蛋白质分离和鉴定

2D）
质谱分析 ( MS)
辅助激光解析/离子化(matrix-assisted laser disorption / ionization) 电喷雾离子化（electrospray ionization ESI ）
生物信息
二.蛋白质的分离和鉴定 1:蛋白质的分离
一维凝胶电泳 二维凝胶电泳 蛋白芯片
Investigator™ 蛋 白 组 学 研 究 系 统
多功能、自动化的大规模蛋白组学系统
二.蛋白质的分离和鉴定 2:蛋白质的鉴定
质谱分析 ( MS)
介质辅助的激光解吸/离子化
分类：辅助激光解析/离子化&电喷雾离子化 原理：样本分子离子化后,根据不同离子间质荷比 (m/e )差异,分离样本,确定分子量
蛋白质分离和鉴定
德 伟
一.概述
1. 蛋白质组及蛋白质组学概念的提
出 2. 蛋白质组学形成的历史 3. 蛋白质组研究的主要手段
1、蛋白质组及蛋白质组概念的提出
人类基因组计划的完成3-4万个基因，30亿对碱基（解码生命）
基因组是唯一的，但蛋白表达是变化的（解码生命） 后基因组—蛋白质组的研究是21世纪生命科学的主要任务（Wilkins
质谱技术
1) MALDI; matrix-assisted laser desorption/ionization,(介质辅助 的激光解吸/离子化 ) 2) ESI; electrospray ionization (电喷雾离子化 )
3) 多肽分析
多肽氨基酸分析
串联质谱（Tandem-MS）,第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽 的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂，形成一系 列离子，即N端碎片离子系列（B系列）和C端碎片离子系列（Y系列）， 将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。 “protein ladder sequencing ”的方法，通过对Edman降解法的修改， 产生一系列截去N端残基的肽段，用MALDI-MS测得这些肽段的质量，从 而推测N端序列。
Process Protein
Spot on MALDI Stage
MS & Analyze
Gene Company Limited
基因有限公司
定量分析
不同发育时期大鼠胰腺蛋白质组差异的分析
图3.不同发育时期的大鼠胰腺总蛋白二维电 泳图象。第一维电泳采用固相 PH梯度凝胶 胶条（PH4-7，线性），第二维电泳采用均 一的 12.5%SDS- 聚丙烯酰胺凝胶。各时期 蛋白上样量均为 50μg ，银染。加框区域内 蛋白点各组间有显著差异 。 (a:E15.5 ； b: E18.5；c:P0；d:成年)
2、蛋白质组学形成的历史
1860 Friedrich Miescher identified acid and basic protein components in cell nuclei which was mistakenly believed to carry the genetic material 1970 Kenrick and Margolis Isoelectric focusing and gradient gel electrophoresis: a two -dimensional technique 1972 Bernstein et al The Protein Data Bank with a collection of ten X-ray crystallographic protein structures 1975 O'Farrell The modern form of two -dimensional electrophoresis of proteins by high resolution separation
Storage, manipulation, and comparison of the data using bioinformatics
3、蛋白质组研究的主要手段 双相电泳技术（two dimensional electrophoresis gel “双向”高效柱析法
分子筛柱层析 反向柱层析
数据库分析 成像
Imaging
D/BASE PepSeq
Spot Cutter
Sample
MASS SPEC MALDI-TOF MicroMass ABI Bruker ESI MS/MS
Sample Prep
2-D GELS
样品
Protein Digest MALDI Spotting
样品制备
2维电泳
indicates there are approximately 250,000 proteins in the human genome Only 2-5% of proteins in human genome have been identified
Proteomics
Expression proteomics (表达蛋白组学)
Image analysis: Data quantitation
Image analysis: Overlay images
PH 2-11 MW 10k-150k 银染灵敏度4ng 同位素灵敏度 20ppm
Coomassie Brilliant Blue &Silver Stain
荧光染色
激光捕获显微切割技术
纯化和点样
质谱测序
Protein extract 1 Label with Cy™2
Protein extract 2 Label with Cy3
Protein extract 3 Label with Cy5
Mix labeled extracts
Image gel
Cy2
Cy3
Cy5
Analysis of difference
双 向 电 泳 技 术
1975年，O`Farrell et al 发明了双向电泳技术。 能检测到3000~4000种总蛋白，最大可达到一万种
一个细胞有5000~6000种不同蛋白，人体有250种细胞，每 个细胞表达300~400种自身特有蛋白
蛋白组学研究过程
SWISS-PROT/ SWISS PROT/ TrEMBL TrEMBL
2、蛋白质组学形成的历史
1995 Wilkins Definition of the proteome 1997 Wilkins et al Publication of the first book on proteomics 1999 Ian Humphery-Smith.The first Chair in Proteomics created at the Universiteit Utrecht, The Netherlands. Occupant 2000 March Publication of the most complete proteome of a whole organism, the bacterium Mycoplasma genitalium 2001 Sequencing of the human genome completed.
