第十七章基因重组与基因工程_PPT幻灯片
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基因重组与基因工程ppt课件
二、重组DNA技术的基本原理
1. 目的基因的获取 2. 克隆载体的选择与构建 3. 外源基因与载体的连接 4. 重组DNA导入受体菌 5. 重组体的筛选 6. 克隆基因的表达
DNA克隆的基本过程
1. 分：分离目的基因 2. 切：对目的基因和载体适当切割 3. 接：目的基因与载体连接 4. 转：重组DNA转入受体菌 5. 筛：筛选出含有重组体的受菌体
基本概念
基因重组 (gene recombination)
是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之
基因工程 (genetic engineering）
是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将
基因重组与基因工程
第一节 自然界的基因转移与重组
一、接合作用(conjugation) 二、转化(transformation)及转导(transduction) 三、转座(transposition) 四、基因重组
基因重组与基因工程
Genetic Recombination & Genetic Engineering
李凌
基因研究的三步曲
一、20世纪50年代以前：染色体遗传学阶段 二、20世经50年代—70年代：
基因的分子生物学阶段 三、20世经70年代至今：
DNA重组工程学的发展，基因研究走向 反向生物学阶段
切：
有缺口的载体
限制性内切酶 目的基因
接： 转： 筛：
粘端连接 转化 表型筛选
连接酶 平端连接 重组体
转染 带重组体的宿主
电泳法
尾接法 体外包装 核酸杂交
C19的分子结构
2．噬菌体：
可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。 常用的为人工构建的λ 噬菌体载体。 噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中 目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可
高一生物必修课件基因重组和基因工程及其应用
基因重组和基因工程都可以用来创造新的 生物性状或改良生物品种。
两者区别
9字
基因重组是自然发生的，而 基因工程是人工操作的。
9字
基因重组的结果具有不确定 性，而基因工程可以精确设 计和控制。
9字
基因重组通常发生在同一物 种内，而基因工程可以跨物 种进行。
9字
基因重组不需要额外的工具 或技术，而基因工程需要依 赖特定的工具和技术，如限 制性内切酶、DNA连接酶等 。
高一生物必修课件基因重组和 基因工程及其应用
汇报人：XX
20XX-01-13
CONTENTS
• 基因重组 • 基因工程 • 基因工程应用 • 基因重组与基因工程关系 • 实验：基因重组和基因工程操
作实践
01
基因重组
基因重组概念
基因重组定义
基因重组是指在生物体进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因的重新组 合。
05
实验：基因重组和基因工程操作实践
实验目的与原理
目的
通过实验操作，了解基因重组和基因工程的基本原理，掌握相关实验技能，培养科学探究精神和实验能力。
原理
基因重组是生物体内基因重新组合的过程，包括同源重组和非同源重组两种方式。基因工程则是通过人工手段对 基因进行改造和重组，实现特定性状或功能的表达。本实验将通过模拟基因重组和基因工程操作，加深对相关原 理的理解。
重组DNA分子的导入
目的基因的检测与鉴定
将重组DNA分子导入受体细胞，使目的基 因在受体细胞中表达。
通过PCR、Southern杂交等方法检测目的 基因是否成功导入并表达。
03
基因工程应用
农业生产应用
转基因作物
通过基因工程手段，将外 源基因导入农作物中，使 其获得抗虫、抗病、抗除 草剂等优良性状，提高作
两者区别
9字
基因重组是自然发生的，而 基因工程是人工操作的。
9字
基因重组的结果具有不确定 性，而基因工程可以精确设 计和控制。
9字
基因重组通常发生在同一物 种内，而基因工程可以跨物 种进行。
9字
基因重组不需要额外的工具 或技术，而基因工程需要依 赖特定的工具和技术，如限 制性内切酶、DNA连接酶等 。
高一生物必修课件基因重组和 基因工程及其应用
汇报人：XX
20XX-01-13
CONTENTS
• 基因重组 • 基因工程 • 基因工程应用 • 基因重组与基因工程关系 • 实验：基因重组和基因工程操
作实践
01
基因重组
基因重组概念
基因重组定义
基因重组是指在生物体进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因的重新组 合。
05
实验：基因重组和基因工程操作实践
实验目的与原理
目的
通过实验操作，了解基因重组和基因工程的基本原理，掌握相关实验技能，培养科学探究精神和实验能力。
原理
基因重组是生物体内基因重新组合的过程，包括同源重组和非同源重组两种方式。基因工程则是通过人工手段对 基因进行改造和重组，实现特定性状或功能的表达。本实验将通过模拟基因重组和基因工程操作，加深对相关原 理的理解。
