皂苷测定方法

1 三萜皂苷

三萜皂苷主要分布在植物界的石竹科、桔梗科、五加科、豆科中。桔梗、南沙参、党参、人参、三七、瞿麦、甘草、远志、紫菀、地榆等许多中草药都含有此类皂苷。不同的中草药其三萜皂苷的皂苷元或活性成分不同，比如人参皂苷的皂苷元为人参皂苷Rg1、Re 和Rb[9]；女贞子中三萜皂苷的皂苷元为齐墩果酸[10]。三萜皂苷的定量测定方法主要有比色法、薄层色谱法、高效液相色谱－紫外检测器法、高效液相色谱－二极管阵列检测器法。

1.1 比色法

比色法的原理是：三萜皂苷分子中缺少发色团和助色基，需要某种试剂与其反应形成发色基团后显色，在某个波长下测定其吸光度，再根据吸光度与浓度的关系（标准曲线），计算出样品的浓度，从而计算出样品中总皂苷的含量。常见的显色剂有香草醛－冰醋酸溶液和高氯酸体系或浓硫酸。比如徐睿庸等人利用分光光度法测定青钱柳叶中总三萜皂苷的含量，所采用的显色剂就是0.3mL的50g/L 香草醛一冰醋酸与0.6mL 的高氯酸。在显色剂与样品中的三萜皂苷反应后，80℃水浴10min，在波长550nm 处测定青钱柳叶中总三萜皂苷的吸光度，从而计算出含量。其化学反应原理是：强酸使羟基脱水而使其双键数目增加，又经双键位移后与显色剂缩合等反应形成共轭结构，最后在酸作用下形成碳正离子盐而显色[11]。而杨文志等人则认为显色机理是因为皂苷元中C3 和C12上的羟基与香草醛上的醛基发生反应，形成缩醛，成为新的共轭体系而显色[12]。孔燕君则采用浓硫酸作为显色剂，分别测定了人参、三七和男壮胶囊中三萜皂苷的含量。他认为人参皂苷分子上的糖基能被浓硫酸氧化脱水成糠醛衍生物，在60℃水浴2h 后在322nm 处有紫外吸收，测其吸光度，进而计算出人参、三七和男壮胶囊中的三萜皂苷含量[13] [14]。

1.2 薄层扫描法

傅强等人依据五加科植物人参三萜皂苷中人参皂苷Rg1 在薄层板上分离效果较好和荧光分光光度法高灵敏度的特点，建立了薄层色谱-荧光分光光度法测定人参中人参皂苷Rg1 薄层色谱法。展开剂为氯仿：醋酸乙酯：甲醇：水＝16∶2∶11∶12 的下层液体，显色剂为10的硫酸乙醇溶液，喷雾显色，95℃水浴中加热5min，在双波长薄层扫描仪下扫描，激发波长Ex=320nm，发射波长Em=400nm。实验表明：薄层色谱显色是定量的关键，用10%硫酸乙醇溶液喷雾显色要均匀，否则定量洗脱后测定荧光强度值有较大差异。在105℃加热5min，效果良好[15]。

1.3 高效液相色谱法

近年来，随着高效液相色谱仪的普及，越来越多的皂苷成分开始使用到了这项技术。由于它能有效处理非挥发性和极性较强的化合物，可以较好分离出主成分峰和杂质峰，能反映样品的真实含量，方法简便、准确、灵敏有利于产品质量的控制，从而使它成为了测定皂苷的一种最有效最常用的方法，但HPLC 仪器昂贵，而且要求有对照品。

1.3.1 高效液相色谱－紫外检测器法

该方法是HPLC 中测定有紫外吸收的皂苷常用方法，广泛应用于三萜皂苷如人参皂苷、女贞子中齐墩果酸含量的测定中。紫外检测器由于对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗，但它非通用检测器，它要求被测物质有较强的紫外吸收或本身无紫外吸收但转化后有吸收紫外线的基团。战佩英等人使用岛津高效液相色谱仪－紫外检测器（SPD-10A UV-V IS）工作站对女贞子药材中的齐墩果酸进行了含量测定。色谱条件是：C18 色谱柱(200mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-0.05%乙酸胺水溶液(86：14)；流速：0.8mL /min；检测波长：220nm；柱温25℃[10]。

1.3.2 高效液相色谱－二极管阵列检测器法

戚志华等人采用600 高效液相色谱仪－2996 二极管阵列检测器对不同产地、不同生长期的女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量进行了测定。其实验色谱条件如下：色谱柱：Lichrospher

