BDFACSCalibur流式细胞术标准操作规程

BD FACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序

目的：

规范BDFACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序，正确使用设备，保证实验顺利进行、操作人员人身安全和设备安全。

适用范围：

本规程适用于BD FACSCalibur流式细胞仪的使用操作。

责任者：

操作人员：负责按照本规程操作仪器设备，对仪器进行日常维护，并作使用记录。

保管人员：负责监管仪器操作是否符合规程，并对仪器进行定期维护、保养。

科室负责人：负责对仪器设备的综合管理。

内容：

1.每日开机程序

1.1在气压阀减压的状态下检查鞘液桶，确认：

1.1.1鞘液充满状态，约3L

1.1.2盖紧盖子

1.1.3安上金属挡板

1.1.4管路畅通，无扭曲

1.2.检查废液桶，确认：

1.2.1废液桶充满400ml漂白剂

1.2.2管路畅通，无扭曲

1.3打开流式细胞仪。

1.4打开电脑。

1.5气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡。

1.6做Prime。

1.7等待机器预热5~10分钟后可开始试验。

2.每日关机程序

2.1用3mlFACSCIean洗液加入样品管中上样，将样品支撑架置于旁位，以外套管吸入1ml。

2.2将样品支撑架置于中位，以HI RUN运行10分钟，使内管吸入约1ml。

2.3将样品管换成蒸馏水重复1-2步。

2.4放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。

2.5选择Standby模式10分钟，将激光冷却后可关掉主机。

2.6退出所有应用软件，关闭电脑。

2.7将流式细胞仪的压力阀置于减压状态。

3.每月维护程序

3.1将FACSClean洗液1~2L装入鞘液桶。

3.2旁路鞘液过滤器（过滤器上的快速接口从SANLINEFILTER端断开，将鞘液白色管路液路取下联到

SANLINE FILTER 端口），以防伤害。

3.3将盛有3ml FACSClean 洗液的试管置于样品支架上，以HI RUN 30 分钟。

3.4将鞘液和样品换成蒸馏水重复步骤3，以HI RUN 60 分钟。

3.5将鞘液桶装满鞘液，恢复过滤器。

3.6以HI RUN 10-20 分钟。

3.7在测定正式样品之前实施每日开机程序。

4.FACScomp 自动质控操作

4.1试剂准备

4.1.1三色试剂的校正（Cat No ：340486 ）

4.1.1.1取四色试剂盒中的Unlabeled 试剂，充分混匀，加一滴到装有1ml 鞘液的试管中，混匀，标记为unlabeled 。

4.1.1.2取FITC、PE、PerCP、unlabeled 试剂，充分混匀，各加一滴到第二支装有2ml 的鞘液的试管中，混匀，标记为mixed 。

4.1.1.3上机进行仪器的校准。

4.1.2或四色试剂的校正（Cat No：340486；Cat No:340487 ）

4.121 取试剂盒中的unlabeled试剂和APC试剂各一滴加入到第一支装有1ml鞘液的试管中，混匀。

4.1.2.2取5种试剂（FITC、PE PerCP、APC Un labeled ）各一滴加入第二支装有2ml鞘液的试管中，混匀。

4.1.2.3上级进行仪器的校准。

4.2Calibrite beads FACScomp 上机操作的具体步骤

4.2.1执行FACSalibur 开机程序；

4.2.2执行FACScom歌件；

4.2.3在运行“ Sign in ”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息，计算机将保存这些信息；单机“ Acceppt ”；

4.2.4进入” Set Up窗口，先看最左侧的Assay selection 选项，在里面选中Lyse/Wash或Lyse/No Wash；

4.2.5在Calibrite Beads Lot IDS 中，根据每种颜色的beads 所对应的Lot ids ，输入编号，次编号在Calibrite Beads 试剂盒内，打开新买的试剂盒，里面有一张橙色胶纸，取出贴在试剂盒的背

