DNA甲基化详解
DNA甲基化解析
DNA甲基化DNA甲基化（DNA methylation）是最早发现的修饰途径之一，大量研究表明，DNA 甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
含义：在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。
大多数脊椎动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5' 端的非编码区，并成簇存在。
甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。
DNA的甲基化可引起基因的失活，DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡，由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的原件缩入大沟而不利于转录的起始，导致基因失活。
另外，序列特异性甲基化结合蛋白（MBD/MeCP）可与启动子区的甲基化CpG岛结合，阻止转录因子与启动子作用，从而阻抑基因转录过程。
DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌呤（7-mG）结构基因：含有很多CpG 结构，2CpG 和2GPC 中两个胞嘧啶的5 位碳原子通常被甲基化，且两个甲基集团在DNA 双链大沟中呈特定三维结构。
基因组中60%～90% 的CpG 都被甲基化，未甲基化的CpG 成簇地组成CpG 岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。
有实验证明超甲基化阻遏转录的进行。
DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化，使DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点，以及DNA 酶的敏感位点，使染色质高度螺旋化，凝缩成团，失去转录活性。
5 位C 甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶（C-T转换），由此可能导致基因置换突变，发生碱基错配，如果在细胞分裂过程中不被纠正，就会诱发遗传病或癌症。
DNA甲基化在基因调控中的作用研究
DNA甲基化在基因调控中的作用研究DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，通过在DNA分子上加上甲基基团，起到调控基因表达的作用。
近年来，科学家们对DNA甲基化的研究日益深入，并发现它在基因调控中扮演着重要的角色。
本文将深入探讨DNA甲基化在基因调控中的作用以及相关的研究进展。
一、DNA甲基化的基本原理DNA甲基化是指在DNA分子中的胞嘧啶基团上加上甲基基团的化学修饰过程。
甲基基团的加入是通过甲基转移酶催化实现的。
在DNA分子中，甲基化通常发生在CpG二核苷酸（C为胞嘧啶，G为鸟嘌呤）的C上。
甲基化的过程可以改变DNA的结构，进而对基因的表达产生直接的影响。
二、DNA甲基化与基因调控的关系DNA甲基化在基因调控中扮演着重要的角色。
一方面，DNA甲基化可以直接影响DNA序列的稳定性，从而调控基因的启动和抑制。
甲基化的加入可以阻碍转录因子与DNA结合，抑制转录过程的进行，从而抑制基因的表达。
而当DNA区域未被甲基化时，转录因子能够更容易地与DNA结合，启动基因的表达。
另一方面，DNA甲基化还可以通过其他机制间接地影响基因调控。
例如，甲基化可以影响染色质结构的三维组织，从而影响基因区域的可及性和染色质的重塑。
这些间接的影响机制使得DNA甲基化在基因调控中具有更为复杂的功能。
三、DNA甲基化与疾病的关联DNA甲基化异常与多种疾病的发生发展密切相关。
研究表明，DNA甲基化异常可以导致基因的异常表达，从而引发肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等多种疾病的发生。
例如，DNA甲基化的缺陷可以使得肿瘤抑制基因的表达下降，导致癌细胞的增殖和转移。
另外，DNA甲基化异常还与心血管疾病和神经系统疾病的发生密切相关。
因此，深入研究DNA甲基化与疾病之间的关系，对于疾病的防治具有重要的意义。
四、DNA甲基化的研究方法近年来，随着技术的进步，科学家们发展了一系列研究DNA甲基化的方法。
其中，最常用的方法之一是甲基化特异性PCR（MSP），它可以通过特异性引物的设计，检测DNA中的甲基化位点，从而分析甲基化的状态。
DNA甲基化
DNA甲基化概述在哺乳动物基因组中，甲基化是一种表观遗传机制，包括将甲基转移到胞嘧啶的C5位置形成5-甲基胞嘧啶。
DNA甲基化通过招募参与基因抑制的蛋白或通过抑制转录因子与DNA的结合来调节基因表达。
在发育过程中，DNA甲基化的模式在基因组中发生变化，这是DNA从头甲基化和去甲基化的动态过程的结果。
DNA甲基化是被一个甲基转移酶家族所催化，转移S腺苷甲硫氨酸(SAM)的一个甲基到第五个碳胞嘧啶残基形成5mc , Dnmt3a和Dnmt3b可以建立一个新的DNA甲基化模式来去修饰DNA，被称为从头甲基化。
另一方面，Dnmt1在DNA复制过程中起作用，将亲代DNA链上的甲基化模式复制到新合成的子链上。
这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。