重组DNA分子的导入
目的基因的检测与鉴定
将重组DNA分子导入受体细胞，使目的基 因在受体细胞中表达。
通过PCR、Southern杂交等方法检测目的 基因是否成功导入并表达。
03
基因工程应用
农业生产应用
转基因作物
通过基因工程手段，将外 源基因导入农作物中，使 其获得抗虫、抗病、抗除 草剂等优良性状，提高作
大学生物化学课件基因工程ppt
定义 识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围 切割双链DNA的一类内切酶。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
切割DNA后产生含5’磷酸和3’羟基的末端
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
菌落原位杂交
以 质 粒 为 载 体 的
DNA 克 隆 过 程
扩增或表达
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
（六）克隆基因的表达
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
平端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
GTC CAG
蛋白质而特意设计的载体称为表达载体。
载体的选择标准：
能在宿主细胞中自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体
的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有
多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 作为表达载体，具有与宿主细胞相适应的
调控元件：启动子，增强子等。
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Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
切割DNA后产生含5’磷酸和3’羟基的末端
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连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
菌落原位杂交
以 质 粒 为 载 体 的
DNA 克 隆 过 程
扩增或表达
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（六）克隆基因的表达
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
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平端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
GTC CAG
蛋白质而特意设计的载体称为表达载体。
载体的选择标准：
能在宿主细胞中自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体
的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有
多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 作为表达载体，具有与宿主细胞相适应的
调控元件：启动子，增强子等。
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高中生物基因突变和基因重组最全最新ppt课件
1、在生物界普遍存在
短腿安康羊（中） 玉米白化苗 人类多指
基因突变发生在生物个体发育的什么时期？ 任何时期
基因突变发生的时期与突变性状在生物体的表现部位及范围大小有什么关系？
突变发生的时期越早，表现突变的部分越多，突变发生的时期越晚，表现突变的部 分越少。
总之，基因突变可以发生在个体发育的任何时期，可以发生在细胞不同的DNA 分子上，可以在同一DNA分子的不同部位
2 类型:
①基因的自由组合: 非同源染色体上的非等位基因的组合.
②基因的互换: 同源染色体上的非姐妹染色单体之间发生局部互换. ③重组DNA技术：通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取 出来，在生物体外重组，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的性状。
转基因抗虫棉花 转入苏云金杆菌的一个抗虫基因，是中国目前最主要的转基因作物。
37
;.
3、意义:
通过有性生殖实现基因重组为生物变异提供了极其 丰富的来源,是生物多样性的重要原因之一.
基因重组能否产生新的基因？
38
;.
对比基因突变与基因重组：
基因突变
基因重组
本质
基因分子结构变化，产生新基因（碱 基替换|增添|缺失）
并不产生新基因，产生新的基因型，使 不同性状发生组合
发生 时间
长折
短折
中国黄牛
ⅹ
荷斯坦牛 中 国 荷 斯 坦 牛
46
;.