（Laser Capture Microdissection ） 1. Prepare tissue 2. Locate cells 3. Place cap
4. Pulse laser
5. Remove cap
6. Extract molecules
Before LCM
After LCM
Captured Cells
蛋白组研究的三个主要步骤：
Separation of individual proteins by 2-D polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE)
Identification by mass spectrometry or Nterminal sequencing of individual proteins recovered from the gel
The wk.baidu.comtudy of global changes in protein expression
Cell-map proteomics （细胞图谱蛋白组学）
The systematic study of proteinprotein interactions through the isolation of protein complexes
MR et al 1997)
1994年Williams提出测定有机体的基因组所表达的全部蛋白 1995年Wilkins正式提出Proteome一词
由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，而研究 蛋白质组功能为蛋白质组学（Proteomics）
基因组
转录组
蛋白组
The study of proteins expressed by genomes Completion of the sequencing of the 1st draft of human genome
不同发育时期的大鼠胰腺蛋白2D-E图谱差异蛋白点的质谱分析结果
Spot ID 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Swissprot ID P02773 P02773 P02773 P02773 P02773 P02773 P07882 P07882 P07882 P04785 P04785 P54316 P02773 P04691 P16617 P05218 P54316 P54316 P54316 P07338 P07338 P07338 P07338 Q8CFI8 P32821 P67779 P02773 P04639 O88767 Q9Z0V5 P35704 P54316 Theoretical Pi/MW 5.77/68.38 5.77/68.38 5.77/68.38 5.77/68.38 5.77/68.38 5.77/68.38 5.36/65.32 5.36/65.32 5.36/65.32 4.82/56.95 4.82/56.95 5.79/52.38 5.77/68.38 4.79/50 8.02/44.91 4.78/49.67 5.79/52.38 5.79/52.38 5.79/52.38 4.9/28.46 4.9/28.46 4.9/28.46 4.9/28.46 5.27/63.88 4.93/26.90 5.57/29.8 5.77/68.38 5.52/30 6.32/19.9 6.18/31.21 5.34/21.8 5.79/52.38 Observed Pi/MW 5.39/77 5.46/76 5.54/76 5.61/76 5.69/74 5.61/74 5.29/70 5.35/70 5.41/70 4.84/58 4.76/58 5.88/57 5.75/44 5.55/37 5.9/40 5.38/37 5.68/42 5.64/39 5.84/39 4.89/28 5.02/28 5.13/28 5.25/28 4.76/31 4.91/25 5.62/30 5.71/29 5.7/26 6.16/23 6.05/25 5.3/21 5.30/22 Sequence coverage(%) 16 27 26 25 31 29 21 33 27 40 35 69 40 41 31 55 57 54 63 48 33 27 31 14 49 43 25 30 78 46 35 22 Protein name Alpha fetoprotein (AFP) Alpha fetoprotein (AFP) Alpha fetoprotein (AFP) Alpha fetoprotein (AFP) Alpha fetoprotein (AFP) Alpha fetoprotein (AFP) sterol esterase sterol esterase sterol esterase Protein disulfide isomerase, pancreatic Protein disulfide isomerase, pancreatic Pancreatic lipase related protein 1 precuror Alpha fetoprotein (AFP) tubulin, beta phosphoglycerate kinase 1 Tubulin beta 5 Pancreatic lipase related protein 1 precursor Pancreatic lipase related protein 1 precursor Pancreatic lipase related protein 1 precursor Chymotrypsinogen B Chymotrypsinogen B Chymotrypsinogen B Chymotrypsinogen B Protein FLN29 Trypsin V-A precursor prohibitin Alpha fetoprotein (AFP) apolipoprotein A-I Parkinson disease protein 7 homolog Peroxiredoxin 4 peroxiredoxin 2 Pancreatic lipase related protein 1 precursor
局限性，譬如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不 能用质谱法测定。
Genomic Solutions’ 完整的蛋白组学研究系统
Produce 2-D Gels Image 2-D Gels Analyze 2-D Gels Excise Spot From Gel