)
λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)， 且约有20kb λDNA可缺失（生长非必需） 3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点
（三）构建的基本策略与技术路线
策略: 切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位 点，插入选择性标记基因，建立体外包装系统。
Ｒ质粒：含有氨苄青霉素Ap、氯霉素Cm、
卡那霉素Km、四环素Tc、链霉素Sm等药物的 抗性基因，可作为选择标记。
Col质粒 Ｆ质粒 降解质粒 Ｔi质粒
隐蔽质粒 蓝藻内源质粒
二、 质粒克隆载体构建的基本策略
１、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝） ２、克隆位点——组装MCS连杆 ３、选择标记基因——抗性基因，Lac Z’基因 ４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率↓↓ ５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等
酵母染色体URA3基因→HindⅢ酶切
pBR322质粒
YEp24 （图3-11）
特征 （1）保留了pBR322的Ａｐｒ和Ｔｃｒ——筛选大肠杆菌克隆子 （2）含URA3标记——筛选酵母菌克隆子 （3）URA3基因——补偿酵母菌ura3突变
优点 （1）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制 （2）转化率高，1μgDNA可获得约104～105个克隆子 （3）稳定高拷贝复制
3．2 病毒（噬菌体）克隆载体
病毒基本结构：
DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为噬菌体。
分类（根据病毒与宿主的关系）： 温和性病毒：
溶原性增殖→构建病毒载体
烈性病毒：
溶菌性增殖→改造后
一、λ噬菌体克隆载体
（一） λ噬菌体性质
λDNA + 外壳蛋白 1、λDNA (48.5kb) 噬菌体中：线性 宿主细胞：环状(cos位点)
λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)， 且约有20kb λDNA可缺失（生长非必需） 3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点
（三）构建的基本策略与技术路线
策略: 切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位 点，插入选择性标记基因，建立体外包装系统。
柯斯质粒名词解释
柯斯质粒名词解释柯斯质粒是一种常用于基因工程和分子生物学实验中的载体。
下面将对柯斯质粒进行解释：第一步：什么是柯斯质粒？柯斯质粒（Cosmid）是一种来源于噬菌体lambda（Λ）的人造DNA，其结构包括Λ噬菌体的一部分DNA序列和细菌质粒的某些序列。
这种货物可以用作质粒或噬菌体，并可承载较大的DNA片段（约为30-40 kb）。
第二步：柯斯质粒的作用是什么？柯斯质粒在基因工程和分子生物学研究中起到了关键作用，可以用于以下方面：（1）分离和承载大分子DNA，包括蛋白质的启动子、转录因子和基因。
（2）将目标DNA片段克隆至柯斯质粒中，在细菌中进行繁殖，从而扩增目标DNA。
（3）柯斯质粒也可用于进行“遗传转换”，将重组DNA转移到宿主细胞中。
第三步：柯斯质粒有哪些特点？（1）可以承载大分子DNA，使其被更容易克隆、传递和测序。
（2）柯斯质粒轻松进入宿主细胞，所需步骤相对简单。
（3）柯斯质粒DNA的有机合成方法相对较简单，可以根据需要进行调整。
第四步：如何使用柯斯质粒？使用柯斯质粒需要一定的实验技能和经验。
一般需要进行以下基本步骤：（1）选取适当的宿主菌株，即一种可接收目标DNA的细菌，如大肠杆菌E.coli。
（2）选择目标DNA，并将其连接到柯斯质粒上。
（3）通过转化或其他方法将质粒引入专门设计的宿主细胞中。
（4）培养并筛选出含有柯斯质粒的细胞，以发现所需的克隆。
第五步：柯斯质粒的优势和不足之处是什么？优势：（1）柯斯质粒可以承载30-40 kb的大分子DNA片段。
（2）柯斯质粒的构建方法相对简单。
（3）柯斯质粒可以用于进行基本实验和遗传转换。
（4）转换后的细菌可以扩增并表达具有重组DNA的目标蛋白质。
不足之处：（1）柯斯质粒大小较大，限制了其在细胞内的复制和扩增。
（2）克隆过程中经常会发生重组，导致克隆的不稳定性高、克隆产率低。
（3）柯斯质粒的筛选方法不太灵活，与筛选后的克隆清单之间的相互作用不一定是合适的。
基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
第四章 基因工程的质粒载体
（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物 使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构 转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合 配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能 够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复， 所以就出现这两种构型之间的平衡状态。
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
第四章基因克隆的载体
第二节 噬菌体载体
（Bacteriophage，简称phage）
一、λ噬菌体载体
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genome
溶源阶段
(整合到寄主染色体上)
溶菌阶段
(复制和释放)
The phage cos ends(cohesive-end site )
Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段 引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活 后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。
λgt 10
LA 32.7
cI EcoR I
RA10.6
Charon 16A
LA 19.9
lac Z EcoR I
RA21.9
λ 替换型载体（取代型载体）
MCS
M13mp19
MCS
EcoRI BamHI HindIII PstI BglI
BglI PstI HindIII BamHI EcoRI BamHI & PstI
B P
P B
B
P
B
P
B
P
M13克隆 载体分子 结构图
单链DNA噬菌体载体