课堂巩固
1、生物变异的根本来源是
D
A．基因重组 B．染色体数目变异
C．染色体结构变异 D．基因突变
2、基因重组发生在
A．减数分裂形成配子的过程中
B．受精作用形成受精卵的过程中
C．有丝分裂形成子细胞的过程中
基因重组和基因工程课件
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感受态细胞：指具备接受外源DNA能力的宿主细胞
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（六）克隆基因的表达 表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化
第一节
DNA的重组
DNA Recombination
1
DNA重组包括：
同源重组
接合作用
细菌的基因转移与重组 转化作用
位点特异重组
转导作用
转座重组
2
一、同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重组。 是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和 再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单 链或双链片段的交换。
DNA Recombination Technique
24
基因工程诞生的历史背景：
1973年是基因工程诞生的元年。 1. 1944年Oswald T.Avery等的肺炎球菌转化证 明了DNA是遗传信息携带者。 2. 1953年James Watson和Francis Crick 两人 提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质 自我复制的机制。 3. 1961-1965年,科学家破译了生物界全部64个遗 传密码,发表了划时代的遗传密码字典，提出了遗 传信息由DNA→RNA→蛋白质传递的中心法则。 4. 1970年发现了反转录酶，丰富了中心法则，为 cDNA的制备奠定了基础。
基因重组与基因工程PPT课件
不易腐烂的番茄
2、动物植物的遗传改良
抗虫植物 化学农药
兔毛棉花在我国培育成功：用兔的一种角蛋白转化棉花，棉花纤维质量好，具有兔毛般的光泽。
3、人类基因治疗
（1）体细胞基因治疗
1990年9月14日美国政府首次批准了一项基因治疗临床研究计划：对一台患有腺苷脱氨酶（ADA）缺陷的重度联合免疫缺陷症（SCID）4岁女童进行基因治疗并获得成功。该患者今年已经10岁了。从而开创了医学界的新纪元。
（三）DNA序列的复制
（一）DNA克隆技术
2、PCR技术
10.3 基因工程
（一）基因工程的基本原理和方法
基因工程的实现主要分为三个步骤： 第一步：目的基因的分离或制备：人工分离生物基因组群中目的基因及内切酶定位切割或人工酶促合成 第二步：重组DNA：选择载体及目的基因与载体基因重组 第三步：导入与表达：重组DNA导入受体细胞，目的基因表达出目的效应和性状 实现以上三步需要进行以下工作： 1) 寻找目标基因 2) 取得目标基因 3) 基因的载体问题：现主要有质粒载体、病毒载体、脂质载体、原生质载体
（2）转基因生物的生产
转基因小鼠：导入人类基因，具有较强的学习能力。在迷宫实验中，转基因鼠觅食本领比普通鼠要高许多，同时对迷宫中食物存放地点记忆更清楚。
（二） 基因工程的应用
1、特殊蛋白质的大量生产
乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊
美国转基因猪，其体内含有人类的基因，乳汁含有人体蛋白fatorⅧ。只需300～600只这样的母猪就能满足全世界对这种蛋白的需求。
人胰岛素 从猪和牛的胰脏提取，获得100g胰岛素需800－1000kg的牛胰脏。现在用基因工程方法在大肠杆菌中表达产生。 人生长激素 具有物种特异性，只能用人的生长激素来治疗侏儒症。以前从尸体脑垂体中提取，来源非常有限，现在用基因工程方法在大肠杆菌中表达产生。 干扰素 体外培养人体细胞来生产，产量低，成本高，现用重组大肠杆菌生产。
基因重组与基因工程技术课件
克隆部分“留一半”的原则有时候是很有用的。 酶切是否完全，所以要做载体的自连对照。 载体酶切回收是否考虑到切除片段的大小， 是否要用切胶回收更保险。
DNA重组的基本模式
分（离目的基因）
“ 纵 切（割目的基因和载体） 向 接（连目的基因和载体） ” 体 转（化宿主细胞） 系 筛（选阳性克隆）
表（达目的基因）
相应的基因结构
化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的 基因。
化学合成的不足之处在于： --要已知基因的核苷酸顺序；
--基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基 酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成 几百ｂｐ的短片段，短片段越多，要连接成正确的 基因顺序就越困难，得率越低；
--价格昂贵。
平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性 末端。
（三）人工接头连接法：
将人工连接器（linker，即一段人工合成的含有 多种限制酶切点的小分子DNA片段，约10~20个 核苷酸）连接到平末端DNA分子(载体和目的基 因)上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的 基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。
