碱性磷酸酶报告

北京师范大学珠海分校

实验报告

碱性磷酸酶的提取及其比活性测定

小组成员: 林树程

温慧敏

朱崇华

巫鹏辉

指导教师：许华

2012-11-1

碱性磷酸酶的提取及其比活性测定

一、实验目的

1、掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；

2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；

3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。

二、实验原理

本实验采取有机溶剂沉淀法从猪肝匀浆液中提取分离碱性磷酸酶(AKP)。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33％的丙酮或30％的乙醇中，而不溶于终浓度为50％的丙酮或60％的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。

根据国际酶学委员会规定，酶的比活性(specific activity)用每mg蛋白质具有的酶活性单位(u／mg·pr)来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：(1)每ml样品中的蛋白质mg数(mg／m1); (2)每ml样品中的酶活性单位数(u／ml)。酶的纯度越高酶的比活性也就越高。

本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位(King-Armstrong法)可定义为：在37℃保温15min每产生lmg的酚为一个酶活性单位（U）。

样品中蛋白质含量测定用考马斯亮蓝法测定。

三、实验试剂

1．0.5mol／L乙酸镁溶液：称取乙酸镁107.25g溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。2．0.1mol／L乙酸钠溶液：称取乙酸钠8.2g溶于蒸馏水中，稀释到1000ml。

3．0.01mol／L乙酸镁-0.01mol／L乙酸钠溶液：取0.5mol／L乙酸镁溶液20ml及0.1mol ／L乙酸钠溶液100ml，混合后加蒸馏水稀释到1000ml。

4．0.01mol／L Tris-0.01mol／L乙酸镁pH8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，用蒸馏水溶解并稀释至1000ml，即为0.1mol／L Tris溶液。取0.1mol／L Tris溶液100ml，加蒸馏水约800ml，再加0.5mol／L乙酸镁溶液20ml，混匀后用1％乙酸调pH至8.8，用蒸馏水稀释至1000ml即可。

5．丙酮(分析纯)

6．96％乙醇(分析纯)

7．正丁醇(分析纯)

8．0.04mol／L底物液：称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2·2H2O)15.16g或磷酸苯二钠(无结晶水)8.72g，用煮沸冷却的蒸馏水溶解，稀释至1000ml。加氯仿4ml盛于棕色瓶中，冰箱内保存，可用一周。

9．0.01mg／ml酚标准液：称取重蒸酚l00mg，用pH8.8 Tris液配制成100ml，临用前稀释100倍。

10．0.5mol／L NaOH

11．0.3％4-氨基安替比林：称取4-氨基安替比林0.3g及碳酸氢钠4.2g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml，置棕色瓶中冰箱保存。

12．0.5％铁氰化钾：称取铁氰化钾5g和硼酸15g，各溶于400ml蒸馏水中，溶解后两液混合，再加蒸馏水至1000ml，置于棕色瓶中，暗处保存。

四、实验器材

1．研钵

2．刻度离心管

3．刻度吸管

4．电动离心机

5．玻璃漏斗和玻棒

6．托盘天平

7．恒温水浴

8．722型分光光度计

五、操作步骤

1．AKP的提取

(1)取2g新鲜猪肝，剪碎后加入0.01mol／L乙酸镁-0.0lmoL／L乙酸钠溶液2.0ml，研磨成匀浆。将匀浆倒人刻度离心管中，记录其体积V A，此为A液。吸取A液0.1ml于另一试管A1中，加pH8.8Tris缓冲液4.9ml稀释，此为稀释A1液(1：50)，供测比活性用。再取A液0.1ml于另一试管A2中，加生理盐水4.9ml稀释，此为稀释A2液（1:50），此供测蛋白质含量用。

(2)在剩余A液中加入正丁醇2.0ml，用玻棒充分搅拌2至5min，室温放置30min，用滤纸过滤，滤液置于刻度离心管中，加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心(2000r／min)5min，弃上清液，沉淀加入0.5mol／L乙酸镁4.0ml，用玻棒充分搅拌使其溶解，记录其体积VB，此为B液。取B液0.1ml于另一试管中，加人pH8.8 Tris缓冲液4.9ml，此为稀释B液(1：50)，供测比活性用。再取B液0.1ml于另一试管B2中，加生理盐水4.9ml稀释，此为稀释A2液（1:50），此供测蛋白质含量用。剩余B液记体积VB’。

（3）在剩余B液中加入96%的冷乙醇0.45VB’，混匀，离心（2500r/min）5min，弃沉淀。上清液入离心管，记体积VB”，加0.83 VB‘’96%冷乙醇，混匀，离心2500 rpm ,5 分钟。弃上清，沉淀加0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc混合液4ml ，搅拌，记体积VC，此为C液。吸取C液0.1ml于另一试管C1中，加pH8.8Tris 缓冲液1.9ml稀释，此为稀释C1液(1：20)，供测比活性用。再取C液0.1ml于另一试管C2中，加生理盐水0.4ml稀释，此为稀释C2液（1:5），此供测蛋白质含量用。

(4)在剩余C液中加入冷丙酮0.5VC’，混匀，离心（2000r/min）5min，弃沉淀。上清液入离心管，记体积VC”，加1/3VC‘’冷丙酮，混匀，离心2000 rpm ,5 分钟。弃上清，沉淀加0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc混合液5ml ，搅拌，记体积VD，此为D液。吸取D液0.1ml于另一试管D1中，加pH8.8Tris缓冲液0.9ml 稀释，此为稀释D1液(1：10)，供测比活性用。剩余D液入D2管，直接待测蛋白质含量。