PCR实验室存在问题及解决措施
PCR实验室污染与对策
PCR实验室污染与对策PCR（Polymerase Chain Reaction）实验室是进行核酸分析和生物学研究的重要场所。
然而，由于PCR实验室使用高灵敏度的技术，可能会受到外源性DNA污染的影响，导致结果的失真甚至错误。
因此，PCR实验室污染的问题需要引起重视，并采取相应的对策来减少对实验结果的影响。
外源性污染主要指的是在实验室环境中引入外部DNA污染源。
这些污染源可能包括实验室用具（如罗氏管、管盖、显微镜片等）、实验材料（如引物、模板DNA等）、工作人员（如手部皮肤上的DNA）以及空气中的微生物等。
为了减少外源性污染，可以采取以下对策：1.消毒和清洁实验室：实验室应定期进行彻底的清洁和消毒，包括工作台、工具和设备等。
使用消毒剂对工作台和设备进行彻底的消毒，防止污染源的交叉感染。
3.使用无DNA污染的试剂和材料：选用经过严格筛选和检测的PCR试剂和材料，确保其无DNA污染。
同时，使用专门为PCR实验设计和包装的罗氏管和管盖，减少外源性DNA污染的可能。
4.严格的实验室操作规范：建立和执行严格的实验室操作规范，包括实验室的通风设施、培训工作人员、制定标准操作流程等。
工作人员应按照规范操作，遵守实验室操作规程，确保实验的准确性和可靠性。
内源性污染是指实验过程中引入的内源性DNA污染。
内源性污染通常是由前一PCR扩增反应的产物污染了下一PCR反应。
1.严格控制实验操作的顺序：按照从低到高浓度的样品进行PCR扩增。
首先进行阴性对照，检测PCR反应体系中是否存在污染。
然后进行低浓度样品的扩增，最后进行高浓度样品的扩增，以减少内源性污染的可能。
2.应用反转录酶酶和RNA不是DNA模板：在RNA模板的PCR扩增反应中，可以使用反转录酶酶将RNA转录成cDNA。
由于RNA是DNA的模板，反转录过程不会引入外部DNA污染，从而减少内源性污染的可能。
3.使用消除污染酶：在每一PCR扩增反应中加入消除污染酶，可以在扩增反应结束后对DNA污染进行降解。
PCR核酸检测实验室自检自查整改报告
PCR核酸检测实验室自检自查整改报告一、整改背景我实验室负责进行PCR核酸检测工作，经过自检自查发现存在一些问题，不仅影响了工作效率，还可能对检测结果产生误差，为了保证检测结果的准确性和可靠性，我决定开展整改工作，并报告整改情况。
二、问题分析1.设备运行不稳定：实验室PCR仪器出现频繁故障，导致实验进度受阻，影响工作效率。
2.试剂保存不当：一部分试剂未按照要求储存，导致试剂失效或效果下降，影响了检测结果。
3.数据记录不完整：实验过程和结果记录不规范，缺乏关键信息的记录，影响了结果的追溯和分析。
4.实验室清洁和消毒不及时：仪器和试剂的清洁消毒不及时，可能造成交叉污染，影响结果的准确性。
三、整改措施1.设备运行不稳定问题的整改：（1）定期检查设备状态，及时发现问题并解决；（2）建立设备维护保养制度，确保设备运行稳定；（3）配备备用设备，确保实验进展不受阻。
2.试剂保存不当问题的整改：（1）制定试剂存储和使用规范，明确存储温度、有效期等要求；（2）建立试剂使用登记制度，及时更新试剂信息，避免使用失效试剂；（3）实行试剂定期盘点，清理不合格和失效试剂。
3.数据记录不完整问题的整改：（1）建立标准的实验记录表格，详细记录实验过程和结果；（2）明确记录项目、时间、操作人员等关键信息；（3）实行项目负责人审核制度，确保记录的准确性和可追溯性。
4.实验室清洁和消毒问题的整改：（1）制定实验室清洁消毒制度，明确清洁和消毒频率；（2）定期进行实验室清洁和消毒，清除交叉污染源；（3）培训实验人员正确进行仪器和试剂的清洁消毒。
四、整改效果评估经过整改措施的落实，以下是整改效果的评估：1.设备运行不稳定问题：设备故障率显著下降，实验工作进展顺利，工作效率明显提升。
2.试剂保存不当问题：试剂使用失效或下降的情况明显减少，检测结果更加可靠稳定。
3.数据记录不完整问题：实验记录规范化，关键信息完整记录，结果可追溯性明显增强。
4.实验室清洁和消毒问题：实验室清洁和消毒规范化，交叉污染风险得到控制。
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日进行检查，大于48h后带型不规则甚至消失。
但有时仍会与到这样那样的问题，影响检测结果的判断，具体归类为以下常见的4点，描述如下：问题一：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因：1、模板:含有抑制物，含量低2、Buffer对样品不合适3、引物设计不当或者发生降解4、反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策：1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2、更换Buffer或调整浓度3、重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4、降低退火温度、延长延伸时间问题二：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1、引物特异性差2、模板或引物浓度过高3、酶量过多4、Mg2+浓度偏高5、退火温度偏低6、循环次数过多对策：1、重新设计引物或者使用巢式PCR2、适当降低模板或引物浓度3、适当减少酶量4、降低镁离子浓度5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法6、减少循环次数问题三：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态原因：1、模板不纯2、Buffer不合适3、退火温度偏低4、酶量过多5、dNTP、Mg 