M13、f1、fd 优越性： 1.单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这 种复制形式的DNA简称RFDNA； 2. 不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌； 3. 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多少制约的， 不存在包装限制问题； 4. 容易测定外源DNA片断的插入取向； 5. 可产生含外源片断的单链DNA分子。
1.酶切 3.组装
2.连接
4.侵染
（Bacteriophage，简称phage）
一、λ噬菌体载体
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genome
溶源阶段
(整合到寄主染色体上)
溶菌阶段
(复制和释放)
The phage cos ends(cohesive-end site )
Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段 引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活 后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。
λgt 10
LA 32.7
cI EcoR I
RA10.6
Charon 16A
LA 19.9
lac Z EcoR I
RA21.9
λ 替换型载体（取代型载体）
MCS
M13mp19
MCS
EcoRI BamHI HindIII PstI BglI
BglI PstI HindIII BamHI EcoRI BamHI & PstI
B P
P B
B
P
B
P
B
P
M13克隆 载体分子 结构图
单链DNA噬菌体载体
M13、f1、fd 优越性： 1.单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这 种复制形式的DNA简称RFDNA； 2. 不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌； 3. 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多少制约的， 不存在包装限制问题； 4. 容易测定外源DNA片断的插入取向； 5. 可产生含外源片断的单链DNA分子。
1.酶切 3.组装
2.连接
4.侵染
第四章(质粒载体)ppt课件
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25
6.质粒的复制类型
• 两种不同的复制型：
• “严紧型” (stringentplasmid)；
• “松驰型” (relaxedplasmid)。
• 质粒拷贝数的定义：
•
每个细菌细胞中所含有的质粒DNA
•
分子的数目
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26
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27
7．质粒的不亲和性
(1) 质粒的不亲和性现象 (2) 质粒不亲和性的分子基础
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57
第四节重要的质粒载体
• 一.大肠杆菌质粒载体
•ห้องสมุดไป่ตู้
1．pSCl01质粒载体
•
•
2．Co1E1质粒载体
•
3．pBR322质粒载体
•
4．pUC质粒载体
•
5．丧失迁移功能的质粒载体
6.能在体外转录克隆基因的质粒载体
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58
一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体的形体图
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19
大肠杆菌F因子基因图
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20
(3)质粒DNA的接合转移机制
•
①细胞交配对的形成： 大肠杆菌F质粒编
码的特异性性须，在受体细胞的识别以及在确立
配对细胞之间的表面接触中起着重要的作用。它 至少需要25种以上的转移基因编码产物的参与。
•
②质粒DNA的转移F质粒DNA的转移是从转
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66
pBR322质粒载体的构建过程
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67
pBR322质粒载体的形体图
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68
pBR322质粒载体的结构来源
基因克隆的载体
3.常用的质粒载体
第二节 噬菌体载体（phage vectors）
噬菌体的生物学特性 噬菌体载体构建 M13噬菌体的生物学特性
M13噬菌体载体
1. 噬菌体的生物学特性
溶菌周期(lytic cycle)：
噬菌体将DNA注入 寄主细胞后很快环 化，然后进行自我 复制、蛋白衣壳合 成和新噬菌体颗粒 的组装，最后使寄 主细胞破裂而释放 出大量的子代噬菌 体。
基因克隆的载体
引 言（introduction） 第一节 质粒载体（plasimid vectors） 第二节 噬菌体载体（phage vectors） 第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）
引
一、基因克隆的本质
言
是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，
三个确保低拷贝质粒精确分
配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , ibrary）
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的 片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入 相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组
cILytic cycle clear plaques
selecting recombinant phage via insertional inactivation of the cI gene
Replacement vectors(替换型载体)
4.M13噬菌体载体
（1）M13噬菌体增殖
或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’ 端分别加上几个C或G，成为粘性末端。
接上人工接头 粘性末端 末端转移%的mRNA时所需要的克隆数目。
N=
ln (1-p) ln:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的 n 比例 N：所需的重组载体数（克隆数）
三四章分子克隆载体---答案_完_