这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。
当细胞到达终末分化时，Dnmt的表达大大降低。
这似乎表明有丝分裂后细胞的DNA甲基化模式是稳定的。
大部分DNA的甲基化发生在鸟嘌呤核苷酸或CpG位点之前的胞嘧啶上。
总的来说，哺乳动物基因组中CpG位点的减少可能是由于5 - mc可脱氨成胸腺嘧啶的诱变潜力。
剩余的CpG位点分布在整个基因组中，除了CpG岛外，它们都被严重甲基化。
DNA甲基化对沉默逆转录病毒分子、调节组织特异性基因表达、基因印记和X染色体失活至关重要。
不同基因组区域的DNA甲基化可能根据潜在的遗传序列对基因活动产生不同的影响。
一、DNA甲基化的位置1.1 基因间区大约45%的哺乳动物基因组由转座因子和病毒因子组成，这些因子被大量甲基化而沉默。
这些元素中的绝大多数是通过DNA甲基化或随着时间的推移由于5mC的破坏而产生的突变而失活的。
如果表达，这些元素是潜在的有害的，因为它们的复制和插入可以导致基因损坏和DNA突变。
胞内颗粒(IAP)是小鼠基因组中最具侵袭性的逆转录病毒之一。
在整个生命过程中，IAP在配子形成、发育和成年阶段都被高度甲基化。
甚至在胚胎内部，当基因组其余部分相对低甲基化时，Dnmtl维持对IAP元件的抑制。
DNA甲基化
DNA甲基化DNA甲基化概述在哺乳动物基因组中，甲基化是一种表观遗传机制，包括将甲基转移到胞嘧啶的C5位置形成5-甲基胞嘧啶。
DNA甲基化通过招募参与基因抑制的蛋白或通过抑制转录因子与DNA的结合来调节基因表达。
在发育过程中，DNA甲基化的模式在基因组中发生变化，这是DNA 从头甲基化和去甲基化的动态过程的结果。
DNA甲基化是被一个甲基转移酶家族所催化，转移S腺苷甲硫氨酸(SAM)的一个甲基到第五个碳胞嘧啶残基形成5mc , Dnmt3a和Dnmt3b可以建立一个新的DNA甲基化模式来去修饰DNA，被称为从头甲基化。
另一方面，Dnmt1在DNA复制过程中起作用，将亲代DNA链上的甲基化模式复制到新合成的子链上。
这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。
这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。
当细胞到达终末分化时，Dnmt的表达大大降低。
这似乎表明有丝分裂后细胞的DNA甲基化模式是稳定的。
大部分DNA的甲基化发生在鸟嘌呤核苷酸或CpG位点之前的胞嘧啶上。
总的来说，哺乳动物基因组中CpG位点的减少可能是由于5 - mc可脱氨成胸腺嘧啶的诱变潜力。
剩余的CpG位点分布在整个基因组中，除了CpG岛外，它们都被严重甲基化。
DNA甲基化对沉默逆转录病毒分子、调节组织特异性基因表达、基因印记和X染色体失活至关重要。
不同基因组区域的DNA甲基化可能根据潜在的遗传序列对基因活动产生不同的影响。
一、DNA甲基化的位置1.1 基因间区大约45%的哺乳动物基因组由转座因子和病毒因子组成，这些因子被大量甲基化而沉默。
这些元素中的绝大多数是通过DNA甲基化或随着时间的推移由于5mC的破坏而产生的突变而失活的。
如果表达，这些元素是潜在的有害的，因为它们的复制和插入可以导致基因损坏和DNA突变。
胞内颗粒(IAP)是小鼠基因组中最具侵袭性的逆转录病毒之一。
在整个生命过程中，IAP在配子形成、发育和成年阶段都被高度甲基化。
甚至在胚胎内部，当基因组其余部分相对低甲基化时，Dnmtl维持对IAP元件的抑制。
DNA甲基化与临床应用医学知识讲解
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应用前景3--肿瘤旳去甲基化治疗
➢ DNA甲基化程度依赖于DNMT活性。正常甲基化 模式旳建立需要DNMT1和DNMT3旳共同作用， DNMT1是DNMT3开启CpG核苷酸从头甲基化旳 确保，而DNMT3则使甲基化水平稳定在正常需要 水平（去甲基化） —— 克制DNMT活性药物是治疗肿瘤旳新希望
应用前景3--肿瘤旳去甲基化治疗
31 引言及概念 2 甲基化旳作用 3 甲基化检测有关技术 4 临床有关应用
甲基化检测有关技术
A．基因组甲基化水平(Methylation Content)旳分析
1. 高效液相色谱 2. 高效毛细管电泳法
B．候选基因(Candidate Gene)甲基化分析
1. 甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法 2. 重亚硫酸盐测序法 3. 甲基化特异性旳PCR 4. 甲基化荧光法(MethyLight) 5. 焦磷酸测序 6. 结合重亚硫酸盐旳限制性内切酶法
DNA甲基化在动物胚胎和生殖细胞发育过程中旳重编程
转录克制
CPG island旳功能：经过甲基化与去甲基化，调控下游基因旳体现 —— 基因体现旳调控开关
影响基因体现
直接克制基因体现或甲基化 旳 CpG双核苷酸序列可被甲基结 合蛋白家族 辨认，而后者可经过 吸引补充组蛋白去乙酞化酶和组 蛋白甲基化转移酶等组蛋白修饰 蛋白质来变化染色质旳活性 ，以 间接方式影响基因体现。
cfDNA甲基化液体活检技术
燃石医学自主研发了无创甲基化检测系统 (MERMAID™)，利用多层级甲基化探针设计策略， 可实目前检测成本可控旳情况下同步检测超出10万个 临床诊疗有关旳甲基化CpG位点，并经过机器学习 算法建立分类模型，实现对检测样本自动分型。