面，标题是Calibrite Beads T%Batch NO，选择FACS Flow Sheath 下的编号（右侧的编号）；如做

四色校正，同样方法输入Calibrite Beads TM APC的IDS。

4.2.6在右侧的保存选项中文件会自动保存，路径Facstation\BD file\FACSComp\DDMMYY还可以单

击“ Location ”改变保存路径；

4.2.7其他的不要改动，直接单击“ run”出现PMT视窗，然后准备好上样管；

4.2.8上第一管后单击start，仪器开始自动调节PMT完成后仪器会在窗口底部出现一行提示：

“ PMTs set Successfully ”，这时软件会暂停 5 秒，然后自动进入下一个调节窗口（Comp 窗口）；

如果是四色微球调试，仪器还会对激光的延迟进行测试，直到仪器电脑屏幕出现提示: “ Time Delay Calibratio n was successful "，然后才会同样自动进入下一个调节窗口（Comp窗口）；

4.2.9上第二管，单击start ，仪器开始自动调节补偿并进行灵敏度测试。完成后仪器会给出提示，

最后软件给出一个Summary Report。检查报告中的“ Result ”是否都PASS如果有没有PASS坚持原因。（1）是否试剂过期（2）两个试管中的液体和鞘液桶中的是否相同（3）鞘液是否合格（4）

日常维护是否充分适当（5）联系BD人员

4.2.10打印报告，退出FACScom软件；

4.2.11计算机会自动把FACScom测试结果保存在Calib File或Calib File .LNW（免洗试验）中，运行其他程序，调用这些结果就可以进行样本的检测。

注意事项： 1 、第一管的速率不能低于400 个/ 秒（run high ），少于时可以补一滴Unlabeled 。

2 、两个试管中的鞘液必须和鞘液桶中的是同一种液体。

5.FACScomp校正HLA-B27的操作说明

5.1试剂的准备：

取HLA-B27 试剂盒的HLA-B27 calibration beads （Cat No : 340183）试剂，混匀，加两滴到装有1ml 鞘液的试管中，混匀，待测。

5.2FACScomp 上机检测HLA-B27 的具体步骤

5.2.1执行FACSCalibur 开机程序；

5.2.2运行FACScomp软件；

5.2.3在出现“ Sign in ”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息，计算机将保存这些信息；单机“ Accept ”；

5.2.4进入“ Set up ”窗口，先看最左侧的Assay selection 选项，选择HLA-B27 Assay ，在进行HLA-B27 Assay 之前，必须一次性的通过Lyse/Wash Assay 校正；

5.2.5在右侧框中输入正确的HLA-B27 Lot No值、Suffix 值和Beads Lot No 值。这些参数分别决

定了FL1 PMT的标准和decision maker 的位置。对于结果至关重要，不可弄错；

5.2.6在右侧的保存选项中文件会自动保存，路径日期，还可以单

击“ Location ”改变文件保存路径；其他的不需要改动，直接单击“run ”出现PMT视窗，然后准备

好上样；

5.2.7放上Beads管后单击start，仪器开始自动调节PMT完成后仪器会在底部出现一行提示：“PMTs set successfully ”这时软件会暂停 5 秒，调试后的结果会自动保存在Calib File.B27 中，并生成summary

Report ；

5.2.8退出FACScomp软件，然后进入HLA-B27软件进行检测。

6.MultiSET 四色免洗淋巴细胞亚群的绝对计数

6.1实验原理：用已知总数的荧光微球Beads 做标准内参，加入血中，再加入荧光抗体，应用流式

细胞仪中的获取和分析软件，就可以得出血中CD3 CD4 CD8 B、NK细胞的绝对数。

细胞（/ ul ）=（细胞获取数x Beads总量）/ （Beads获取数样本量）

6.2主要试剂：

6.2.1抗体：CD3/CD8/CD45/CD4 CD3/CD16+56/CD45/CD19四色荧光抗体。

6.2.2Trucount 管（内含数量已知的Beads）。

6.2.3FACS Lysing Solution （溶血素）（ 1 0 x ,使用前用蒸馏水稀释成1x）

6.3实验步骤:

6.3.1取2支TruCount管，顺序编号A和B;

6.3.2用反向加样法在Tube 中加入50ul 充分混匀的抗凝全血; 注意: 血不要碰到试管底部的微球（Beads）。