三四章分⼦克隆载体---答案_完_第三章分⼦克隆载体（Molecular cloning vectors）⼀、名词解析1.质粒：质粒是染⾊体外的遗传因⼦，能进⾏⾃我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋⽩质）；⼤多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分⼦（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；⼤⼩⼀般为1～200Kb，有的更⼤。
2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单⼀质粒的份数同染⾊体数之⽐值,常⽤质粒数/每染⾊体来表⽰。
不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。
3.质粒的不相容性：两个质粒在同⼀宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第⼆个质粒导⼊后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒⼀般都利⽤同⼀复制系统，从⽽导致不能共存于同⼀宿主中。
4.质粒的转移性：质粒具转移性。
它是指在⾃然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作⽤转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因⼦ bom 及其内部的转移缺⼝位点 nic。
5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖⼜能在原核细胞中繁殖的载体。
这类载体必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，⼜含有真核⽣物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。
它⽤来转化细菌，⼜可以⽤于转化真核细胞。
6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。
α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补⽽建⽴的7.温和噬菌体：既能进⼊溶菌⽣命周期⼜能进⼊溶源⽣命周期的噬菌体。
8.溶源性细菌：具有⼀套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。
9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染⾊体DNA中，便叫做已整合的噬菌体DNA。
基因工程：第四章2
4.2.5 常用λ噬菌体载体1.Charon载体* Charon 16A：是一种插入型载体，它的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）上有一个EcoR I切点，插入外源DNA片段后，lacZ基因失活，在补加有IPTG和X-gal的培养平板上形成无色噬菌斑，很易检出。
该载体一般可容纳10 kb的外源DNA片段。
* Charon 4：是一种替换型载体，它的可被外源DNA取代的EcoR I片段中包含大肠杆菌的lac5区段，其上有lacZ基因，以及它的操纵基因和启动基因。
该EcoR I片段被取代后的载体感染lac-指示菌，只能产生无色的噬菌斑。
该载体可容纳23 kb的外源DNA片段。
* Charon 28：是一种替换型载体，它的可取代区段两端各有一个BamH I切点，内部有red和gam基因，并且自身不含chi位点。
当外源DNA取代该片段后，就成为red-gam-，这样的噬菌体突变体获得了Spi-表型，能够在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞中生长，形成噬菌斑。
该载体可用于克隆Sau 3A部分消化的DNA 片段，容量可达20 kb。
2.EMBL系列载体是一类替换型载体，适用于克隆长度为8~23 kb（几乎接近理论值）的外源DNA片段，常用作基因组文库的构建。
在λEMBL3和λEMBL4的可取代区段的两侧，各有一段切点相同、方向相反的多克隆位点，可被EcoR I、BamH I和Sal I所识别，因而可以用来克隆由这三类限制酶所产生的任何一种限制片段。
其中BamH I切点还可以连接经Sau 3A或Mbo I部分消化的DNA片段（因为它们产生的粘性末端完全一样，都是GA TC），虽然在克隆过程中载体上的BamH I位点被破坏了，但可以选用EcoR I或Sal I作消化作用，便能回收到克隆的外源DNA片段。
3.λgt系列载体是一类插入型载体，常用于构建cDNA文库。
* λgt10：长度为43 kb，用于克隆小于6 kb的EcoR I切割片段。
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
噬菌体再感染。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
柯斯质粒
染色体基因库
◆将基因组的一部分（如一条染色体）用来构 建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结 构和组织十分有价值。
果蝇X染色体上的一个片段，具有50多个多线染色 体带，利用微切割技术切割，抽提DNA，构建染色体 片段基因库。 在人类基因组项目研究中，利用流动细胞分拣技术 将人类染色体分开，构建单个染色体基因库，大大 加速了人类基因组作图和分析。 在酵母菌中，利用一种改良的脉冲电泳方法，将酵 母菌的16条染色体据分开，用于构建染色体库。
M13噬菌体的生物学特性
M13噬菌体颗粒的外形呈丝状，其大小范围 为900×9nm，颗粒中包装的仅是（+）链 的DNA。
一种雄性大肠杆菌特有的噬菌体，只能感染 带有F性须得大肠杆菌菌株，也可通过转染 作用导入雌性大肠杆菌细胞。 存在RF型DNA和SS型DNA
M13克隆体系中的β-半乳糖苷酶显 色反应
cDNA库
◆ 以mRNA为模板， 经反转录酶合成互补 DNA (cDNA)，构建的 基因库
cDNA库
◆ cDNA库仅具有用于分离mRNA的细胞或 组织内表达的基因的mRNA序列，仅包括基 因组的部分基因序列。 ◆构建什么样的基因库取决于研究目的。 cDNA 库对于研究基因的表达模式、分离某 一特定基因是十分有用的。如分离在某一细 胞或组织高效表达的某种基因。 ◆通常是将cDNA库与核基因库配合使用， 以便既能得到基因的编码序列，又可得到基 因的调控序列。
2 筛选基因库
◆从基因库中筛选、分离基因，可据对待选 基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和 条件。 ◆常用方法是利用一段核苷酸序列(DNA， cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性 同位素或非放射性同位素标记探针，也可用 抗体作探针，筛选基因库。
基因克隆载体 (3)PPT课件
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（二）构建依据
1、λ噬菌体是一种温和噬菌体