DNA甲基化——表观遗传学的重要组成部分
DNA甲基化——表观遗传学的重要组成部分DNA甲基化是一种表观遗传学调控机制，通常指DNA分子上的甲基化修饰。
这种化学变化涉及DNA链上的甲基基团与Cytosine碱基的配对，对基因表达和细胞分化等生命过程具有重要作用。
DNA甲基化不仅在正常生长发育中发挥至关重要的作用，而且也涉及很多人类疾病的发展。
本文将介绍DNA甲基化的基本原理、分布方式、调控机制及其在疾病中的作用。
一、DNA甲基化的基本原理DNA是由4种不同的核苷酸构成的，其中包括Adenine、Thymine、Cytosine和Guanine。
DNA的甲基化通常发生在Cytosine碱基的C5位，即通过甲基基团与细胞内的S-Adenosyl Methionine（SAM）反应，形成5-甲基Cytosine（5mC）。
DNA甲基化是基因组合成和生物遗传变异的关键机制之一。
它可以调控基因的表达和细胞分化，与疾病的发展密切相关。
虽然越来越多的研究表明，DNA甲基化是一种可逆的表观遗传修饰，但它仍然是一种稳定的标记，可以被逐代遗传，影响基因表达和细胞分化。
二、DNA甲基化的分布方式DNA甲基化在不同种类和类型的细胞中存在和分布不同。
在人体内，DNA甲基化主要发生在GC富集区域，如基因启动子、繁殖起始点、转录因子结合区等。
这些区域往往影响到基因表达的调控，因此被视为关键的甲基化信号的地点。
另一方面，DNA甲基化还出现在基因体内部的非编码区域，如intron、intergenic regions、satellite DNA和telomeres。
虽然对它们的确切功能还有争议，但这些甲基化信号可能参与调控DNA复制、染色体结构和修复。
三、DNA甲基化的调控机制DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（DNMTs）负责催化核苷酸中的甲基基团的加成。
DNMTs可以对一些具有特定序列和结构的DNA区域进行偏好性的甲基化修饰。
这些区域的一个重要特征是在基因表达和细胞分化中发挥着重要的作用。
DNA甲基化的总结
DNA甲基化的总结DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，通过在DNA分子中加入甲基基团来调控基因的表达和染色质结构。
在生物体发育与生长过程中，DNA甲基化在基因表达调控以及细胞命运决定中起着关键作用。
本文将从DNA甲基化的定义、机制、调控以及在生物体中的重要作用等方面进行总结。
DNA甲基化是指在DNA分子的胞嘧啶基上加入甲基基团，从而产生5-甲基胞嘧啶（5-mC）。
DNA甲基化是一种静默性的表观遗传修饰，即当DNA分子上的一些区域进行甲基化时，这些区域的基因转录活性会被抑制，从而导致基因的表达被关闭。
DNA甲基化主要在CpG二核苷酸位点上发生，CpG岛是一种富含CpG二核苷酸的序列区域，常位于基因的启动子区域。
在正常状态下，CpG岛通常处于无甲基化状态，有利于基因的表达。
然而，一旦CpG岛发生甲基化，就会抑制基因的转录，进而影响到细胞的命运和发育。
DNA甲基化的机制主要涉及DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）以及DNA甲基化的相关蛋白质。
在甲基化过程中，DNMT通过转移甲基基团（CH3）到DNA分子上，从而实现DNA甲基化修饰。
而DNA甲基化的去甲基化过程则是通过DNA去甲基化酶进行，该酶能够将DNA分子上的甲基基团进行脱除。
此外，DNA甲基化修饰还与一系列调控蛋白质相互作用，形成复杂的调控网络，从而精细地控制基因的表达。
DNA甲基化的调控十分复杂，受到多种因素的影响。
首先，DNA序列本身对甲基化修饰的敏感性不同。
CpG岛通常是DNA甲基化的热点区域，而在其他部位则相对不易甲基化。
其次，环境因素也能够影响DNA甲基化的模式。
研究发现，环境因素如饮食、毒物等可以改变DNA甲基化状态，从而对基因表达产生影响。
此外，还有一些调控蛋白质与DNA甲基化直接相关，如DNA甲基转移酶和DNA去甲基化酶，它们能够对DNA甲基化修饰过程进行调节。
DNA甲基化在生物体中发挥着重要的作用。
DNA甲基化检测技术解读
肿瘤类型
乳腺癌、肺癌、食管癌、结肠癌、胃癌、胰、 肝 癌 乳腺癌、卵巢癌 GIT 、头与颈部瘤、NHL、肺癌 肺癌 乳腺癌 、甲状腺癌、胃癌 乳腺癌、前列腺癌 前列腺癌、乳腺癌、肾癌 结肠癌、胃癌、子宫内膜瘤、卵巢癌 肺癌、脑瘤 非白血性白血病、淋巴瘤、鳞状细胞癌、肺癌 肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、鼻咽癌 成视网膜细胞瘤、少突神经胶质(细胞)瘤 肾细胞癌
DNA甲基化与肿瘤的关系
MGMT基因在许多肿瘤中被认为是抗肿瘤药物治疗的预测标记。MGMT启 动子肿瘤特异性甲基化，可以抑制MGMT蛋白的活性，从而使得肿瘤细胞对 烷化类的抗肿瘤药物敏感，因而被广泛用于肿瘤化疗治疗。
Figure： Kaplan–Meier Estimates of Overall Survival, According to
动子含有CpG岛。
— 是结构基因启动子的核心序列和转录起始点
CpG island的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达 —— 基因表达的调控开关
DNA甲基化的生物学意义
1、转录抑制
基因启动子 区的甲基化可影 响转录激活因子 和其识别序列 的结合.