19731973年美国斯坦福大学教授年美国斯坦福大学教授s科恩和加州大学旧金山分和加州大学旧金山分校教授校教授hw博耶将两个不同的质粒一个是抗四环素质粒另将两个不同的质粒一个是抗四环素质粒另一个是抗链霉素质粒拼接在一起组成嵌合质粒并将其导入一个是抗链霉素质粒拼接在一起组成嵌合质粒并将其导入大肠杆菌当该重组质粒进入大肠杆菌体内后这些大肠杆菌能大肠杆菌当该重组质粒进入大肠杆菌体内后这些大肠杆菌能抵抗两种药物而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性
科恩随后以DNA重组技术发明人的身份向美 国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术 专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中 形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己 的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造 新的生命类型。
DNA重组的基本模式
分（离目的基因）
“ 纵 切（割目的基因和载体） 向 接（连目的基因和载体） ” 体 转（化宿主细胞） 系 筛（选阳性克隆）
表（达目的基因）
相应的基因结构
化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的 基因。
化学合成的不足之处在于： --要已知基因的核苷酸顺序；
--基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基 酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成 几百ｂｐ的短片段，短片段越多，要连接成正确的 基因顺序就越困难，得率越低；
--价格昂贵。
平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性 末端。
（三）人工接头连接法：
将人工连接器（linker，即一段人工合成的含有 多种限制酶切点的小分子DNA片段，约10~20个 核苷酸）连接到平末端DNA分子(载体和目的基 因)上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的 基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。
19731973年美国斯坦福大学教授年美国斯坦福大学教授s科恩和加州大学旧金山分和加州大学旧金山分校教授校教授hw博耶将两个不同的质粒一个是抗四环素质粒另将两个不同的质粒一个是抗四环素质粒另一个是抗链霉素质粒拼接在一起组成嵌合质粒并将其导入一个是抗链霉素质粒拼接在一起组成嵌合质粒并将其导入大肠杆菌当该重组质粒进入大肠杆菌体内后这些大肠杆菌能大肠杆菌当该重组质粒进入大肠杆菌体内后这些大肠杆菌能抵抗两种药物而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性
科恩随后以DNA重组技术发明人的身份向美 国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术 专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中 形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己 的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造 新的生命类型。
基因重组___上课(好)ppt课件
14
6、基因重组的应用
在生产上的应用
1.杂交育种
简述用纯种黄色圆粒豌豆和绿色皱粒豌豆培育纯种绿色圆粒豌豆的过程。 要求写出遗传图解并加以适当的文字解释。
2.基因工程
;.
16
杂交育种：
原理:
基因重组
方法: 优点:
杂交——自交——筛选 操作简单、能根据人的预见把位于两个生物体上的优良性状集于一身。
缺点：
“一母生九仔，连母十个样”，这种个体的差异，主要是什么原因产生的? 基因重组
1
基因重组： 是指生物体在进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因重新组合
的过程。
2
第2节 基因重组 一、细菌的基因重组 二、高等生物的基因重组 三、基因的人工重组—基因工程
4
二、高等生物的基因重组 1.类型:
①基因的自由组合: (减I后期）
减数第一次分裂前期的四分体时期的交叉互 换； 减数第一次分裂后期，非同源染色体上的非 等位基因自由组合。
条件 意义
外界环境条件的变化和内部 因素的相互作用。
新基因产生的途径，是生物变异的 根本来源,是生物进化的原始材料。
有性生殖过程中进行减数分裂形成生殖细 胞。
是生物变异的重要来源，是形成生物多样性 的重要原因，对生物的进化也具有重要的意 义
22
1．基因突变：
基发因生时___期__：内___部____结_改_构_变__，__它__________(能__或__否__)_产_ 生新的能基因
特点：①普遍性、 ②随细机胞性分、裂③间_期__（__D_N__A__复_、制时） ④少利多害性、⑤不定向性。
2．基因重组：
低频性
控制不同性状的_____________，_______新基因，可形成新的________。
6、基因重组的应用
在生产上的应用
1.杂交育种
简述用纯种黄色圆粒豌豆和绿色皱粒豌豆培育纯种绿色圆粒豌豆的过程。 要求写出遗传图解并加以适当的文字解释。
2.基因工程
;.