2+浓度偏高6、循环次数过多对策：1、纯化模板2、更换Buffer3、适当提高退火温度4、适量用酶5、适当降低dNTP和镁离子的浓度6、减少循环次数问题四：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交叉污染对策：1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存[ 来源]：实验室之家，以及相关网络知识、转载仅为分享知识，如有侵权请联系删除。
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动物疫病PCR检测实验室的污染与对策
动物疫病PCR检测实验室的污染与对策摘要：PCR技术已经成为动物疾病检测的重要方法之一，然而，由于试剂、设备以及实验操作等因素的原因，PCR实验室中常常会存在污染现象，这会对PCR检测结果产生重大的影响。
本文主要介绍PCR实验室常见的污染问题及其对策，以期提高PCR检测的准确性和可靠性。
关键词：PCR；实验室；污染；对策一、PCR实验室常见的污染问题1.叉板污染。
在PCR实验的初级放大反应中，管盖内部会被热化，空气会从管盖缝隙中进入反应体系，从而引入外源DNA分子，使PCR反应体系中出现不必要的“叉板”污染。
2.辅助设备污染。
如离心机、手持式均质器、移液器、试剂瓶和移液器架等都会存在洁净度和污染问题。
特别是存在抗生素残留的试剂盒容易产生细菌污染，影响PCR检测结果。
3.PCR产物污染。
PCR产物污染主要是指PCR反应体系中存在外源DNA，如试剂、PCR产物以及PCR操作过程中的污染。
一旦外源DNA进入PCR反应体系中，会扰乱PCR放大反应，导致false positive或false negative结果。
因此，一般情况下，实验室流程分离是非常重要的。
1.建立完善的实验室管理制度。
要求从实验室建设、操作规程、用品消毒等方面入手，从细节把控污染源。
2.请专业的清洁事务公司进入实验室定期清洁和卫生消毒，保持实验室的清洁和洁净度。
3.实验过程中采用无菌技术。
如在采样、制备PCR反应混合液等步骤中要保证使用无菌物品，并在干燥灭菌下操作，百分百排除污染问题。
4.建立实验操作流程分离制度，将不同阶段的实验操作由不同工作人员完成，避免在同一实验室内同时进行制备源DNA和PCR反应等操作，降低交叉感染发生的可能性。
5.配置优质耗材。
实验用器具、管盖、移液器等耗材来源要可靠，使用前要经过充分的消毒，并且尽量使用纯净物品，避免使用重复已知污染的器具和耗材。
6.严格控制DNA扩增过程的负性对照，在PCR反应前和PCR反应后提取DNA进行扩增负性对照，诊断异常污染。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。
PCR实验室存在问题及解决措施
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临床应用基本规范和管理要求
➢ 以科研为目的的临床基因扩增检验项目，不得向临床出具检验报 告，不得向病人收取任何费用
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检测要求
➢ 项目：新开展检测项目应有相应临床科室出具的评估报告 ➢ 仪器：必须三证齐全 ➢ 试剂：必须SFDA批准 ➢ 新开展项目在技术审核前应进行方法学验证 ➢ 仪器、试剂、方法更新时应进行方法学验证
1、校准SOP中制定仪器校
2、部分仪器未定期校准
准参数、判断标准
2、实验室检测人员提出校
3、校准未覆盖检测常用量程（移液器、恒温金属浴） 准要求
4、校准报告不规范，缺原始记录
3、实验室审核校准报告
5、校准报告中校准数据错误未发现 6、校准不符合要求的设备仍在使用（移液器、高速
冷冻离心机） 7、未引用校准出现的校准因子（、温度计、恒温金
属浴） 8、内部校准存在问题：用于校准恒温金属浴的温度
计未校准；且最小刻度为1℃，不适用于金属浴 校准；内部比对（温度计）无记录或记录信息不
4、内部比对记录信息最少 应包括：比对设备编号、 用于比对设备的校准信息 （校准日期、校准有效期、 校准单位）、比对时间、 标准设备实测数据、比对 设备实测数据、判断标准、 结论、比对人、比对日期、 科室负责人
究和使用情况的检索报告及技术资料
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PCR审核
流程（初审、
复审、扩项、 新技术）
医疗机构提出技术审核申请 申请资料审查
受理、登记、编号 发出《技术审核受理通知书》
文件内容审查 确定审核专家组成员 书面通知专家、医疗机构 组织专家现场审核 汇总专家组审核意见 医疗机构就专家意见整改 完成技术审核结论报告
PCR检测常见问题与解决途径
PCR检测常见问题与解决途径PCR 检测常见问题与解决途径利用 PCR 方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。
尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。