DNA甲基化的生物学意义
2、影响基因表达
在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添 加甲基基团的化学修饰现象。
DNA甲基化的形式：
DNA甲基化主要形成5-mC和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟
嘌呤（7-mG）
CpG 岛（CpG Island）
在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译 区和第一个外显子区，CpG序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为 鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。 正常结构基因组中70%～ 90% 的独立CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地聚集形成CpG 岛 主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域，约有60％以上基因的启
dna甲基化名词解释
DNA甲基化名词解释什么是DNA甲基化？DNA甲基化是指在DNA分子中加入甲基基团（CH3）的过程。
甲基基团可以与DNA 中的胞嘧啶碱基（Cytosine，C）相连，形成5-甲基胞嘧啶（5-Methylcytosine，5mC）。
为什么DNA甲基化重要？DNA甲基化在生物体中起着重要的调控作用。
它可以影响DNA的稳定性、基因的表达和细胞的功能。
DNA甲基化在个体发育过程中起着关键的作用，也与许多疾病的发生和发展密切相关。
DNA稳定性维护DNA甲基化可以稳定DNA分子的结构，防止DNA双链解旋和酶切。
在DNA复制和修复过程中，甲基化可以保护DNA不受到不必要的修复或降解。
基因表达调控DNA甲基化可以直接或间接地影响基因的转录和翻译过程，从而调节基因的表达。
在一些基因的启动子区域，高度甲基化可以阻止转录因子结合，从而抑制基因的转录。
相反，低度甲基化可以促进基因的转录。
细胞功能调节DNA甲基化在细胞的分化和功能调控中起着关键的作用。
在多细胞生物中，不同细胞类型的DNA甲基化模式是不同的，这有助于维持细胞的特异性和功能。
DNA甲基化还可以调节细胞的增殖、凋亡和分化等过程。
DNA甲基化的调控机制DNA甲基化的形成和去甲基化是通过一系列酶的催化下进行的。
在哺乳动物细胞中，DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase）可以将甲基基团添加到DNA上，而DNA 去甲基化酶（DNA demethylase）可以将甲基基团从DNA上去除。
DNA甲基化与疾病的关联DNA甲基化异常与多种疾病的发生和发展密切相关。
以下是一些与DNA甲基化异常相关的疾病：1.癌症：DNA甲基化异常在多种癌症中广泛存在。
甲基化模式的改变可以导致关键基因的失活或过度表达，从而促进癌细胞的生长和侵袭。
2.免疫系统疾病：某些自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎，与DNA甲基化异常有关。
这些异常可以导致免疫系统的功能紊乱。
DNA甲基化
DNA甲基化
生物学术语
01 原理
03 类型
目录
02 酶分类 04 机制
DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表 现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲 基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变， 从而控制基因表达。
DNA甲基化（methylation）是真核细胞正常而普遍的修饰方式，也是哺乳动物基因表达调控的主要表观遗传 学形式。DNA甲基化后核苷酸顺序及其组成虽未发生改变，但基因表达受影响。尽管甲基化修饰有多种方式，被 修饰位点的碱基可以是腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位和胞嘧啶的C-5位，它们分别由不同的 DNA甲基化酶催化，但大多发生在基因启动子区CpG岛上。DNA甲基化时，胞嘧啶从DNA双螺旋上突出，进入能与酶 结合的裂隙中，在胞嘧啶甲基转移酶催化下，把活性的甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移至胞嘧啶5位上，形成5-甲基 胞嘧啶（5-MC）。基因启动子区的甲基化可导致转录沉寂。
DNA甲基化
• 2) 主动途径: 是由去甲基酶的作用, 将甲基 基团移去的过程。
去甲基化起始机制依然是一个谜
• DNA的去甲基化由基因内部的片段及与其结合的因子所调 控 • DNA去甲基化的分子机制假说： 1：与DNA半保留复制联系在一起，为被动去甲基化。 如果甲基化的DNA经半保留复制后不被甲基化，其DNA则 处于半甲基化状态，半甲基化的DNA如再次发生DNA半保 留复制，而DNA甲基化活性仍被抑制，则可预计略有50% 细胞处于半甲基化状态。 2：与半保留复制无关，为主动过程。 DNA去甲基化由“DNA去甲基化酶”催化。DNA去甲基 化实际上是在DNA糖苷酶的作用下，脱掉甲基化碱基的反 应等同于损伤DNA在糖苷酶及无碱基核酸酶酶切偶联催化 下的修复反应。曾有报道认为，RNA参与DNA的去甲基化 反应。
甲基化起始机制相关研究进展
• RNA介导的DNA甲基化路径（RdDM） 在表观遗传学研究中，小分子RNAs（siRNAs） 可以引导DNA甲基化、异染色质组蛋白修饰，导 致序列特异性转录基因沉默。
• 组蛋白H3 N端尾部作用 酿酒酵母研究系统，在本身不存在甲基化的酵母 基因组上建立DNA甲基化谱式，组蛋白H3 N端尾 部对于DNA甲基化起着不可或缺的作用。
5一甲基胞嘧啶糖基化酶是体内候 选去甲基化酶。
DNA 甲基化的机制