2、能承载较大的外源DNA片段 野生型λDNA头部可包装约36.4～ 51kb(自身的75%～105%)，且约有 20kb λDNA可缺失（生长非必需）
3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点
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（三）构建的基本策略与技术路线 策略: 切去部分非必需区 删掉多余的限制性内切酶位点 插入选择性标记基因 建立体外包装系统
成具有两个cos位点而且相距达36.4～51kb之间时， 才能被包装。
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利用Cos质粒进行克隆
（四）使用cosmid载体的基本程序
利用cosmid的质粒性质，可按质粒操作转化受体细胞 利用cosmid的λ噬菌体性质→转导受体细胞（下图）
区插入ＭＣＳ连杆
构建成对M13载体，保证外源DNA两条链都能随“+” 链一起复制包装。
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HindⅡ
B H H
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（四）M13克隆载体的优点与应用
优点：
1、以双链环形DNA为中间媒介复制，可与质粒一样体外纯化操作 2、制备的M13 DNA单、双链都能转化大肠杆菌，直接转染受体细
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2、λ噬菌体 基因组有 基因61个 以上
J与N、P 与Q之间 为非必需 序列
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迄今已经定位的λ噬菌体基因至少有61个， 其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的 调控（必需基因）；
另一部分基因则被称为非必需基因；当它 们被外源基因取代后，不影响噬菌体的生 命周期。
（二）构建依据
1、λ噬菌体是一种温和噬菌体
2、能承载较大的外源DNA片段 野生型λDNA头部可包装约36.4～ 51kb(自身的75%～105%)，且约有 20kb λDNA可缺失（生长非必需）
3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点
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（三）构建的基本策略与技术路线 策略: 切去部分非必需区 删掉多余的限制性内切酶位点 插入选择性标记基因 建立体外包装系统
成具有两个cos位点而且相距达36.4～51kb之间时， 才能被包装。
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利用Cos质粒进行克隆
（四）使用cosmid载体的基本程序
利用cosmid的质粒性质，可按质粒操作转化受体细胞 利用cosmid的λ噬菌体性质→转导受体细胞（下图）
区插入ＭＣＳ连杆
构建成对M13载体，保证外源DNA两条链都能随“+” 链一起复制包装。
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HindⅡ
B H H
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（四）M13克隆载体的优点与应用
优点：
1、以双链环形DNA为中间媒介复制，可与质粒一样体外纯化操作 2、制备的M13 DNA单、双链都能转化大肠杆菌，直接转染受体细
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2、λ噬菌体 基因组有 基因61个 以上
J与N、P 与Q之间 为非必需 序列
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迄今已经定位的λ噬菌体基因至少有61个， 其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的 调控（必需基因）；
另一部分基因则被称为非必需基因；当它 们被外源基因取代后，不影响噬菌体的生 命周期。
4第四章 基因克隆的载体-3柯斯质粒
因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外 包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式 将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬 菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内并自 我复制。 柯斯质粒（cosmid）
cos位点 cos site-carring plasmid 质粒
二、柯斯质ห้องสมุดไป่ตู้载体的特点
Formation of a cosmid clone
Digestion
Ligation
C) Packaging and infect
Ligation to cleaved cosmid vector molecules can produce vector-target concatemers, resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences.
③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，不易 于检测：因此如用柯斯质粒制备基因文 库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌 落很费时间。现虽建立了高密有可能通过同宿主基因组交换而致丢失 等，所以最常使用的还是噬菌体载体。
第三节 柯斯质粒(cosmid)
一、柯斯质粒（cosmid）概述
1、定义：是由λ噬菌体与质粒（plasmid）共同构 建而成的杂合载体。 2、柯斯质粒DNA:
λ噬菌体的cos位点:使其可被包装蛋白识别包装； 质粒的复制起点：使其在宿主细胞中可自主复制。
另外还含有与cos位点相邻的控制包装作用的序列， 质粒中的抗性标记基因（如：AmpR，TetR），以 及酶切位点（EcoRⅠ、HindⅢ）。
四、柯斯质粒作载体的优、缺点
1、优点： 可携带外源基因大， 30～44.5 kb 。
基因工程原理柯斯质粒等其他高级载体[可修改版ppt]
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柯斯质粒载体
“柯斯克隆”（cosmid cloning）的理论依据：
• 在λ phage线性DNA分子的每一端都具有彼此互补的 单链突出序列，即所谓的粘性末端(cos位点)
• λ phage的多连体分子是由cos连接而成的。
cos
cos
cos
cos
cos cos
• 末端酶(terminase)或叫Ter体系——即λ phage具有一 种位点特异的切割体系(site-specific cutting system).