为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR 检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。
一个好的PCR 方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。
本文对 PCR 检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。
一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
（二）造成假阳性的原因1.样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2.PCR 试剂的污染：主要是由于在 PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染。
3. PCR 扩增产物污染：这是 PCR 贝量大 (一般为 1013 拷贝 /ml)，远远高于物污染，就可形成假阳性。
反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCRPCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的产物拷PCR 产4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
5.实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策PCR常见问题分析及对策(⽆扩增产物、⾮特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：⽆扩增产物现象：正对照有条带，⽽样品则⽆原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发⽣降解4.反应条件：退⽕温度太⾼，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使⽤试剂盒提取模板DNA或加⼤模板的⽤量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间⼆聚体和链内⼆级结构）或者换⼀管新引物4.降低退⽕温度、延长延伸时间问题2：⾮特异性扩增现象：条带与预计的⼤⼩不⼀致或者⾮特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过⾼3.酶量过多4.Mg2+浓度偏⾼5.退⽕温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使⽤巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离⼦浓度5.适当提⾼退⽕温度或使⽤⼆阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退⽕温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏⾼6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提⾼退⽕温度4.适量⽤酶5.适当降低dNTP和镁离⼦的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空⽩对照出现⽬的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应⼩⼼轻柔，防⽌将靶序列吸⼊加样枪内或溅出离⼼管外；2.除酶及不能耐⾼温的物质外，所有试剂或器材均应⾼压消毒。
所⽤离⼼管及加样枪头等均应⼀次性使⽤。
3.各种试剂最好先进⾏分装，然后低温贮存琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物⼀．原理DNA⽚断的分离与回收是基因⼯程操作中的⼀项重要技术，例如可收集特定酶切⽚断⽤于克隆或制备探针，回收PCR产物⽤于再次鉴定等。
回收实验中两个最重要的技术指标是纯度和回收率：前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；后者不理想时往往会⼤⼤增加前期的⼯作量。
PCR实验中常见问题解决方法
QuikStrip 已变干。
加入 40 μL 水，在装载前轻轻上下移液以混合均匀。
3.电泳凝胶上看不到条带、对照 DNA 和PCR 产物
凝胶未正确制备。
确保正确稀释电泳缓冲液。
融化琼脂糖时需要特别注意较高浓度 (>0.8%) 的凝胶。在倒入凝胶之前，确保溶液 没有“团块 ”和玻璃状颗粒，也可以直接使用配置好的预制胶。省时省力。
凝胶未正确染色。
染色时注意浓度，实在不行就重新染色。
电泳装置或电源出现故障。
请联系电泳仪或电泳设备供应商，帮忙排除故障
4.凝胶染色后，DNA 条带模糊。
凝胶没有染色足够长的时间。
严格按照染色流程说明进行实验操作。
5.染色后，条带可见，但不存在 PCR 产物。
PCR扩增不成功。
注意引物设计是否合理，DNA聚合酶的加入量是否适宜。
PCR实验中常见问题解决方法
PCR实验中常见问题及解决方案
PCR实验中常见问题汇总