1) DNM T1, 持续性DNA 甲基转移酶 ① 使仅有一条链甲基化的DNA 双链完全甲基化； ② 参与DNA 复制双链中的新合成链的甲基化； ③ DNM T1 可能直接与HDAC (组蛋白去乙酰基转 移酶) 联合作用阻断转录。 2)DNM T3a、DNM T3b从头甲基转移酶 ① 它们可甲基化CpG, 使其半甲基化, 继而全甲基 化； ② 可能参与细胞生长分化调控, 其中DNM T3b在肿 瘤基因甲基化中起重要作用。
DNA甲基化检测技术全攻略
DNA甲基化检测技术全攻略DNA甲基化是指DNA分子中的碱基Cytosine（胞嘧啶）在其C5位点上与甲基基团结合形成5-甲基胞嘧啶的化学反应。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，被认为在基因组的稳定性和调控中起着关键的作用。
DNA甲基化异常与多种疾病的发生和发展密切相关，包括癌症、心血管疾病、神经系统疾病等。
因此，开发DNA甲基化检测技术，对于深入研究疾病的发生机制、早期诊断、疾病分型和治疗方案的制定具有重要意义。
一、DNA甲基化检测方法1.甲基特异性PCR(MSP)甲基特异性PCR是一种将DNA甲基化水平转化为PCR信号的方法。
该方法针对DNA甲基化位点进行甲基化特异性的酶切反应，然后利用PCR扩增技术对甲基化和非甲基化的DNA片段进行分离和测定。
2.甲基化特异性限制酶切(MSRE)甲基化特异性限制酶切方法依赖于特定甲基化位点上的酶切敏感性。
该方法先通过限制酶切鉴定DNA甲基化位点的状态，然后通过聚合酶链反应(PCR)或更高通量的测序技术进行测定。
3.甲基化特异性测序甲基特异性测序技术是一种通过测序方法直接确定DNA甲基化位点的状态。
这种方法依赖于高通量测序技术，可以同时测定数百万个甲基化位点。
4.甲基化敏感扩增多态性(MS-AFLP)甲基化敏感扩增多态性方法是一种将甲基化位点转化为特定扩增片段的方法。
该方法利用比较性PCR和限制酶切结合的方法，挑选与DNA甲基化状态相关的扩增产物，从而实现对DNA甲基化状态的测定。
二、DNA甲基化检测技术的应用1.疾病早期诊断2.疾病分型不同疾病的DNA甲基化模式存在差异，通过检测DNA甲基化状态可以将疾病进行分型，从而有针对性地制定治疗方案。
3.肿瘤治疗效果评估针对肿瘤治疗过程中的DNA甲基化变化，可以通过检测DNA甲基化状态来评估治疗效果。
如果治疗有效，DNA甲基化状态会发生改变。
4.基因组稳定性分析三、DNA甲基化检测技术的优势和挑战优势：1.高灵敏度和特异性：DNA甲基化检测技术具有高灵敏度和特异性，可以测量DNA甲基化的水平和位点。
解读DNA甲基化
中国测序论坛
DNA甲基化的检测
• 方法概括起来可分为三类：
基因组整体水平的甲基化检测
基因特异位点甲基化的检测
新甲基化位点的寻找
中国测序论坛
高选择性单碱基甲基化分析技术
• 新一代高通量测序平台的多区域多样本的 甲基化检测技术主要针对需要在多个样本 中检测多个候选区域的科研工作者。
转录处于关闭状态。
中国测序论坛
4、DNA甲基化与胚胎发育
• 在胚胎发育的不同时期，基因组范围内的 DNA甲基化水平会发生剧烈的改变，改变 最剧烈的阶段为配子形成期与早期胚胎发 育阶段。
• DNA甲基化对胚胎正常发育和等位基因的 选择表达至关重要。错误甲基化模式的建 立将引起人类的疾病，如脆性X染色体综合 症。
中国测序论坛
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DNA去甲基化
• DNA去甲基化的方式有两种： • 1) 被动途径: 由于核因子转录N F（一种多
向转录调节作用的蛋白质） 粘附甲基化的 DNA , 使粘附点附近的DNA不能被完全甲 基化, 从而阻断DNM T1 的作用; • 2) 主动途径: 是由去甲基酶的作用, 将甲基 集团移去的过程。
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DNA甲基化的生物学功能
1. DNA甲基化与遗传物质的稳定性 2. DNA甲基化与基因表达调控 3. DNA甲基化与表观遗传学 4. DNA甲基化与胚胎发育 5. DNA甲基化与肿瘤
中国测序a) 研究证明细菌DNA复制起始与DNA甲基化以及DNA 与细菌质膜的相互作用有关。DNA便甲基化作为一 种标签决定了复制起始点与细胞膜的结合，控制了 复制起始，使得DNA复制与细胞分裂保持一致。
基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用， DNMT1是DNMT3启动CpG核苷酸从头甲基化的保证，而 DNMT3则使甲基化水平稳定在正常需要水平（去甲基化 ）
DNA甲基化
（2）采用特异性PCR检测：是利用甲基化特异引物和非甲基化 2 采用特异性PCR检测
特异引物来分析基因启动子区引物对应的几个CG二核苷酸甲基化状况， 有时需要设计多对引物，PCR条件必须严格控制以避免假阳性结合。
• 这两种方法一般给出定性结果，不能定量 这两种方法一般给出定性结果，
2、亚硫酸盐测序
它是检测甲基化的“金标准”，但需要大量的克隆测序，过程较为 繁琐、昂贵。
植物DNA的甲基化及其生物学功能 植物DNA的甲基化及其生物学功能 DNA DNA甲基化含义 一、DNA甲基化含义 DNA甲基化相关机制 二、DNA甲基化相关机制 DNA甲基化的功能 三、DNA甲基化的功能 四、甲基化检测技术 五、结论与展望
结论与展望
• DNA甲基化在基因表达调控中扮演着重 要角色．虽然DNA甲基化是各种表观遗 传学现象中最早被人们认识也是研究相 对较成熟的现象之一，但是目前对于 DNA甲基化的机理机制的探索还仍然处 于比较初级的阶段．一些问题有待进一 步验证。
3、DNA去甲基化 去甲基化
DNA去甲基化是一种重要的DNA功能调节机 制，通常分为2种类型位点特异性去甲基化 位点特异性去甲基化 和总基因组的去甲基化 总基因组的去甲基化。 总基因组的去甲基化 • 两者在胚胎发育过程中有着重要的作用，保证 在特定细胞中只有需要的基因才处于活性状态 引。 • DNA去甲基化的机制分为被动去甲基化 主 被动去甲基化和主 被动去甲基化 动去甲基化两种。被动去甲基化过程与DNA半 动去甲基化 保留复制有关，而主动去甲基化过程需要“去 甲基化酶”的参与。
