动植物细胞培养

二,培养技术
动物细胞的体外培养有两种类型: 贴壁依赖性细胞: 大多数动物细胞在离体培养条件下都需 要附着在带有适量正电荷的固体或半固体的 表面上才能正常生长,并最终在附着表面扩 展成单层. 非贴壁依赖性细胞 : 可采用类似微生物培养的方法进行悬浮培养
动物细胞大规模培养方法可概 括为
悬浮培养 固定化培养 微载体培养法
连续培养法 采用连续培养反应器,在投料和接种培养一段 时间后,以一定速度连续采集细胞与培养液, 并以同样速度供给新鲜培养基,此种培养方式 可使细胞生长环境长期维持恒定. 连续培养法细胞生产能力一般较分批法高,但 因细胞生长缓慢,培养时间长,要维持系统无 菌状态,技术条件要求相当苛刻.
悬浮培养具有三个基本优点 : ①增加培养细胞与培养液的接触面,改 善营养供应; ②可带走培养物产生的有害代谢产物, 避免有害代谢产物局部浓度过高等问题; ③保证氧的充分供给.
简单 快,倍增时 间0.5-5小时 内部 代谢调节 不敏感 环境敏感 无 细胞分化 低 剪切应力敏感 传统变异,筛选 广泛使用 技术 细胞或产物浓度 较高
第一节 植物细胞培养技术
在人工控制下高密度大量培养有益植物 细胞技术称之为植物细胞大规模培养, 其目的在于通过细胞工业规模培养,获 得细胞,初级及次级代谢产物,为药品, 食品及化工行业提供服务.尽管植物细 胞实验室与工业化培养在技术上有许多 相似之处,但培养方式,设备及条件和 培养基等亦有很大差别.
1,细胞悬浮培养法
细胞在培养液中呈悬浮状态生长繁殖的培养方 法谓之悬浮培养法.其培养方式有
批量法 半连续法 连续法
适用于培养确立细胞株,杂交瘤细胞,肿瘤细 胞,血液细胞及淋巴组织细胞,用于大量生产 疫苗,α-干扰素,白介素及单克隆抗体等药品. 此法不适于包括二倍体细胞在内的正常组织细 胞的培养.
细胞悬浮培养法的优点
二,培养基
培养基的成分由无机盐类,碳源,维生 素,植物生长激素,有机氮源,有机酸 和一些复合物质组成. 选择培养基的基本原则: 需要根据不同培养对象,培养目的及培 养条件探索适宜培养基. 选择的培养基在培养过程使细胞总体积 倍增时间1天左右为宜.
三,培养方式
悬浮培养法
分批培养法 半连续培养法 连续培养法
固定化培养法
1,悬浮培养
分批培养法 主要采用气升式反应器,其培养过程用 通气代替搅拌,细胞产量高于平叶轮培 养器. 植物细胞生长规律:随着细胞增长,培养 液营养物质不断下降.细胞增长过程也 分为延迟期,对数生长期,转换期,静 止期及衰减期等阶段.
半连续培养法: 在反应器中投料和接种培养一段时间后, 将部分培养液和新鲜培养液进行交换的 培养方法称之为半连续培养法.反应过 程通常以一定时间间隔进行数次反复操 作以达到培养细胞与生产有用物质的目 的.
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CO2的含量水平对细胞的生长 同样相当重要
研究发现,植物细胞能非光合地固定一定浓度 的CO2,如在空气中混以2%～4%的CO2能够 消除高通气量对长春花细胞生长和次级代谢物 产率的影响.因此,对植物细胞培养来说,在 要求培养液充分混合的同时,CO2和氧气的浓 度只有达到某一平衡时,才会很好地生长,所 以植物细胞培养有时需要通入一定量的CO2气 体.
一,植物细胞培养过程特点
1 ,植物细胞的特性--成团 植物细胞要大得多,其平均直径要比微生物细胞 大30～100倍. 同时植物细胞通常是以细胞数在2～200之间,直 径为2mm左右的非均相集合细胞团的方式存在. 细胞团通常由以下几种方式存在: ①在细胞分裂后没有进行细胞分离; ②在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时, 开始分泌多糖和蛋白质; ③以其他方式形成粘性表面,从而形成细胞团.