问题，管中的液体较少。
样品挥发，损失
确保加热的盖子达到适当的温度。
吸取样本后，尽快盖上PCR 管的盖子。防止挥发。
移液不准确
确保吸取 20 µL 引物混合物和 5 µl Lambda DNA 模板到 PCR 管中。样本量少时需要采用高精度移液器。
确保PCR的正确操作，温度设计是否合理。
6.染色后，凝胶上可见条带和对照 PCR 产物，其中一部分样品不存在。
PCR 反应中添加了错误体积的 DNA 和引物。
熟练使用移液器进行精准移液定量，确保移液的准确度
pcr技术审核中存在的问题和解决措施方案
反应条件不一致
总结词
反应条件不一致是PCR实验中常见的 问题之一，可能影响实验的重复性和 准确性。
详细描述
反应条件不一致包括但不限于：反应 体系不均一、反应温度不合适、循环 参数不一致等。这些问题会导致PCR 反应不均一，或者产生非特异性扩增 ，从而影响实验结果。
实验操作不规范解
02
决措施
规范实验操作流程
纯化模板
采用合适的纯化方法，如亲和色谱、离子交 换等，对模板进行纯化，以提高其质量和浓 度，减少非特异性扩增等问题的发生。
反应条件不一致解
05
决措施
建立反应条件标准化流程
确保PCR反应体系的一致性
确保每个PCR反应中使用的模板DNA、引物、酶等关键组件的浓度和质量相同，以确保 反应条件的一致性。
些标准。
对标准化操作规范的执行情况进 行监督和检查，以确保其实施效
果。
引物设计不合理解
03
决措施
建立引物设计标准流程
确保引物设计的科学性和合理性，建 立标准流程，包括引物设计的基本原 则、软件选择、参数设置、实验验证 等环节，确保每个步骤都得到规范执 行。
VS
针对不同实验需求，制定个性化的引 物设计方案，以适应不同的样本类型 、检测目标等实际情况。
制定标准的PCR实验操作流程 ，包括实验前的准备、实验操 作步骤和实验后处理等。
对实验操作流程进行详细说明 ，包括实验操作的细节和注意 事项，以确保实验结果的准确 性和可靠性。
对实验操作流程进行监督和检 查，确保实验操作严格按照规 定执行。
加强实验操作培训
01
对实验人员进行PCR技术的全面培训，包括理论知识和实践操 作，确保实验人员具备必要的技能和知识。
pcr实验室整体解决方案及措施
pcr实验室整体解决方案及措施一、PCR实验室的布局。
1.1 功能分区的重要性。
PCR实验室啊，就像一个精密的小世界，功能分区那可是相当重要的。
它得有试剂准备区，这就好比是厨房的食材准备区，得干干净净、整整齐齐的。
在这里，我们要准备好各种试剂，容不得一点马虎。
要是这里乱了套，就像做饭没有好食材一样，后面的实验肯定会出问题。
1.2 样本制备区的讲究。
样本制备区呢，这可是关键中的关键。
这就像厨师切菜、处理食材的地方。
在这个区域，要小心地处理样本，避免样本之间的交叉污染。
这就如同做菜的时候，不能把不同的菜弄混了，不然做出来的菜就不是那个味儿了，实验结果也会变得乱七八糟。
1.3 扩增区和检测区的要求。
扩增区和检测区也是各有各的门道。
扩增区像是一个魔法区域，把样本中的微量核酸进行大量扩增，就像把一颗小种子培育成一片大森林。
检测区呢，就是要精准地判断这些扩增后的产物，要做到火眼金睛，不能有丝毫差错，就像孙悟空识别妖怪一样。
二、设备的选择与维护。
2.1 主要设备的挑选。
PCR实验室的设备挑选可不能含糊。
像PCR仪，这就是实验室的“顶梁柱”，得选质量好、性能稳定的。
这就好比打仗要选好武器一样，好的PCR仪能让实验事半功倍。
还有离心机，那得是转速精准、运行平稳的，不然样本离心不好，后续的实验就没法好好进行，这就叫“一着不慎，满盘皆输”。
2.2 设备维护的要点。
设备维护更是重中之重。
要像照顾自己的孩子一样照顾这些设备。
定期清洁、校准是必不可少的。
要是忽略了设备维护，设备就会像生病的人一样，工作起来没精打采，给出的实验结果也不可靠。
这就如同开一辆没有保养的汽车，随时可能抛锚。
三、人员管理与操作规范。
3.1 人员培训的必要性。
人员管理首先得从培训开始。
实验室的人员就像一群战士，没有经过训练怎么能上战场呢？培训要全面，从理论知识到实际操作，都得让大家熟练掌握。
只有这样，在实验室里才能做到游刃有余，而不是像没头的苍蝇一样到处乱撞。
PCR实验室污染的原因分析、处理及整改措施
PCR实验室污染的原因分析、处理及整改措施2022年5月29日中午12:30开始PCR实验室假阳性频率增高,考虑可能出现实验室污染，检测工作立即停止，首先，查找污染源和明确污染范围。
经排查本次实验室污染的主要来源可能是部分配置好的反应体系放置时间过久、实验室二区出现扩增产物的污染。
一、发生污染的原因分析。
1.核酸检测工作频次过高，导致每批样本检测之间没有足够时间消毒。
2、核酸检测人员短缺，检测人员需要多次往返二区、三区，极容易导致扩增产物的污染。
二、实验室污染的处理：1.生物安全柜的操作台消毒处理：使用5000mg∕L含氯消毒剂进行喷洒消毒。
消毒液需要现用现配，24小时内使用。
2.实验室台面、地面、物体表面等的消毒处理：立即使用润湿有5000mg∕L含氯消毒剂的毛巾擦拭、消毒。
清洁、消毒通风系统滤网。
采用房间固定和可移动紫外灯进行紫外照射2小时以上。
3.清理污染物时：严格遵循活病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。
整改措施：1.严格实验室功能分区确保实验室人、物及空气单向流动核酸检测实验室的人、物及空气流向按照试剂储存和准备区一样本制备区T扩增和产物分析区，防止扩增产物随人流、物流及空气进入扩增前的区域。
