氨基酸分析方法通则

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备注

2.氨基酸分析方法通则的摘要

本方法适用于异硫氰酸苯酯柱前衍生法定性、定量测定样品中水解氨基酸、游离氨基酸以及不常见的氨基酸。

2 定义

2.1 氨基酸 Amino acid

分子内含氨基(亚氨基)和羧基的有机物化合物的总称。根据氨基(亚氨基)与羧基相对位置的不同，分为α-，β-，γ-，δ-，ω-氨基酸。α-氨基酸是组成蛋白质的基本单位。常规的氨基酸分析主要指蛋白质水解氨基酸，游离氨基酸的分离测定。

2.2 柱前衍生 Pre-column derivatization

为了提高氨基酸分析的检测灵敏度和分离选择特性，通常采用使氨基酸衍生化的方法。柱前衍生法，即样品在用分析柱分离前进行衍生化反应，然后经色谱柱对衍生物进行分离。

2.3 梯度洗脱 Gradient elution

间断地或连续地改变流动相组成或其它操作条件，从而改变色谱洗脱能力的过程。 2.4 基线Baseline

在正常操作条件下，仅有流动相通过检测器系统时所产生的响应信号曲线。基线反映仪器的噪音随时间的变化。

2.5 色谱峰 Chromatographic peak

色谱柱流出组分通过检测系统时，所产生的响应信号对时间作图所得的曲线，曲线的突起部分称为色谱峰。

2.6 峰面积 Peak area

色谱峰所包括的面积。

2.7 保留时间 Retention time

从进样开始到某个组分的色谱峰出现，最大值的时间间隔称为该组分的保留时间，用t R 表示。

2.8 标准样品Standard sample

作为定性及定量鉴定用的纯物质。PICO-TAG TM氨基酸分析使用的是美国PIERCE生产的按一定比例混合配制而成的17种水解氨基酸标准液和38种游离氨基酸标准液。

2.9 标准校正曲线 Standard sample calibration curve

用标准样品配制的一系列不同浓度的标准液上机测试后，经计算绘制的作定量分析的标准曲线。

3 方法原理

采用异硫氰酸苯酯 (PITC) 作为柱前衍生剂。PITC 与氨基酸分子中的氨基(亚氨基)发生定量的衍生化反应，产生苯基硫代氨甲酰-氨基酸 (PTC-AA)。过量的PITC通过真空干燥除去。

衍生产物苯基硫代氨甲酰-氨基酸(PTC-AA)的混合物在色谱柱中随流动相作相对移动时，混合氨基酸衍生物在两相间进行反复多次的分配。因两相间分配系数不同，使混合组分达到分离。

由于PITC试剂与氨基酸发生衍生化反应生成PTC-AA，在氨基酸的结构上引入了苯环，

使氨基酸的极性降低而有利于反相色谱分离。苯环的引入同时也使紫外检测器能够高灵敏度地定量检测PTC-AA。PTC-AA结构稳定可在室温下放置数小时或冰箱内放置一周不变质。

以标准混合氨基酸的PITC衍生物PTC-AA绘制标准工作曲线，即可对待测试样中的PTC-AA进行定量分析。

4 试剂和材料

所用试剂除已注明外，均需色谱纯或优级纯(相对比例按质量比)。

4.1 水解氨基酸(HAA)测定试剂

4.1.1 流动相

A液：19.0g NaAc.3H2O，0.5ml三乙胺和200μl 0.0％EDTA溶于1000ml超纯水中，用冰醋酸水溶液调pH至6.40后用0.45μ的滤膜过滤。分别取940ml此液与60ml乙腈混合，在真空下超声波脱气20s后，充氮备用。

B液：分别量取600ml乙腈，400ml超纯水和200μl 0.0％EDTA混合后，在真空下超声波脱气20s后备用。

4.1.2 样品水解液：1g苯酚溶解于6mol/L HCl 100ml中或直接加200μl 6mol/L HCl及0.5mg 苯酚(结晶状)于空样品管中备用。

4.1.3 再干燥试剂：乙醇∶水∶三乙胺＝2∶2∶1

4.1.4 衍生试剂：异硫氰酸苯酯∶乙醇∶三乙胺∶水＝1∶7∶1∶1

4.1.5 样品稀释液：取710mg Na2HPO4加超净水溶至1000ml〔用10％磷酸∶乙腈(95∶5)磷酸乙腈液调pH＝7.40备用〕。

4.2 游离氨基酸(FAA)测定试剂

4.2.1 流动相

A液：称取9.54g NaAc·3H2O(或5.75g NaAc)加1000ml超纯水，搅拌至完全溶解(用10％乙酸调pH值至6.50±0.02)。用0.45μ的滤膜过滤。分别取25ml乙腈、250μl 10m mol/L EDTA 和975ml上述配制的溶液充分混合后在真空下超声波脱气20s。

B液：分别取450ml乙腈、150ml甲醇和400ml超纯水，混合均匀，并在真空下超声波脱气30s后备用。

4.2.2 再干燥试剂：甲醇∶1.0mol/L醋酸钠∶三乙胺＝2∶2∶1

4.2.3 衍生试剂：异硫氰酸苯酯∶甲醇∶三乙胺∶水＝1∶7∶1∶1

4.3 不常见氨基酸的测定应根据其结构特点配制不同流动相及试剂进行分析。

5 仪器

5.1 仪器性能必须满足检定规程的要求

5.2.1 装置结构连接图，如图2所示。

A泵水解衍生工作台

进样器色谱柱检测器 B泵温度控制器

色谱工作站

图2 氨基酸分析仪连接