噬菌体Pl
BAC系统(细菌人工染色体)
利用重组酶的体内DNA重组技术
载体的选择
特殊用途载体
• 可用于产生测序所需的单链DNA的载体 • 表达载体 • 制备RNA探针的载体 • 最大量合成蛋白质的载体 • 简化蛋白纯化的载体 • 促进表达蛋白溶解的载体 • 促进蛋白外运的载体 • 合而为一：组合了多种特性的载体
制备RNA探针的载体
制备RNA探针所用的 LITMUS载体的结构和用途
表达载体
The base sequence of the −10 and −35 regions of four natural promoters, two hybrid promoters, and the consensus promoter.
柯斯质粒载体中克隆的简化 示意图
柯斯载体的特点
• 第一，具有λ噬菌体的特性。 • 第二，具有质粒载体的持性。 • 第三，具有高容量的克隆能力。 • 第四，具有与同源序列的质粒进行重组的
能力。
柯斯克隆技术的优点
• 由于柯斯载体兼具了质粒和λ噬菌体两方面 的特性，提高了克隆外源DNA片段的能力 ，可达程原理柯斯 质粒等其他高级载
(phagevectors)3.柯斯质粒载体(cosmidvectors)
点的序列，以及合适的选择标记基因。
与其他的克隆载体相比，人工染色体克隆载体的特点是能 容纳长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。
（一）酵母人工染色体（YAC）
把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在 质粒上，令质粒行使酵母chr的转录功能和复制功能。
含有的元件： 酵母4号染色体的复制起点和着丝粒序列
或称为自主复制序列 (ARS)
人工染色体克隆载体（artificial chromosome vector）
人工染色体载体（artificial chromosome vector）:利用染色 体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。 实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所 必 备的第一受体(大肠杆菌)源质粒复制起始位点(ori)，还含有 第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位
（二）柯斯质粒的特点
1、具有λ噬菌体的特性。 具有cos位点，能像 λ-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞。 2、具有质粒载体的持性。可以在受体细胞内 自由复制，以质粒DNA的形式存在于细胞内。 3、 具有高容量的克隆能力。可以装载比质粒或 λ-DNA大得多的外源DNA片段，40kb。 4、 便于筛选：携带质粒的选择标记 。
5、便于克隆：有质粒上的多种单一酶切位点。
6、不能体内包装，不裂解受体细胞，在细胞内不能 形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑 。
利 用 质 粒 进 行 克 隆
“柯斯克隆” （cosmid cloning）
Cos
黏粒载体的克隆原理及步骤 1．分离外源DNA片段35～45kb
2．外源DNA与两个粘粒相连，且cos方向相同
用于体外转录
T7 T3
常用噬菌粒载体的一般特征
柯斯载体考斯质粒粘性质粒
3/5
12:27
质粒载体的长度限制是越长越难进入细胞。DNA经l噬菌体进入大肠 杆菌的效率很高。cosmid系将l噬菌体的COS序列并入长约5kb的质粒内。 复制时，先用限制酶於多连接子处切断，再与DNA片段连接。cosmid与目 标DNA连成一条长链，每个目标DNA的两旁皆有COS位点。利用体外组合l 噬菌体的方法将重组的DNA包装进l噬菌体。 4/5
1.5kb顺序。将这一小段DNA与质粒连在一起，这 个重组质粒可装载更大的外源DNA片段，同时仍
象l-DNA一样，体外包装成有感染活性的噬菌体颗
粒，高效感染大肠杆菌。
2/5
12:27
考斯质粒的优越性
1. 体外包装，高效导入受体细胞 2. 可装载 46kb 的外源DБайду номын сангаасA 3. 携带质粒的选择标记，便于筛选 4. 质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆
12:27
重组l噬菌体能够有效的将DNA注入大肠杆菌复
制。因cosmid不含l噬菌体的基因，注入的DNA不能 杀死宿主细胞， 仍需抗药基因ampr作选择性放大。l噬菌体头 部最多只能包装50kb的DNA。cosmid本身长5kb，能 携带目标DNA约为45kb。
5/5
12:27