16
杂交育种：
原理:
基因重组
方法: 优点:
杂交——自交——筛选 操作简单、能根据人的预见把位于两个生物体上的优良性状集于一身。
缺点：
“一母生九仔，连母十个样”，这种个体的差异，主要是什么原因产生的? 基因重组
1
基因重组： 是指生物体在进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因重新组合
的过程。
2
第2节 基因重组 一、细菌的基因重组 二、高等生物的基因重组 三、基因的人工重组—基因工程
4
二、高等生物的基因重组 1.类型:
①基因的自由组合: (减I后期）
减数第一次分裂前期的四分体时期的交叉互 换； 减数第一次分裂后期，非同源染色体上的非 等位基因自由组合。
条件 意义
外界环境条件的变化和内部 因素的相互作用。
新基因产生的途径，是生物变异的 根本来源,是生物进化的原始材料。
有性生殖过程中进行减数分裂形成生殖细 胞。
是生物变异的重要来源，是形成生物多样性 的重要原因，对生物的进化也具有重要的意 义
22
1．基因突变：
基发因生时___期__：内___部____结_改_构_变__，__它__________(能__或__否__)_产_ 生新的能基因
特点：①普遍性、 ②随细机胞性分、裂③间_期__（__D_N__A__复_、制时） ④少利多害性、⑤不定向性。
2．基因重组：
低频性
控制不同性状的_____________，_______新基因，可形成新的________。
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1）识别４-8bp 2）对称性—回文序列
EcoR I
末端种类
１）３’-粘性末端 Pst I
２）５’-粘性末端
EcoRI
３） 平端 SmaI
限制酶的应用
1. DNA重组 2. 限制酶（物理）图谱绘制 3. 突变分析（RFLP分析）、同源性分析 4. DNA测序
二、载 体
概念 能在连接酶作用下和外源DNA片段 连接, 实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义 的蛋白质所采用的DNA分子。
大 2、一个复制起点，具氨苄青霉素抗性（ampR)和
四环素抗性基因(tetR) 3、克隆位点位于氨苄青霉素抗性（ampR)或四环
素抗性基因(tetR)内，插入外源基因后可导 致相应基因失活
载体pBR322的结构图
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
SalI
pBR322
(4.36 kb)
基因决定性状（一）
青霉菌能产生对人类有用的抗生素——青霉素 返回
基因决定性状（二）
❖ 家蚕能够吐出蚕丝为人类利用
定向基因改造设想
设想 一
设想 二
设想 三
能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？
能否让细菌“吐出”蚕丝？
能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等 珍贵的药物？
经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了 可以定向改造生物的新技术——重组DNA技术
类型 质粒 噬菌体 病毒
载体分类
克隆载体 用于克隆和扩增目的基因的载体
基本特点: 1、复制起点 2、克隆位点（多克隆位点），供外源DNA插入 3、选择标记基因，以指示载体或重组DNA分子
是否进入宿主细胞 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数 5、易导入受体细胞
注：前三个特点必不可少
表达载体 用于表达外源基因，合成目的蛋白的载体
阳性菌落
Ampr Tcs
提 取 DNA 电泳
重 组 DNA
2. 酶切鉴定 3.PCR分析
4. 核酸分子杂交分析
美国生物制药产品种类及数量（PHRAM）疾来自种类 产品数量疾病种类
产品数量
感染性疾病
39
神经系统疾病
28
艾滋病及相关疾病 19
皮肤病
19
消化系统疾病
11
血液疾病9不育症基因组⑵ 制备cDNA cDNA
⑶ 聚合酶链 反应（PCR） 合成
DNA模板 引物 dNTP Taq DNA聚合酶
⑷ 人工合成
二 目的基因和载体连接
1.平端连接
T4 连接酶 2.互补黏端连接
