第十七章基因重组与基因工程_PPT幻灯片

细胞类型： 原核细胞 真核细胞
大肠杆菌 链球菌 枯草杆菌 酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞
四 筛选和鉴定重组DNA
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
1. 平板筛选 插入失活
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
无菌落
筛选重组子
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
大 2、一个复制起点，具氨苄青霉素抗性（ampR)和
四环素抗性基因(tetR) 3、克隆位点位于氨苄青霉素抗性（ampR)或四环
素抗性基因(tetR)内，插入外源基因后可导 致相应基因失活
载体pBR322的结构图
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
SalI
pBR322
(4.36 kb)
阳性菌落
Ampr Tcs
提 取 DNA 电泳
重 组 DNA
2. 酶切鉴定 3.PCR分析
4. 核酸分子杂交分析
美国生物制药产品种类及数量
（PHRAM）
疾病种类 产品数量
疾病种类
产品数量
感染性疾病
39
神经系统疾病
28
艾滋病及相关疾病 19
皮肤病
19
消化系统疾病
11
血液疾病
9
不育症
类型 质粒 噬菌体 病毒
载体分类
克隆载体 用于克隆和扩增目的基因的载体
基本特点: 1、复制起点 2、克隆位点（多克隆位点），供外源DNA插入 3、选择标记基因，以指示载体或重组DNA分子
是否进入宿主细胞 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数 5、易导入受体细胞
注：前三个特点必不可少
表达载体 用于表达外源基因，合成目的蛋白的载体
除具有克隆载体基本原件外，还应具备表达元件
原核：启动子－核糖体结合位点－转录终止信号 真核：增强子－启动子－终止信号－ＰolyＡ信号
质粒载体
(一)质粒 质粒的特点 举例
质粒
概念 游离于细菌染色体外，能自主复制的闭环双链DNA
pBR322载体
特点： 1、分子量较小，为4361bp，可容纳的外源DNA较
限制酶的分类
1. I型：具有限制和DNA修饰作用，在识别位点约
1000bp处切割DNA，位点不确定
2. II型：基因工程中的常用限制酶，能在DNA分子内
部的特异位点识别和切割双链DNA，切割位点的序列 可知、固定
3. III型：具有限制和修饰活性，能在识别位点附近切
割DNA，切割位点不确定
限制酶的识别和切割位点
E c o R I S a c I K p n I S m a I B a m H I X b a I S a lI P stI S p h I H in d I II
pU C 19
LacZ
Apr
(2.68kb)
Ori
第二节 重组DNA技术的基本原理
基本操作
获取-切割-连接-转化-筛选
一 获取目的基因 ⑴ 制备 基因组DNA
1）识别４-8bp 2）对称性—回文序列
EcoR I
末端种类
１）３’-粘性末端 Pst I
２）５’-粘性末端
EcoRI
３） 平端 SmaI
限制酶的应用
1. DNA重组 2. 限制酶（物理）图谱绘制 3. 突变分析（RFLP分析）、同源性分析 4. DNA测序
二、载 体
概念 能在连接酶作用下和外源DNA片段 连接, 实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义 的蛋白质所采用的DNA分子。
基因决定性状（一）
青霉菌能产生对人类有用的抗生素——青霉素 返回
基因决定性状（二）
❖ 家蚕能够吐出蚕丝为人类利用
定向基因改造设想
设想 一
设想 二
设想 三
能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？
能否让细菌“吐出”蚕丝？
能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等 珍贵的药物？
经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了 可以定向改造生物的新技术——重组DNA技术
5
生长发育不良症
3
பைடு நூலகம்
妊娠预防
2
心脏病
26
呼吸系统疾病
22
自主免疫系统疾病 19
移植
13
遗传疾病
11
糖尿病及并发症
7
眼病
3
骨质疏松
2
肿瘤疾病
175
生物技术与传统中药
中药现代化——核心是建立与现代基因学说相应的现代中药理论 现代中药理论的建立——确立中药与基因表达的关系
中药药靶（基因）或作用位点基因的寻找 中药化学组：中药有效成分包括较单一的成分和多种成分 中药临床药效的科学评价与分析方法 生物技术的应用 中药基因组——利用现代生物技术研究分析中药对人体（细胞）基因 表达（蛋白质）的影响。 技术平台：大规模基因表达分析（基因芯 片、SAGE、蛋白质组等技术）以及相关信息数据库的建立 中药化学组——利用现代仪器分析技术分析有效成分及其药物代谢、 动力学。 技术平台：色谱及色谱-质谱，色谱-波谱，波谱-波谱联用 等分析技术与层析、临界萃取等分离技术 中药新剂型
基因组文库
⑵ 制备cDNA cDNA文库
⑶ 聚合酶链 反应（PCR） 合成
DNA模板 引物 dNTP Taq DNA聚合酶
⑷ 人工合成
二 目的基因和载体连接
1.平端连接
T4 连接酶 2.互补黏端连接
3. 加同聚物尾连接
4. 加人工接头连接
三 重组DNA导入宿主细胞
重组DNA导入宿主细胞的过程称转化
第一节 重组DNA技术的主要工具
重组DNA技术必备工具
限制酶 切割DNA
连接酶 连接DNA
载体
承载目的DNA并导入细胞
其它工具酶
一、 限制性核酸内切酶
1. 分布：主要由细菌产生 2. 特点：特异性，即识别特定核苷酸序列， 切割特定切点 3. 结果：产生具黏性未端（碱基互补配 对）、平端的DNA片段
谢谢大家!
ori
pUC系列
（1）来自pBR322，分子量为2.7KB，含复制起点 （2）含氨苄青霉素抗性基因，且无克隆位点 （3）含标记基因LacZ，编码β-半乳糖苷酶N端146个
氨基酸 （4）多克隆位点位于LacZ内
pUC18和pUC19载体
pU C 18
H in d II I S p h I P stI S a lI X b a I B a m H I S m a I K p n I S a c I E c o R I