第十二章 环境监测中的微生物学方法

第十二章环境监测中的微生物学方法

第一节水质的细菌学检测

∙细菌总数

细菌总数是指将l mL水样（原水样或经稀释的水样）放在营养琼脂培养基上，于37℃培养24小时后，所生长的细菌菌落总数。

细菌总数的测定结果常用“cfu（菌落形成单位）/mL”或“个/mL”表示。

根据水样中的细菌总数，可将天然水体划分为几类：细菌总数101~102 cfu/mL，极清洁水；102~103 cfu/mL，清洁水；103~104 cfu/mL，不太清洁水；细菌总数104~105 cfu/mL，不清洁水；大于105 cfu/mL，极不清洁水。我国生活饮用水的国家标准（GB5749-1985）规定，生活饮用水中的细菌总数不得超过102 cfu/mL。

∙腐生细菌数

自然水体中的腐生细菌数与有机物浓度成正比。因此，测得腐生细菌数或腐生细菌数与细菌总数的比值，即可推断水体的有机污染状况。

污水带的划分及其特征

污水带、特征多污带甲型中污带乙型中污带寡污带

腐生细菌数(个

/mL)

数十万至数百万数十万数万数十至数万

有机物含大量有机物，主要

是蛋白质和碳水化

合物

主要是氨和氨基

酸有物含量少

有机物含量极微

溶解氧极低或几乎没有厌

氧性

少量，半厌氧性较多，需氧性很多，需氧性BOD5非常高较高较低很低

细菌数与腐生带的划分

样点号细菌总数（百万个/mL）腐生细菌数（千个/mL）腐生菌数／

总菌数（％）

腐生水波动范围平均波动范围平均

1 1.7～3.3 2.5 0.2～1.9 1.1 0.04 β-腐生带

2 1.6～3.4 2.4 0.9～3.0 2.0 0.08 β-腐生带

3 1.9～3.0 2.5 0.2～6.0 2.9 0.11 β-腐生带

4 4.3～5.0 4.6 9.7～16.

5 13.3 0.30 α-腐生带

5 1.8～3.

6 2.6 1.4～6.2 3.0 0.11 β-腐生带

6 3.5～6.8 4.8 59.2～175.2 116.0 2.42 多-腐生带

7 3.1～4.4 3.7 19.2～20.5 20.0 0.54 α-腐生带

8 2.0～2.7 2.3 10.3～36.2 20.2 0.84 α-腐生带

9 2.3～6.9 4.0 10.8～147.6 64.9 1.62 多-腐生带∙粪便污染指示菌

∙指示菌的理想条件

o该菌大量存在于人粪中，数量高于病原菌；

o在受人粪污染的水体中该菌易于检出，而未受人粪污染的水体中则无此菌；

o在水体中该菌不会自行繁殖；

o在水体中该菌的存活时间应长于致病菌，对氯与臭氧等消毒剂以及其它不良因素的抵抗力强于致病菌；

o该菌检测方法简捷；

o该菌适用于淡水、海水等各种水体。

∙较适宜的指示菌

大肠菌群（coliform group，简称coliform）、粪链球菌（Streptococcus faecalis）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）常用作粪污指标菌。

∙大肠菌群

o大肠菌群的特征

大肠菌群：指一群需氧、兼性厌氧的，能在37°C培养24小时使乳糖发酵产酸产气的G－无芽孢杆菌。包括大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等。

大肠菌群的鉴别

o大肠菌群的检测

发酵法亦称多管发酵法或三管发酵法。以不同稀释度的样品分别接种乳糖胆盐发酵培养基（或其它乳糖发酵培养基）各数管。培养24小时后，观察培养结

果。若观察到乳糖发酵产酸产气现象，称为阳性反应。记下阳性反应的试管数，

查专用统计表求出大肠菌群的最可能数（MPN）。

滤膜法选用孔径为0.45~0.65mm的微孔滤膜，抽滤一定数量的水样，使水样

中的细菌截留在滤膜上。然后，将滤膜贴在选择性培养基上，培养后直接计数

滤膜上的大肠菌群菌落，算出每100 mL水样中含有的总大肠菌群数。

o大肠菌群指标

大肠菌群指数是指每升水中所含的大肠菌群细菌的个数。

大肠菌群值则是指检出一个大肠菌群细菌的最少水样量（毫升数）。

我国饮用水的质量标准规定，大肠菌群指数不得大于3，大肠菌群值不得小于333mL。

第二节空气的细菌学检测

∙空气中细菌检测方法

∙撞击法亦称裂隙式撞击法。利用抽气泵的吸引，使一定量空气强迫通过一狭缝或喷嘴，在出口处形成高速喷射气流，空气中携带微生物的悬浮颗粒依靠惯性撞击并粘附于转动的营养琼脂培养基平皿上，37℃培养24小时，计算菌落数。计数结果以“c fu/m3”表示。这种采样法不受气流影响，采样量准确，已成为世界各国首选的空气细菌采样方法。

∙平皿沉降法靠地心引力将空气中携带微生物的悬浮颗粒沉降到营养琼脂培养基平皿中，37℃培养24小时，计算菌落数。计数结果以“cfu/皿（9cm2）”表示。平皿沉降法已有100多年的历史，由于简单易行，曾在国际上广为应用，我国至今仍广泛采用。平皿沉降法的误差较大，已逐渐被淘汰。

∙空气中细菌总数指标

前苏联提出的室内空气的细菌总数指标：清洁空气的细菌总数，冬季＜4.5×103 cfu/m3，夏季＜1.5×103 cfu/m3；污染空气的细菌总数，冬季>7×103 cfu/m3，夏季>2.5×103 cfu/m3。日本的细菌总数指标：清洁空气的细菌总数＜30 cfu／皿；普通空气的细菌总数＜75 cfu/皿。

我国室内空气中细菌总数的卫生标准（GB/T17093－1997）为：细菌总数≤4×103 cfu／m3（撞击法）或≤45 cfu／皿（沉降法）。

第三节污染物毒性的细菌学检测

∙污染物毒性检测（发光细菌检测法）

利用某些细菌的生物发光现象，可借助于活体细胞内具有的ATP、荧光素（FMN）和荧光素酶发光。该发光过程极易受到外界条件的影响，如有毒有害有机物与发光细菌接触时，发光的强度将改变，随着毒物浓度的增加而发光减弱。利用发光细菌检测仪可测得发光细菌的发光强度，从而得知毒物的毒性大小。磷发光杆菌美国贝克曼公司发光细菌检测仪；中科院南土所DXY－2型；华东师范大学生物系SDJ－1型生物发光光度计

∙污染物致突变性检测（Ames试验）

鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株（His-），当培养基中不含有组氨酸时它们不能生长，但当受诱变剂作用后，菌体DNA受到损伤，大量细胞回复突变为野生型菌株，这时培养基中即使不含组氨酸，该菌也能生长。利用这个特性可检测被检物质是否具有致突变性。

第四节应用PCR技术检测环境微生物

美国Cetus公司Mullis等人于1985年建立了无细胞分子克隆系统（cell-free molecular cloning）即聚合酶链式反应（polymerase Chain Reaction），简称PCR。该反应是在体外合成特异性DNA片段的方法。

∙PCR技术的基本原理