空气流向应按照从试剂储存和准备区一样本制备区一扩增区一扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。
2、力口强实验室检测安全管理(1)基本要求核酸检测应当在生物安全二级实验室进行，并应在生物安全风险评估的基础上，采取适当的个体防护措施，包括手套、口罩和隔离衣等。
开展新冠病毒核酸检测的实验室应当制定实验室生物安全相关程序文件及实验室生物安全操作失误或意外的处理操作程序，并有记录。
(2)实验室前安全要求应使用2000mg∕L含氯消毒剂或75%酒精进行桌面、台面及地面消毒。
消毒液需每天新鲜配制，不超过24小时。
转运至实验室的标本转运桶应在生物安全柜内开启。
转运桶开启后，使用2000mg∕L含氯消毒剂或75%酒精对转运桶内壁和标本采集密封袋进行喷洒消毒。
PCR常见问题及解决方案
一、普通PCR常见问题及解决对策PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。
1. 假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
1.1 模板①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
1.2 酶失活需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
1.3 引物引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
1.4 Mg2+浓度Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
1.5 反应体积的改变通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
pcr-技术审核中存在的问题及解决措施
为确保实时PCR设备的准确性和可靠性，应对设备进行定 期维护和校准，同时应选择经过认证的试剂和仪器品牌。
要点二
实时PCR技术应用不当
为避免实时PCR技术应用不当导致的误差和异常情况，应 进行技术培训和质量控制，提高实验人员的技能水平。同 时应建立完善的技术标准和操作流程，以确保实验结果的 准确性和可靠性。
• PCR（聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，可用于快速、灵敏地检测特定DNA序列 的存在。PCR技术审核是指对使用PCR技术进行的检测实验进行全面的评估和审核，以确保实验的准确性和可靠性。
pcr-技术审核重要性
• PCR技术广泛应用于医学、生物学、农业等领域，其准确性和 可靠性对于实验结果的质量和可靠性具有至关重要的影响。因 此，对PCR实验进行技术审核是十分必要的。通过对实验的审 核，可以及时发现并纠正实验中存在的问题，提高实验的准确 性和可靠性，避免因实验失误而导致的误诊或误判。
02
pcr-技术审核中存在的问题
样品污染
实验室环境或试剂被污染
实验室环境或试剂被污染，可能导致扩增产物中检测到非目标序列，影响结果 准确性。
样品间交叉污染
不同样品之间存在交叉污染，导致扩增产物中出现非目标序列，影响结果判断 。
假阳性/阴性结果
假阳性结果
由于引物特异性不高或存在非特异性扩增，导致扩增产物中 检测到非目标序列，呈现假阳性结果。
详细描述
高通量pcr技术采用了先进的仪器设备，能够同时对多个 样本进行pcr扩增和检测，大大缩短了检测时间，提高了 检测效率。此外，高通量pcr技术还能够对多个基因位点 进行同时检测，提高了检测的准确性和灵敏度。
临床PCR实验室常见问题及整改措施
上海市临床检验中心
管理依据
审核依据《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发 [2010]194号）、《上海市临床基因扩增检验及相关分子诊断技术评估办 法》
现场督察依据《上海市医疗机构临床实验室质量管理基本内容和要求》 （附录E）《上海市医院临床检验专业质控督察表（分子生物学专业）》
断标准、结论、比对人、比对日期、
科室负责人。
46
用于比对的温度计量程不合适！
47
仪器编号？人员？标准？
48
P100
记
录
不
原始记录比对点为 1 μl ，5 μl ，10μl
真 实
！
49
用于比对的温度计在比对-20℃时应该引入校准因子！
基于组织的 分子病理项 目其病理切 片和前处理 在独立区域
2.冰箱温度非检测日不 记录
3.冰箱温度计缺或坏， 仍在记录
完成
不同工作区域内物品混
用（移液器、手套、记
录未按要求分区放置）
1.各区设施满足使用需求 2.安装独立空调；规定温 湿度允许范围。
1.根据试剂说明书要求规 定试剂储存要求， 2.每日实施监控并有记录
0.6
0.2
300
1.5
1.0
10000
0.6
0.2
JJG646-2006检定规程有允许范围的要求，应写入SOP！
37
仪器校准2-外部校准
督察内容
检查方法 存在问题
整改措施
定期对扩增仪、杂 检查仪器 交仪、生物安全柜、 校准检定 高速冷冻离心机、 /校准、 恒温金属浴、移液 比对报告 器、温度计、温湿 度计进行校准或检 定，开展分子病理 项目需定期对切片 机、捞片水浴槽进 行校准。有合格的 校准或检定报告。
PCR常见问题及解决方案