工艺流程
2,固定化培养法
细胞限制或定位于特定空间位置的培养 技术谓之细胞固定化培养法.动物细胞 几乎都可采用固定化方法培养.固定化 方法有:
吸附法(所用载体有陶瓷颗粒,玻璃珠及硅 胶颗粒 ) 包埋法 (将细胞包埋于琼脂,琼脂糖,胶 原及血纤维等海绵状基质中)
4,泡沫和表面粘附性
植物细胞培养过程中产生泡沫的特性与微生 物细胞培养产生的泡沫是不同的.植物细胞 培养过程中产生的气泡比微生物培养系统中 气泡大,且被蛋白质或粘多糖覆盖,因而粘 性大,细胞极易被包埋于泡沫中,造成非均 相的培养.尽管泡沫对于植物细胞来说,其 危害性没有微生物细胞那么严重,但如果不 加以控制,随着泡沫和细胞的积累,也会对 培养系统的稳定性产生很大的影响.
动物细胞培养技术的发展
一,培养基
天然培养基:工业用动物细胞培养基与实验室 培养基基本一致,实验室用培养基需添加5% 一10%小牛血清,但大规模培养动物细胞应用 小牛血清. . 组织细胞培养中常用的天然培养基是血清.这 是因为血清中含有大量的蛋白质,核酸,激素 等丰富的营养物质,对促进细胞生长繁殖,粘 附及中和某些物质的毒性起着一定的作用.最 常用的是小牛血清,胎牛血清.人血清用于一 些人细胞系.大多数动物细胞培养必须在培养 基中添加血清,但在许多情况下,细胞可在无 血清条件下维持和增殖.
增加氮,磷和钾的含量会使细胞的生长加快,增加培养 基中的蔗糖含量可以增加细胞培养物的次生代谢物.
搅拌方式与通气的影响 生长调节剂 前体 前体的作用在植物细胞培养中未完全清楚,可能是外源 前体激发了细胞中特定酶的作用,促使次生代谢产物量的增 加. 在细胞生长过程中生长调节剂的种类和数量对次生代谢 产物的合成起着十分重要的作用.植物生长调节剂不仅会影 响到细胞的生长和分化,而且也会影响到次生代谢产物的合 成.生长素和细胞分裂素有使细胞分裂保持一致的作用,不 同类型的生长素对次生代谢产物的合成有着不同的影响.生 长调节剂对次级代谢的影响随着代谢产物的种类的不同而有 很大的变化,对生长调节剂的应用需要非常慎重.
悬浮培养设备
悬浮培养生物反应器
液体悬浮培养瓶
连续培养系统装置
非机械搅拌式反应器
鼓泡式反应器
内循环反应器
外循环反应器
非机械搅拌反应器的应用
韩国KBT植物细胞反应器
2,悬浮培养生物反应器
1)机械搅拌式生物反应器优点: 能获得较高的KLα 2)剪切力
4,固定化培养法
固定化培养采用固定化反应器,这类反应器有 网状多孔板,尼龙网套及中空纤维膜等形式. 固定化培养法的优点:(1)提高了次生物质的 合成,积累;(2)能长时间保持细胞活力; (3)可以反复使用;(4)抗剪切能力强; (5)耐受有毒前体的浓度高;(6)遗传性状 较稳定;(7)后处理难度小;(8)更好的光 合作用;(9)促进或改变产物的释放. 植物细胞的固定化常采用:海藻酸盐,卡拉胶, 琼脂糖和琼脂材料,均采用包埋法,其他方式 的固定化植物细胞很少使用.
第二节 动物细胞培养技术
动物细胞培养开始于本世纪初,到1962年规模 开始扩大,发展至今已成为生物,医学研究和 应用中广泛采用的技术方法,利用动物细胞培 养生产具有重要医用价值的酶,生长因子,疫 苗和单抗等,已成为医药生物高技术产业的重 要部分.大规模动物细胞培养在生物技术产业 化进程中显示出强大的潜力. 利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世 界生物高技术产品市场份额的50%.
已有商品市售无血清培养基主要有下述3 类: ①基本合成培养基; ②基本合成培养基加生长因子; ③基本合成培养基加组织抽提物.
合成培养基的种类虽多,但一般都含有氨 基酸,维生素,碳水化合物,无机盐和 一些其它辅助性成分. 在细胞培养中,大多数细胞需要谷氨酰胺 作为能源和碳源 复杂培养基都含有核苷,柠檬酸循环中间 体,丙酮酸,脂类,氧化还原剂如抗坏 血酸,谷胱甘肽等及其他各种化合物.
填充床/流化床反应器
填充床反应器
流化床反应器
膜反应器
三,影响细胞培养因素
细胞种质影响 外界因素影响 光照影响 光对黄酮化合物形成的影响,培养物在光照特别 是紫外光下黄酮及黄酮类醇糖苷积累的所有酶活性均 增加.通常光照采用荧光灯,或者荧光灯和白炽灯混 合,其光强度是300～10000lx(6～100m/m2s)可以 连续光照,也可以每天光照12～18h. pH 培养基成分的影响:
第七章 动植物细胞与微藻培 养及反应器
动植物细胞培养与产品
动植物细胞培养是指动植物细胞在体外 条件下的存活或生长,此时细胞不再形成 组织. 其产品包括疫苗,单克隆抗体,免疫调 节剂,酶和激素等.