3 DNA甲基化引起的植物 转基因沉默
• 转基因沉默 转基因沉默(tmsgene silencing) ：
又称转基因失活 转基因失活，即当向生物体内导人外源基因时， 转基因失活 引起目的基因及其相应序列的同源内源基因的表达被 特异性抑制的一种基因调控现象。
DNA甲基化实验课件
b)
c)
2. DNA 甲基化的生物学意义
DNA甲基化与基因表达调控
基因启动区域内CpG位点的甲基化通过三种方式影响基因转录活性： DNA序列甲基化直接阻碍转录因子的结合； 甲基CpG结合蛋白结合到甲基化CpG位点与其他转录抑制因子相互作用； 染色质结构的凝集阻碍转录因子与其调控序列的结合；
3. DNA 甲基化的检测 -----重亚硫酸盐转化法 (Bisulfite conversion) 3.重亚硫酸盐转化 — DNA回收
6. 向吸附柱CB1中加入600 μl溶液DB，室温(15-25℃)放置15 min，12,000 rpm (~13,400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。 7. 向吸附柱CB1中加入600 μl漂洗液PW，12,000 rpm (~13,400×g)离心30-60 sec，倒掉 收集管中的废液。 8．重复操作步骤11。 9．将吸附柱CB1放入收集管中，12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min，尽量除去漂洗液。 将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的PCR实验。 10．取出吸附柱CB1，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20 μl洗脱 缓冲液EB，室温放置2 min。12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，收集DNA溶液。
2. DNA 甲基化的生物学意义
1. 2. 3. 4. 5.
DNA甲基化与遗传物质的稳定性 DNA甲基化与基因表达调控 DNA甲基化与表观遗传学 DNA甲基化与胚胎发育 DNA甲基化与肿瘤
2. DNA 甲基化的生物学意义
DNA甲基化与遗传物质的稳定性
DNA甲基化
DNA甲基化DNA甲基化通俗的说法就是在DNA上添加一个甲基基团。
甲基（methyl group），化学式为-CH₃（一横表示一个单电子），英文缩写-Me，由碳和氢元素组成。
DNA甲基化位于胞嘧啶的第五位碳原子上，可引起染色质结构和基因活性的改变，在基因印迹、X染色体失活、发育调控以及转座子沉默和基因组稳定性的维持等方面发挥重要作用。
基因印记其实就是甲基化，是指在合子形成的过程，使一个亲本的等位基因沉默，而没有被加上印记的亲本等位基因活跃。
具有这种差异的基因被称为印记基因。
其根源是同一基因在卵子和精子中具有不同程度的甲基化。
印记区域又被称为“差异甲基化区域”。
发生甲基化的胞嘧啶所在的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸（C）后面一般会连接鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸（G）也就是所谓的CpG双核苷酸。
中间的p是指两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸基团，因为脱氧核糖核苷酸是通过磷酸二酯键连接形成脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）的。
DNA甲基化有点像细胞的记忆，精卵细胞形成过程和结合形成受精卵时会抹去“前世”的记忆，具体而言，基因组两次大规模的去甲基化分别发生在卵子受精到着床前胚胎的早期发育过程中和原始生殖细胞发育的配子发生过程中，然后在发育过程中从头添加甲基化，涅槃重生。
类生殖细胞系（精子、卵细胞及原始生殖细胞）、囊胚以及着床后胚胎体细胞的DNA甲基化水平因此，整体而言，细胞的发育分化过程就是通过选择性添加甲基化来“封印”某些基因的转录表达活性，同时保留一些基因，从而实现全基因组20000多个基因的选择性表达。
基因的选择性表达正是体细胞差异的根本原因，特异性表达出来的基因对应的蛋白就是我们平时听到的marker分子。
正因如此，人体才能由一个细胞分化形成纷繁复杂的细胞组合体。
每种体细胞都有特定的蛋白分子，比如NESTIN（巢蛋白）能够特异性的表达在神经上皮干细胞上一种分子标记物，对神经元的分化有作用。
DNA 甲基化
• 2.在样品中寻找敏感性和特异性高的DNA甲 基化标志物以作为肺癌早期诊断的有力工 具。
• 3.深入研究DNA去甲基化机制，在癌前病变 患者血样中寻找较高特异性DNA甲基化位点 的同时探寻抑制此位点高度甲基化的方法。
DNA甲基化与肺癌的早期诊断
• DNA甲基化作为肺癌早期诊断的分 子标志物，其敏感性和特异性是研 究关注的焦点。
• 目前尚未发现敏感性和特异性非常 高的DNA甲基化标志物。
检测标本
• 1.血液中DNA甲基化的检测 外周血是肺癌早期筛查和诊断比较理想的 样本，肿瘤患者血液中存在肿瘤细胞释放 的高水平的循环DNA，并且与原发肿瘤有着 相同的基因改变。
• 去甲基化药物通过抑制DNMT的活性使复制 后的DNA不能再次甲基化，这就导致所有等 位基因表现为去甲基化，从而使抑癌基因 得以恢复表达、抑制肿瘤的生长，在细胞 生理学上的改变主要包括诱导细胞分化、 弱亡、衰老和免疫应答。
去甲基化药物机理示意图
EGCG on DNMT1 inhibition
DNA甲基化研究的展望
• DNA甲基化改变常发生于肿瘤形成过程，包 括全基因组水平DNA低甲基化和CpG岛高甲 基化。
• 抑癌基因的失活是肿瘤发生的重要分子基 础。
Tumor suppressor genes correlated with NSCLC
1. p16基因