PCR常见问题及解决方案问题可能原因解决方法无产物或产量低模板浓度偏低或偏高电泳检测模板浓度,调整模板用量模板降解重新制备;基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存模板中含有抑制反应的杂质纯化模板引物浓度不足调整引物浓度,特别是针对长片段PCR引物存在二级结构重新设计引物,避免二级结构;优化退火温度引物降解引物应高浓度小量分装,-20℃保存,避免反复冻融Mg2+浓度偏低适当提高Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度dNTP降解-20℃保存,小量分装,避免反复冻融酶纯度低,扩增效率差选用高质量DNA聚合酶酶量不足适当增加酶量用酶不当针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)缓冲液失效更换缓冲液或使用预混PCR反应体系模板变性不充分适当延长变性时间;对高GC或复杂结构模板,提高起始变性温度至98℃退火温度偏高降低退火温度,应比引物Tm低至少5℃ 延伸时间不足增加延伸时间,特别是针对长片段PCR 循环数目不够增加循环数PCR管污染质量可靠的PCR管通常不需灭菌,否则应先高温高压灭菌处理;用过的PCR管不可清洗后重复使用PCR仪故障检查程序和模块温度其他使用PCR增强剂非特异产物过多,引物二聚体拖尾严重体系污染设计对照实验寻找污染源,操作时应注意避免交叉污染引物浓度过高适当减少引物浓度引物序列特异性差重新设计引物Mg2+浓度过高降低Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度dNTP浓度过高降低dNTP浓度酶量过多减少酶量,以0.5 U间隔递减退火温度过低提高退火温度延伸时间过短增加延伸时间,以1 min间隔递增循环次数过多减少循环次数模板结构过于复杂或目标片段过长特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南);使用PCR增强剂其他HotStart PCRTouchDown PCR巢式PCR引物3’末端存在互补序列重新设计引物引物浓度过高降低引物浓度模板浓度过低提高模板浓度退火温度不合适优化退火温度循环次数过多减少循环次数其他HotStart PCR引物浓度过高调整引物浓度引物序列特异性差或模板上存在同源序列重新设计引物模板降解重新制备模板模板浓度过高降低模板浓度dNTP浓度过高减少dNTP用量Mg2+浓度过高降低Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度酶量过多或质量差减少酶量,以0.5 U间隔递减;更换质量可靠的酶变性温度过低提高变性温度,以0.5℃递增退火温度过低提高退火温度延伸时间过长缩短延伸时间循环次数过多减少循环次数,以2个循环间隔递减体系污染设计对照实验,消除污染源其他HotStart PCR TouchDown PCR 巢式PCR假阳性目标片段与非特异扩增片段间存在同源性设计阴性对照,确认为引物问题后重新设计引物体系污染设计阴性对照判断是否有污染,去除污染源。
PCR实验室防污染措施及应急处理方法
PCR实验室防污染措施及应急处理方法一、PCR实验室的污染来源1、样本间交叉污染：收集样本的容器被污染或样本密封不严外溢；不同样本移液时忘记更换枪尖或未使用带滤芯枪尖；移液器等实验器具及耗材未及时消毒灭菌；不同样本同时开盖或样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散，相互交叉污染。
2、实验试剂污染：主要是在PCR 组分试剂加样过程中，由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。
加样过程中，因为 PCR 试剂对温度十分敏感，需要通过冰浴使得 PCR 试剂和 PCR 板/管处于 0℃，但这个过程也是充满了污染的风险的。
3、扩增产物污染：大量拷贝的产物泄漏或扩增后的PCR反应管意外开盖，这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题。
因为 PCR 产物拷贝量大，远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的 PCR 产物污染，就可形成假阳性。
4、克隆质粒污染：作为阳性质控品的克隆质粒外溢。
二、PCR实验室的防污染方法按照实验室的安全工作制度或安全标准操作程序，所有操作符合《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。
1、严格执行各区功能划分：试剂储存和准备区：贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。
标本制备区：核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管。
对于涉及临床样本的操作，应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。
扩增区：cDNA合成、DNA扩增及检测。
扩增产物分析区：扩增片段的进一步分析测定，如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。
试剂准备区、样本制备区和扩增区内的实验用品，包括移液器等器具应专用，空气、物品流向依次为：试剂准备区、样本制备区、扩增区、产物分析区，不可逆行。