将这一小段dna与质粒连在一起这个重组质粒可装载更大的外源dna片段同时仍象ldna一样体外包装成有感染活性的噬菌体颗粒高效感染大肠杆菌
柯斯载体/考斯质粒/粘性质粒
Cosmid
Cos site carrying plasmid cosmid是含有lDNA cos区的质粒
1/5
12:27
l-DNA包装时，包装蛋白只识别粘性末端附近
12:27
质粒载体的长度限制是越长越难进入细胞。DNA经l噬菌体进入大肠 杆菌的效率很高。cosmid系将l噬菌体的COS序列并入长约5kb的质粒内。 复制时，先用限制酶於多连接子处切断，再与DNA片段连接。cosmid与目 标DNA连成一条长链，每个目标DNA的两旁皆有COS位点。利用体外组合l 噬菌体的方法将重组的DNA包装进l噬菌体。 4/5
1.5kb顺序。将这一小段DNA与质粒连在一起，这 个重组质粒可装载更大的外源DNA片段，同时仍
象l-DNA一样，体外包装成有感染活性的噬菌体颗
粒，高效感染大肠杆菌。
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考斯质粒的优越性
1. 体外包装，高效导入受体细胞 2. 可装载 46kb 的外源DБайду номын сангаасA 3. 携带质粒的选择标记，便于筛选 4. 质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆
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重组l噬菌体能够有效的将DNA注入大肠杆菌复
制。因cosmid不含l噬菌体的基因，注入的DNA不能 杀死宿主细胞， 仍需抗药基因ampr作选择性放大。l噬菌体头 部最多只能包装50kb的DNA。cosmid本身长5kb，能 携带目标DNA约为45kb。
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将这一小段dna与质粒连在一起这个重组质粒可装载更大的外源dna片段同时仍象ldna一样体外包装成有感染活性的噬菌体颗粒高效感染大肠杆菌
柯斯载体/考斯质粒/粘性质粒
Cosmid
Cos site carrying plasmid cosmid是含有lDNA cos区的质粒
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l-DNA包装时，包装蛋白只识别粘性末端附近
基因克隆载体-大容量
YAC）。
酵母人工染色体载体
酵母人工染色体依据酶切位点和筛选标记
基因的不同，酵母人工染色体可以分很多
类型。
pYAC3
pYAC4
酵母人工利于基因克隆 包含的片段可以包含内含子和调控区 克隆的基因可以和酶、转录因子等相互作用
比YAC小，但具有YAC无可比拟的优点：
1. 可稳定遗传，缺失、重组、嵌合现象少
2. 转化率高，对宿主毒副作用小
3. 操作容易
几种载体容量的比较
普通质粒：一般不超过10kb
λ 噬菌体：15kb左右，极限值00kb，甚至1M
Thank You
酵母人工染色体载体的应用
2. 构建染色体的物理图谱
曾被应用于人类基因组计划
酵母人工染色体载体的不足
1. 存在嵌合现象
插入序列可能来自多个片段
2. 稳定性差
继代培养中容易丢失
3. 分离纯化操作难度大 4. 转化效率低
细菌人工染色体载体BAC
在大肠杆菌F因子的基础上发展而来，容量
组λ DNA仍可以包装为噬菌体颗粒转染受体
细胞。但不能增殖。
柯斯质粒
通过λ DNA的cos序列和质粒复制子构建的
一类质粒称为柯斯质粒载体。
可以包装成噬菌体，高效转导大肠杆菌
λ DNA在受体细胞中可以环化，在受体细胞中可
以像质粒一样复制。
酵母人工染色体载体
构建方法：
将酵母染色体的端粒，复制起点和着丝粒以及 必要的选择基因序列克隆到大肠杆菌的pBR322 中，获得的质粒就成为酵母人工染色体载体（
基因克隆载体生物与食品工程学院柯斯质粒?保留dna片段两端不少于28kb并包含cos位点及包装相关位点的核苷酸序列重组dna仍可以包装为噬菌体颗粒转染受体组dna仍可以包装为噬菌体颗粒转染受体细胞
酵母人工染色体载体
酵母人工染色体依据酶切位点和筛选标记
基因的不同，酵母人工染色体可以分很多
类型。
pYAC3
pYAC4
酵母人工利于基因克隆 包含的片段可以包含内含子和调控区 克隆的基因可以和酶、转录因子等相互作用
比YAC小，但具有YAC无可比拟的优点：
1. 可稳定遗传，缺失、重组、嵌合现象少
2. 转化率高，对宿主毒副作用小
3. 操作容易
几种载体容量的比较
普通质粒：一般不超过10kb
λ 噬菌体：15kb左右，极限值00kb，甚至1M
Thank You
酵母人工染色体载体的应用
2. 构建染色体的物理图谱
曾被应用于人类基因组计划