• 位于人第9条染色体p21区，参与细胞周期 蛋白调控，通过与细胞周期蛋白依赖激酶 CDK4及CDK6结合而抑制后者活性，进而 抑制细胞增殖，是一种重要的抑癌基因。
• CDH13基因编码蛋白H-cadherin，起着抑癌
基因作用，启动子区CpG岛甲基化是Hcadherin失活的重要机制。
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提到遗传，我们都已经习惯于这样的概念，即基因组的编码信息存在于ACGT这四种碱基的排列顺序中。
然而，诸如胞嘧啶的甲基化修饰及其分布，组蛋白的乙酰化等，同样影响着表型。
这就构成了表观遗传学(epigenetics)的主要研究内容。
其实，早在1942年，C.H.Waddinton就提出了表观遗传学的概念，他指出，表观遗传与遗传相对，主要研究基因型和表型的关系。
而现在，对于表观遗传学，比较统一的认识是，其研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能的可逆的可遗传的改变。
也就是说，在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰等来调控基因表达，其中又以DNA甲基化(DNA methylation)最为常见，成为表观遗传学的重要组成部分。
随着人类基因组计划的开展，科学家们开始在基因组水平来研究表观遗传学，逐步形成表观基因组学(epigenomics)。
表观基因组学就是要在整个基因组水平来研究表观遗传过程以及与这些过程密切相关的特定基因组区域的识别与鉴定。
2000年10月，人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium)由欧盟赞助，启动了旨在于人类6号染色体MHC区域首先做出DNA的甲基化图谱的先导计划(Pilot Project)。
该计划顺利完成，引导启动了2003年的人类表观基因组计划(Human Epigenome Project，HEP)。
2005年，美国国家卫生院(NIH)下属的国立癌症研究所启动了癌症基因组先导计划。
2006年，该所与国立人类基因组研究所一起共同启动癌症基因组计划(Cancer Genome Project)。
表观基因组学和DNA甲基化与癌症的研究成为新的热点。
本文将简要介绍DNA甲基化与CpG岛，癌症与DNA甲基化，和DNA甲基化的重要检测方法。
DNA甲基化与CpG岛：在人类表观遗传学研究中，最常见的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。
其主要过程是，在CpG甲基化结合蛋白(Methyl-CpG Binding Proteins,MBDs) 和DNA 甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变成为5’甲基胞嘧啶。
在正常人类的DNA中，约有3-6%的胞嘧啶被甲基化。
在哺乳动物中，约有50,000,000个CpG二核苷酸，其中70%的被甲基化。
而那些可被甲基化的CpG 二核苷酸并非随机的分布于基因组序列中，相反，在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译区和第一个外显子区，CpG序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。
CpG岛的概念最早由Adrian Bird提出，他称之为未甲基化的HapII小片段(HpaII Tiny Fragment，HTF)，更正式的定义是这样的区域，该区域的序列长度至少200个碱基对，GC含量超过50%，CpG比值(观测值/期望值) 超过0.6。
CpG比值的计算方法如下：最近，为了排除那些Alu重复序列，提出了更严格的标准：长度至少500碱基对，GC含量超过55%，CpG比值大于0.65。
据估计，哺乳动物基因组中的CpG岛约有4万个。
在健康人的基因组中，CpG岛中的CpG位点一般处于非甲基化状态，而CpG岛外的CpG位点通常是被甲基化的。
研究表明，DNA的甲基化在遗传印记(genetic imprinting)，胚胎发育以及维持正常细胞功能等方面发挥着重要作用。
DNA甲基化与肿瘤发生： DNA甲基化水平和模式的改变是肿瘤发生的一个重要因素。
这些变化包括CpG岛局部的高甲基化和基因组DNA低甲基化状态。
如图1左所示，在正常细胞中，位于抑癌基因启动子区域的CpG岛处于低水平或未甲基化状态，此时抑癌基因处于正常的开放状态，抑癌基因不断表达抑制肿瘤的发生。
而在肿瘤细胞中，该区域的CpG岛被高度甲基化，染色质构象发生改变，抑癌基因的表达被关闭，从而导致细胞进入细胞周期，凋亡丧失，DNA修复缺陷，血管生成以及细胞粘附功能缺失等，最终导致肿瘤发生。
同样，如图1右所示，对于在正常细胞中处于高度甲基化的一些基因和重复序列，如果其甲基化水平降低，这些基因将表达和重复序列将激活，从而导致基因印记丢失，细胞过度增长，不合适的细胞特异性表达，基因组脆性增加，以及内寄生序列(endoparasitic sequence)的激活，最终也导致肿瘤发生。
图1. 肿瘤生成中的DNA甲基化改变模式 (取自Esteller M，Nat Rev Genet 2007, 8(4):286-298) 由于CpG岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测，而全基因组水平的低水平甲基化状态，则随着肿瘤恶性程度的增加而进一步降低，使其可用于肿瘤的诊断以及分级。
近年来，不断有研究显示人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关,而且早在肿瘤临床确诊之前就可检测出特异基因的甲基化异常现象。
所以甲基化可以作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。
DNA甲基化检测方法：随着DNA甲基化研究的不断深入，其检测方法也层出不穷。
这些方法针对不同研究目的，运用不同的处理方法，几乎涵盖了从基因到基因组各个层次水平的研究。
据检测样本不同，可以分为DNA和mRNA。