2、清洁的实验用品：实验室自配试剂（去离子水、缓冲液等）和所有使用器具在使用之前均应高压灭菌或紫外杀菌。
枪尖、反应管等实验耗材应一次性使用。
PCR实验室常见问题及经验分享
PCR实验室常见问题及经验分享一、没有ct值二、ct值过晚三、阴性对照扩增有信号四、标准曲线不佳五、熔解曲线峰不特异六、扩增曲线异常七、扩增效率低聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
一、没有ct值检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。
一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;3、引物或探针降解。
可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可),对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。
二、ct值过晚在相对定量中,Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中,对低拷贝数的样品,Ct值会增大,但是一般不宜超过40循环,否则定量不准确。
因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况,需要根据具体实验设计和目的进行。
1、扩增效率低。
引物之间或者引物和探针的比例不合适,需要进行优化;引物或探针设计不合理,需要重新设计;2、PCR程序不合适,改用三步法进行反应,或者优化退火/延伸温度,可以适当降低退火温度;退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。
PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;4、PCR产物太长。
PCR产物设计超过500bp;5、模板存在抑制物。
用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
PCR实验室工作人员通道入口不严整改措施
PCR实验室工作人员通道入口不严整改措施一、引言PCR实验室是进行基因扩增和检测的重要场所，涉及到生物安全和实验室安全问题。
近期，我们发现在PCR实验室工作人员通道入口存在一定的安全隐患，为了确保实验室的正常运行和工作人员的人身安全，我们需要对入口通道进行严格的整改。
二、整改目的1. 防止外部污染物进入实验室，减少交叉污染的风险。
2. 确保实验室内部空气质量，避免空气传播的病原体对实验室工作人员的侵害。
3. 提高实验室生物安全和实验室安全水平，符合国家和地方的法规要求。
三、整改措施1. 设立专门的入口通道：在PCR实验室的入口处设立专门的通道，与实验室内部区域进行明确划分。
通道内设置更鞋区、更衣室、洗手区等设施，确保实验室内部与外部的隔离。
2. 严格控制人员出入：仅允许经过专业培训和考核合格的实验室工作人员进入，严禁无关人员随意进入实验室。
工作人员进入实验室时，需穿戴相应的防护用品，如防护服、口罩、手套等。
3. 设立生物安全柜：在实验室内部设立生物安全柜，确保实验室内部生物安全。
生物安全柜的使用应严格按照操作规程进行，避免实验操作过程中产生的气溶胶对实验室环境的污染。
4. 加强通风设施：PCR实验室应配备完善的通风设施，如排风系统、空气净化器等，确保实验室内部空气质量。
排风系统应定期进行维护和检测，确保其正常运行。
5. 定期消毒和清洁：对实验室内部和入口通道进行定期消毒和清洁，减少病原体在实验室内的存活和传播。
使用符合国家标准的消毒剂，按照规定的浓度和时间进行消毒。
6. 设立应急处理设施：在实验室入口处设立应急处理设施，如紧急洗眼器、消毒液等，以便在发生意外时能够及时处理。
同时，定期对实验室工作人员进行应急处理培训，提高其应对突发事件的能力。
7. 建立完善的实验室管理制度：建立完善的实验室管理制度，明确实验室工作人员的职责和操作规程。
加强对实验室工作人员的培训和管理，确保其能够熟练掌握实验室操作技能和安全知识。
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上海市第二类医疗技术目录
首批（18项）（ 2009.8.24 ）
第二批（6项）（2012.1.4）
冠心病介入诊疗技术
体外冲击波碎石/经输尿管镜碎石取石术
先天性心脏病介入诊疗技术
人工椎间盘置换术
心脏导管消融技术
经尿道前列腺汽化消融术
起搏器介入诊疗技术
内科胸腔镜诊疗技术
心室辅助装置植入技术
急性脑梗死溶栓术
送达医疗机构
补充资料
不报告 现场确认整改效果
报卫生行政部门
15
审核结果
➢ 合格 ➢ 基本合格 ➢ 不合格，12个月后重新申请
16
不合格重新申请时间依据
PCR实验室存在问题及解决措施
1
回顾
➢ 1990年：PCR 技术在国内开始用于临床检测 ➢ 90年代中期：假阳性？（假阴性？） ➢ 《关于暂停临床基因扩增检验的通知》（卫医政发[1998]第9号） ➢ 《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号） ➢ 《医疗技术临床应用管理办法》的通知（卫医政〔2009〕18号） ➢ 《临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发[2010]194