酵母人工染色体载体的不足
1. 存在嵌合现象
插入序列可能来自多个片段
2. 稳定性差
继代培养中容易丢失
3. 分离纯化操作难度大 4. 转化效率低
细菌人工染色体载体BAC
在大肠杆菌F因子的基础上发展而来，容量
组λ DNA仍可以包装为噬菌体颗粒转染受体
细胞。但不能增殖。
柯斯质粒
通过λ DNA的cos序列和质粒复制子构建的
一类质粒称为柯斯质粒载体。
可以包装成噬菌体，高效转导大肠杆菌
λ DNA在受体细胞中可以环化，在受体细胞中可
以像质粒一样复制。
酵母人工染色体载体
构建方法：
将酵母染色体的端粒，复制起点和着丝粒以及 必要的选择基因序列克隆到大肠杆菌的pBR322 中，获得的质粒就成为酵母人工染色体载体（
基因克隆载体生物与食品工程学院柯斯质粒?保留dna片段两端不少于28kb并包含cos位点及包装相关位点的核苷酸序列重组dna仍可以包装为噬菌体颗粒转染受体组dna仍可以包装为噬菌体颗粒转染受体细胞
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cos位点 位点 cos site-carring plasmid 质粒
二,柯斯质粒载体的特点
1. 2. 3. 4. 具有λ噬菌体的特性; 具有 噬菌体的特性; 噬菌体的特性 具有质粒载体的特性; 具有质粒载体的特性; 具有较高容量的克隆能力; 具有较高容量的克隆能力; 具有与同源性序列的质粒进行重组的能力
三,实例
柯斯质粒 pHC79: pHC79:由 质粒pBR322 质粒pBR322 和λ噬菌体的 cos位点的一 cos位点的一 DNA构成 段DNA构成 全长4--6kb 全长4--6kb
★设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb. ★凡具有cos位点的任何DNA分子只要在 长度相当于噬菌体基因组,就可以同外壳 蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒. 因此,插入柯斯质粒的外源DNA可大于 40 kb,一般30～44.5 kb. ★重组的柯斯质粒可象λ噬菌体一样感染 大肠杆菌,并在细菌细胞中复制.
四,柯斯质粒作载体的优,缺点
1,优点: 可携带外源基因大, 30～44.5 kb .
2,缺点 ①易发生自我重组:载体自身只相当于可 易发生自我重组: 以插入片段的1/10左右,因此往往会出现 左右, 以插入片段的 左右 载体同载体自身连接, 载体同载体自身连接,结果在一个重组分 子内可有几个柯斯质粒载体连在一起. 子内可有几个柯斯质粒载体连在一起.但 用碱性磷酸酶处理, 用碱性磷酸酶处理,可阻止载体分子自身 连接; 连接;
②目的基因酶切后易发生随机连接:大小 不等的外源片段相互连接后插入同一个载 体分子,结果使在基因组内本来不是相邻 的片段错乱地连接成一个片段,会影响实 验结果的分析,后来专门选出30～45kb 的外源DNA插入载体D则将超过包装成噬菌体颗粒的 限度;
柯斯质粒(cosmid) 第三节 柯斯质粒
一,柯斯质粒(cosmid)概述 柯斯质粒( )
1,定义:是由λ噬菌体与质粒(plasmid)共同构 定义:是由λ噬菌体与质粒(plasmid) 建而成的杂合载体. 建而成的杂合载体. 2,柯斯质粒DNA: 柯斯质粒DNA:
λ噬菌体的 位点 使其可被包装蛋白识别包装; 噬菌体的cos位点 使其可被包装蛋白识别包装; 噬菌体的 位点:使其可被包装蛋白识别包装 质粒的复制起点:使其在宿主细胞中可自主复制. 质粒的复制起点:使其在宿主细胞中可自主复制.
Formation of a cosmid clone
Digestion
Ligation
C) Packaging and infect
Ligation to cleaved cosmid vector molecules can produce vector-target concatemers, resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences.
因此该载体在体外重组后, 因此该载体在体外重组后,可利用噬菌体体外 包装的特性进行体外包装 包装, 包装的特性进行体外包装,利用噬菌体感染的方式 将重组DNA导入受体细胞. DNA导入受体细胞 将重组DNA导入受体细胞.但它不会产生子代噬 菌体,而是以质粒DNA DNA的形式存在于细胞内并自 菌体,而是以质粒DNA的形式存在于细胞内并自 复制. 我复制. 柯斯质粒(cosmid) 柯斯质粒(cosmid)
③细菌的菌落体积远大于噬菌斑,不易 于检测:因此如用柯斯质粒制备基因文 库,则筛选所需的含某一DNA片段的菌 落很费时间.现虽建立了高密有可能通过同宿主基因组交换而致丢失 等,所以最常使用的还是噬菌体载体.