C18(250mm×416mm，5μm)；流动相：乙腈-甲醇-水-磷酸-三乙胺(50∶30∶20∶0；流速：1mL·min-1；检测波长：205nm；柱温：室温；进样量：20μL[16]。Fang LIU 等人对绞骨蓝皂苷的高效液相色谱技术进行了研究。他们认为，皂苷的紫外吸收较弱，紫外检测器

设置的最大吸收波长一般在203nm 左右，在这个波长范围内，黄酮和色素等杂质也有紫外吸收，从而带来杂峰。因此，他们选用了二极管阵列检测器作为检测工具[17]。其色谱条件是：Agilent 1100 系列工作站，G1315A 二极管阵列检测器，AlltimaC18 柱(4.6mm×250mm，5mm)，流动相：水：乙腈梯度洗脱（5—100%），流速0.8ml/min，波长203nm，进样量20ml。Muhammad K.Saeed 等人对中国粗榧提取物进行了高效液相色谱分析，他们为了获得尽可能多的可检测到的强峰，而选用了二极管阵列检测器，这样一来，所有峰的光谱就都可以被检测显示出来。他们的色谱条件是：HPLC Elite P230 系列工作站，二极管阵列检测器(DAD-230)，Kromasil C18 柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相是水-乙腈(1：1)，5～40min 内线性洗脱，流速0.7ml/min，波长254nm，进样量10μl[18]。二极管阵列检测器（diode-array detector，DAD）是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。和普通的紫外—可见分光检测器相比，二极管阵列检测器进入流动池的光不再是单色光。它具有以下优点：⑴可极为方便地得任意波长的色谱图；⑵可得任意时间的光谱图，相当于与紫外联用；⑶提供组分的定性信息。也就是说，二极管阵列检测器不仅可用于定量检测，还具有辅助定性、峰纯度评估等功能，可得到立体的光谱-色谱图，对有特征紫外吸收的化合物的定性很有帮助。

1.3.3 高效液相色谱－蒸发光散射检测器法

蒸发光散射检测器(evaporative light-scattering detector，ELSD) 是一种基于溶质的光散射性质的通用检测器，由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光检测器（光电转换器）等部件构成。流动相由热气流使之热气化喷雾，再进入加热管，溶剂在加热管中挥发。被分析检测的物质颗粒通过一束狭窄的散射光由光电倍增管收集，色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气或氮气）雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。ELSD 的响应取决于被分析的质粒的数量和大小，而不依赖于被测物的光学特性。ELSD 可消除因温度变化引起的基线漂移，即使是在梯度洗脱时也能提供平稳的基线。和紫外检测器相比，它排除了用UV 检测器时的溶剂干扰，大大地提高了分离效果。和二极管阵列检测器相比，蒸发光散射检测器基线噪音小，不受梯度影响，能够获得较好的峰形，且仅对不挥发被分析物质产生响应，因此杂质峰较少。和示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比，高灵敏度比RID 高二个数量级，且与梯度洗脱兼容。对无紫外吸收或仅有紫外末端吸收的物质如糖类、皂苷类，蒸发光散射检测器具有良好的稳定性，较高的灵敏度和重现性。因此，越来越多的中草药中皂苷类成分的测定使用到了蒸发光散射检测器。王举涛等人用高效液相色谱－蒸发光散射检测器法对常用中药黄芪中的功效成分黄芪甲苷进行了含量测定。由于黄芪甲苷仅在200 nm 处有弱的末端吸收，因而操作条件十分严格，噪音对结果影响较大，灵敏度也较差；如果用柱前衍生化高效液相色谱－紫外检测器进行测定，虽可克服黄芪甲苷仅在200nm 处有弱的末端吸收的弱点，但试验结果表明操作繁琐，重现性差。而高效液相色谱－蒸发光散射检测器进行测定黄芪甲苷，不受流动相溶剂的干扰，不要求被检测组分特定的化学结构，亦可用于不挥发性成分的检测。试验结果表明分离度好、干扰少、前处理简便。灵敏度、稳定性及重现性均符合含量测定要求。其色谱条件如下：色谱柱：ODS 柱(4.6mm×150mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈-水(40∶60)，流速：1.0ml/min；漂移管温度：105℃，载气流速为2.8 L/min[19]。

2 甾体皂苷

甾体皂苷主要存在于薯蓣科、百合科植物中，如各种薯蓣、七叶一枝花、土茯苓、知母、麦