▪ 项目负责人基本情况
▪ 学科人员基本情况
▪ 项目所在地实验室的专用设备、设施及工作基础
▪ 拟开展检验项目
开展该技术的目的、意义和实施方案
该项医疗技术的基本概况
▪ 技术路线
▪ 国内外应用情况
▪ 与同种疾病的其他检测技术的特点及费用比较
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技术审核需递交的材料
➢ 医疗机构执业许可证副本复印件 ➢ 技术人员相关资格证书复印件 ➢ 与该技术有关的实验室平面图 ➢ 医疗机构医学伦理审查报告 ➢ 仪器、试剂三证复印件 ➢ 方法学性能验证报告 ➢ 室间质评成绩 ➢ 质量手册、程序文件、操作规程 ➢ 申请在本市首次开展的医疗技术还需递交：国内外有关该技术研
同种器官移植、变性手术、心室辅助装置应用技术、 基因芯片诊断技术（2011年5.3日由三类调整为二类）等共19项
5
沪临检办〔2011〕29号
关于印发《上海市医疗机构临床基因扩增检验技术审核办法》和 《上海市医疗机构基因芯片诊断技术审核办法》的通知
附件1：《临床基因扩增检验及分子诊断相关技术审核专家库名单》 附件2：《上海市医疗机构临床基因扩增检验技术审核办法》 附件3：《上海市医疗机构基因芯片技术诊断审核办法》 附件4: 《上海市医疗技术临床应用能力技术审核申请书》 附件5：《上海市临床基因扩增检验及分子诊断相关技术审核流程》
（首页医疗技术准入专栏中下载 ）
6
基本要求
上海市医疗机构临床基因扩增检验技术审核办法
（1）医疗机构基本要求
（2）人员基本要求
（3）临床应用基本规范和管理要求
（4）实验室设置基本要求 （5）人员管理
（7）标本管理
（8）质量管理
（6）设备管理 （9）检测要求等
上海市医疗机构基因芯片诊断技术审核办法
究和使用情况的检索报告及技术资料
14
PCR审核
流程（初审、
复审、扩项、 新技术）
医疗机构提出技术审核申请 申请资料审查
受理、登记、编号 发出《技术审核受理通知书》
文件内容审查 确定审核专家组成员 书面通知专家、医疗机构 组织专家现场审核 汇总专家组审核意见 医疗机构就专家意见整改 完成技术审核结论报告
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分包
➢ 有外送检验项目的实验室应与委托实验室签订相关协议，有委托实验室 资质和质量保证的证明文件
➢ 实验室有外送检验项目的要求和规定，并做好外送样品的登记和记录， 有委托实验室标本运送和交接过程的监控和记录
➢ 定期评审委托实验室检测质量，并有相关记录
➢ 分包后自行开展，需确认具备开展相关检测的能力
7
医疗机构要求
➢ 二级及以上医院 ➢ 独立实验室 （公司） ➢ 实验室应集中设置、统一管理 ➢ 实验室必须通过上海市临床检验中心技术审核合格并报上海市卫生监督所备案后方
可开展检测项目，以后每3年必须进行复审
➢ 实验室通过审核后应根据其核定的技术审核项目开展检测工作。如需要增加检测项 目，应向上海市临床检验中心提出扩项申请，并报上海市卫生监督所准入后方可开 展检测项目
➢ 实验室开展分子诊断新技术，应向上海市临床检验中心提出新技术申请，并报上海 市卫生监督所准入后方可开展新技术的检测项目
8
临床应用基本规范和管理要求
➢ 以科研为目的的临床基因扩增检验项目，不得向临床出具检验报 告，不得向病人收取任何费用
9
检测要求
➢ 项目：新开展检测项目应有相应临床科室出具的评估报告 ➢ 仪器：必须三证齐全 ➢ 试剂：必须SFDA批准 ➢ 新开展项目在技术审核前应进行方法学验证 ➢ 仪器、试剂、方法更新时应进行方法学验证
号）
2
医疗技术临床应用管理办法
（分类分级管理、审核）
➢ 第一类：安全性、有效性确切，医疗机构通过常规管理在临床应用中能确保其 安全性、有效性的技术—医疗机构自行组织实施
➢ 第二类：安全性、有效性确切，涉及一定伦理问题或者风险较高，卫生行政部 门应当加以控制管理的医疗技术—省级卫生行政部门指定或者组建的技术机 构负责技术审核
➢ 第三类：具有下列情形之一，需要卫生行政部门加以严格控制管理的医疗技术—卫生 部或卫生部委托省级卫生行政组织负责对指定的第三类医疗技术进行审核
（一）涉及重大伦理问题 （二）高风险 （三）安全性、有效性尚需经规范的临床试验研究进一步验证 （四）需要使用稀缺资源 （五）卫生部规定的其他需要特殊管理的医疗技术
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审核前准备工作
➢ 实验室按要求设置、装修 ➢ 仪器、人员到位 ➢ 完成质量手册、程序文件、操作规程编写 ➢ 完成方法学验证 ➢ 参加至少一次室间质评，成绩合格 ➢ 检验前、中、后流程畅通
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申请技术审核需递交的材料
➢ 《上海市临床技术临床应用能力技术审核申请书》
医疗机构基本情况
申请单位相关学科基本情况
扩大全胰腺切除术
直肠癌根治术
内镜逆行胰胆管造影诊疗技术
髋、膝关节置换技术
角膜移植技术
白内障超声乳化技术
准分子激光角膜屈光手术
口腔种植诊疗技术
输尿管镜技术
面部轮廓整形技术
血液透析技术
临床基因扩增检验技术
医用高压氧治疗技术
本市首次开展（未纳入卫生部规定的第三类医疗技术目录）
4
的医疗技术
卫生部公布第三类医疗技术目录