动,植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁,且大多数哺乳动物细胞附 着在固体或半固体的表面才能生长;对营养要 求严格,除氨基酸,维生素,盐类,葡萄糖或 半乳糖外,还需有血清.动物细胞对环境敏感, 包括pH,溶氧,温度,剪切应力都比微生物有 更严的要求,一般须严格的监测和控制. 植物细胞对营养要求较动物细胞简单.但由于 植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一 定浓度的培养产物,以及植物细胞生长较微生 物要缓慢,长时间的培养对无菌要求及反应器 的设计也提出特殊的要求.
在制备培养基时,通常要考虑 以下因素:
pH 碳酸盐缓冲系统由于毒性小,成本低,对培养物有营养作 用 缓冲能力 渗透压 粘度 培养基的粘度主要受血清含量的影响,在多数情况下,对 细胞生长没有什么影响.在搅拌条件下,用羧甲基纤维素增加 培养基的粘度,可减轻细胞损害.这对在低血清浓度或无血清 下条件下培养细胞显得尤为重要 .
2,植物细胞培养液的流变特性 : 由于植物细胞常常趋于成团,且不少细胞在培养 过程中容易产生粘多糖等物质,使氧传递速率降 低,影响了细胞的生长. 影响培养基粘度的因素: 影响培养基粘度的因素: 细胞本身和细胞分泌物 细胞年龄,形态和细胞团的大小 一般规则:在相同的浓度下,大细胞团的培养液 一般规则 的表观粘度明显大于小细胞团的培养液的表观粘 度
第二类亦称为添加生长因子培养基,其特点 是组成物质的种类与数量均为已知,并可按 需要增减与删除,其最大优点是: ①可用于培养不同种类的细胞及含血清培养基 中不能生长的细胞; ②可用于杂种细胞,基因工程细胞及突变体细 胞培养,生产有用物质.大大简化细胞培养 产物分离纯化操作.
目前人们正研究起血清作用的各类激素 及生长因子,如铁传递蛋白,乙醇胺, 胰岛素,促胃酸激素,维生素C,考的松 及硒等成分的功能.以期获得更适宜于 大规模培养动物细胞的培养基.
可连续收集部分细胞进行移植继代培养, 传代时无需消化分散,免遭酶类,EDTA 及机械损害. 细胞收率高,并可连续测定细胞浓度, 还有可能实现大规模直接克隆培养.
培养过程中,为确保细胞呈单颗粒均匀悬浮状 态,需采用搅拌或气升式反应器,以较低搅拌 速度及一定速度通入含5%CO2的无菌空气,保 持细胞悬浮态并维持培养液溶解氧. 此外不同细胞悬浮条件亦异,为使细胞不致凝 集,成团或沉淀,在配制培养基的基础盐溶液 中不加钙和镁离子.间歇或连续更换部分培养 液,可维持pH值,若使用HEPES缓冲盐溶液时 尚可不必连续通入含5%CO2空气.
3,植物细胞培养过程中的氧传递 所有的植物细胞都是好气性的,需要连续不 断地供氧. 植物细胞培养时对溶氧的变化非常敏感,太 高或太低均会对培养过程产生不良地影响. 与微生物培养过程相反,植物细胞培养过程 并不需要高的气液传质速率,而是要控制供 氧量,以保持较低的溶氧水平.
长春花细胞培养时,当通气量从0.25L/(Lmin) 上升至0.38L/(Lmin)时,细胞的相对生长速 率可从0.34d/L上升至0.41d/L;而当通气量再 增加时,细胞的生长速率反而会下降. 不同氧浓度时对毛地黄细胞进行了培养,当培 养基中氧浓度从10%饱和度升至30%饱和度时, 细胞的生长速率从0.15d/L至0.20d/L,如果溶 氧浓度继续上升至40%饱和度时,细胞的生长 速率却反而降至0.17d-1.
动植物,微生物细胞的培养比较 微生物 大 小 悬浮生长 营养要求 生长速率 1-10 可以 动物细胞 10-100 多数细胞需附着 表面才能生长 非常复杂 慢,倍增时间 15-100小时 内部,激素 非常敏感 有 非常高 不常使用 低 植物细胞 10-100 可以,但易结团, 无单个细胞 较复杂 慢,倍增时间 24-74小时 内部,激素 能忍受广泛范围 有 高 有时使用 低