�
另外还含有与cos位点相邻的控制包装作用的序列, 另外还含有与cos位点相邻的控制包装作用的序列, cos位点相邻的控制包装作用的序列 质粒中的抗性标记基因( AmpR,TetR), ),以 质粒中的抗性标记基因(如:AmpR,TetR),以 及酶切位点(EcoRⅠ,HindⅢ). 及酶切位点(EcoRⅠ,HindⅢ).
二,柯斯质粒载体的特点
1. 2. 3. 4. 具有λ噬菌体的特性; 具有 噬菌体的特性; 噬菌体的特性 具有质粒载体的特性; 具有质粒载体的特性; 具有较高容量的克隆能力; 具有较高容量的克隆能力; 具有与同源性序列的质粒进行重组的能力
三,实例
柯斯质粒 pHC79: pHC79:由 质粒pBR322 质粒pBR322 和λ噬菌体的 cos位点的一 cos位点的一 DNA构成 段DNA构成 全长4--6kb 全长4--6kb
★设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb. ★凡具有cos位点的任何DNA分子只要在 长度相当于噬菌体基因组,就可以同外壳 蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒. 因此,插入柯斯质粒的外源DNA可大于 40 kb,一般30～44.5 kb. ★重组的柯斯质粒可象λ噬菌体一样感染 大肠杆菌,并在细菌细胞中复制.
四,柯斯质粒作载体的优,缺点
1,优点: 可携带外源基因大, 30～44.5 kb .
2,缺点 ①易发生自我重组:载体自身只相当于可 易发生自我重组: 以插入片段的1/10左右,因此往往会出现 左右, 以插入片段的 左右 载体同载体自身连接, 载体同载体自身连接,结果在一个重组分 子内可有几个柯斯质粒载体连在一起. 子内可有几个柯斯质粒载体连在一起.但 用碱性磷酸酶处理, 用碱性磷酸酶处理,可阻止载体分子自身 连接; 连接;
②目的基因酶切后易发生随机连接:大小 不等的外源片段相互连接后插入同一个载 体分子,结果使在基因组内本来不是相邻 的片段错乱地连接成一个片段,会影响实 验结果的分析,后来专门选出30～45kb 的外源DNA插入载体D则将超过包装成噬菌体颗粒的 限度;
柯斯质粒(cosmid) 第三节 柯斯质粒
一,柯斯质粒(cosmid)概述 柯斯质粒( )
1,定义:是由λ噬菌体与质粒(plasmid)共同构 定义:是由λ噬菌体与质粒(plasmid) 建而成的杂合载体. 建而成的杂合载体. 2,柯斯质粒DNA: 柯斯质粒DNA:
λ噬菌体的 位点 使其可被包装蛋白识别包装; 噬菌体的cos位点 使其可被包装蛋白识别包装; 噬菌体的 位点:使其可被包装蛋白识别包装 质粒的复制起点:使其在宿主细胞中可自主复制. 质粒的复制起点:使其在宿主细胞中可自主复制.
Formation of a cosmid clone
Digestion
Ligation
C) Packaging and infect
Ligation to cleaved cosmid vector molecules can produce vector-target concatemers, resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences.
因此该载体在体外重组后, 因此该载体在体外重组后,可利用噬菌体体外 包装的特性进行体外包装 包装, 包装的特性进行体外包装,利用噬菌体感染的方式 将重组DNA导入受体细胞. DNA导入受体细胞 将重组DNA导入受体细胞.但它不会产生子代噬 菌体,而是以质粒DNA DNA的形式存在于细胞内并自 菌体,而是以质粒DNA的形式存在于细胞内并自 复制. 我复制. 柯斯质粒(cosmid) 柯斯质粒(cosmid)
③细菌的菌落体积远大于噬菌斑,不易 于检测:因此如用柯斯质粒制备基因文 库,则筛选所需的含某一DNA片段的菌 落很费时间.现虽建立了高密有可能通过同宿主基因组交换而致丢失 等,所以最常使用的还是噬菌体载体.
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另外还含有与cos位点相邻的控制包装作用的序列, 另外还含有与cos位点相邻的控制包装作用的序列, cos位点相邻的控制包装作用的序列 质粒中的抗性标记基因( AmpR,TetR), ),以 质粒中的抗性标记基因(如:AmpR,TetR),以 及酶切位点(EcoRⅠ,HindⅢ). 及酶切位点(EcoRⅠ,HindⅢ).