现有方法，绝大部分都是取样于细胞的DNA，根据研究水平，又将这些方法归为3大类，即：基因组甲基化水平(Methylation Content)的分析，候选基因甲基化分析，和基因组层次的DNA甲基化模式(Methylation pattern)与甲基化谱(Methylation Profiling)分析。
主要方法分述如下：A．基因组甲基化水平(Methylation Content)的分析:1. 高效液相色谱(High-performance Liquid Chromatography, HPLC) HPLC是一种比较传统的方法，是根据DNA或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。
由于在动态相和静态相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。
随着系统的压强的增加，其分辨率增高。
故而能够定量测定基因组整体水平DNA甲基化水平。
该方法由Kuo等1980 年首次报道。
过程是将DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5mC/(5mC+5C)的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。
这是一种检测DNA甲基化水平的标准方法。
2. 高效毛细管电泳法(High-performance Capillary Electrophoresis, HPCE)这是一种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物中分离不同化学组分的技术。
其基础是在强电场下不同分子的由于其所带电荷，大小，结构以及疏水性等不同而相互分开。
用HPCE方法处理DNA水解产物来确定5mC水平，简便，经济且敏感性高。
在这两种方法的基础上，不断有新方法改进，包括，变性高效液相色谱(DHPLC)，逆向高效液相色谱(Reversed phase HPLC)以及HPLC与薄层色谱(Thin-layer Chromatography, TLC)相结合的HPLC-TLC方法。
除上述方法外，还有其他原理的检测方法，如单纯的TLC方法以及最佳近邻TLC(Nearest neighbour TLC)，基于抗5mC的免疫学技术(Anit-5mC immunological techniques), SssI 甲基转移酶法(SssI methyl Acceptance Assay)，在重亚硫酸盐处理的基础上而进行的氯乙醛反应法(Chloacetaldehyde reaction)和酶区甲基化分析(Enzymatic Regional methylation Assay, ERMA)。
必须指出，以上各种方法虽然能够明确检测出目的序列中所有CpG位点的甲基化状况，但并不能对甲基化位点进行定位。
B．候选基因(Candidate Gene)甲基化分析:1. 甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法( methylation-sensitive restriction Endonuclease -PCR/Southern, MSRE-PCR/Southern)这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后，进行Southern或PCR扩增分离产物，明确甲基化状态再进行分析。
常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有HpaⅡ-MspⅠ(CCGG)和SmaⅠ-Xmal(CCCGGG)等。
2. 重亚硫酸盐测序法(Bisulphite Sequencing)该方法首先用重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后,对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化。
此方法是精确度很高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序,过程较为繁琐、昂贵。
3. 甲基化特异性的PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)该方法同样DNA先用重亚硫酸盐处理，随后行引物特异性的PCR。
其设计两对引物，分别与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即一对结合处理后的甲基化DNA链，另一对结合处理后的非甲基化DNA链。
检测MS-PCR扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；反之亦然。
4. 甲基化荧光法(MethyLight)结合重亚硫酸盐处理待测DNA片段，设计一个能与待测位点区互补的探针，探针的5’端连接报告荧光，3’端连接淬灭荧光，随后行实时定量PCR。
如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸时，TaqDNA聚合酶5′到3′端的外切酶活性会将探针序列上5′端的报告荧光切下，淬灭荧光不再能对报告荧光进行抑制，这样报告荧光发光，测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及水平。
本方法高效，迅速，具备可重复、所需样本量少、不需要电泳分离的特点。
5. 焦磷酸测序(Pyrosequencing)该方法，由4种酶催化同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就能将其加入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸(PPi)。
PPi 可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，其高度与核苷酸数目成正比。