3. 加同聚物尾连接
4. 加人工接头连接
三 重组DNA导入宿主细胞
重组DNA导入宿主细胞的过程称转化
ori
pUC系列
（1）来自pBR322，分子量为2.7KB，含复制起点 （2）含氨苄青霉素抗性基因，且无克隆位点 （3）含标记基因LacZ，编码β-半乳糖苷酶N端146个
氨基酸 （4）多克隆位点位于LacZ内
pUC18和pUC19载体
pU C 18
H in d II I S p h I P stI S a lI X b a I B a m H I S m a I K p n I S a c I E c o R I
E c o R I S a c I K p n I S m a I B a m H I X b a I S a lI P stI S p h I H in d I II
pU C 19
LacZ
Apr
(2.68kb)
Ori
第二节 重组DNA技术的基本原理
基本操作
获取-切割-连接-转化-筛选
一 获取目的基因 ⑴ 制备 基因组DNA
除具有克隆载体基本原件外，还应具备表达元件
原核：启动子－核糖体结合位点－转录终止信号 真核：增强子－启动子－终止信号－ＰolyＡ信号
质粒载体
(一)质粒 质粒的特点 举例
质粒
概念 游离于细菌染色体外，能自主复制的闭环双链DNA
pBR322载体
特点： 1、分子量较小，为4361bp，可容纳的外源DNA较
细胞类型： 原核细胞 真核细胞
大肠杆菌 链球菌 枯草杆菌 酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞
四 筛选和鉴定重组DNA
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
1. 平板筛选 插入失活
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
无菌落
筛选重组子
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
谢谢大家!
限制酶的分类
1. I型：具有限制和DNA修饰作用，在识别位点约
1000bp处切割DNA，位点不确定
2. II型：基因工程中的常用限制酶，能在DNA分子内
部的特异位点识别和切割双链DNA，切割位点的序列 可知、固定
3. III型：具有限制和修饰活性，能在识别位点附近切
割DNA，切割位点不确定
限制酶的识别和切割位点
5
生长发育不良症
3
妊娠预防
2
心脏病
26
呼吸系统疾病
22
自主免疫系统疾病 19
移植
13
遗传疾病
11
糖尿病及并发症
7
眼病
3
骨质疏松
2
肿瘤疾病
175
生物技术与传统中药
中药现代化——核心是建立与现代基因学说相应的现代中药理论 现代中药理论的建立——确立中药与基因表达的关系
中药药靶（基因）或作用位点基因的寻找 中药化学组：中药有效成分包括较单一的成分和多种成分 中药临床药效的科学评价与分析方法 生物技术的应用 中药基因组——利用现代生物技术研究分析中药对人体（细胞）基因 表达（蛋白质）的影响。 技术平台：大规模基因表达分析（基因芯 片、SAGE、蛋白质组等技术）以及相关信息数据库的建立 中药化学组——利用现代仪器分析技术分析有效成分及其药物代谢、 动力学。 技术平台：色谱及色谱-质谱，色谱-波谱，波谱-波谱联用 等分析技术与层析、临界萃取等分离技术 中药新剂型
第一节 重组DNA技术的主要工具
重组DNA技术必备工具
限制酶 切割DNA
连接酶 连接DNA
载体
承载目的DNA并导入细胞
其它工具酶
一、 限制性核酸内切酶
1. 分布：主要由细菌产生 2. 特点：特异性，即识别特定核苷酸序列， 切割特定切点 3. 结果：产生具黏性未端（碱基互补配 对）、平端的DNA片段
EcoR I
末端种类
１）３’-粘性末端 Pst I
２）５’-粘性末端
EcoRI
３） 平端 SmaI
限制酶的应用
1. DNA重组 2. 限制酶（物理）图谱绘制 3. 突变分析（RFLP分析）、同源性分析 4. DNA测序
二、载 体
概念 能在连接酶作用下和外源DNA片段 连接, 实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义 的蛋白质所采用的DNA分子。
大 2、一个复制起点，具氨苄青霉素抗性（ampR)和
四环素抗性基因(tetR) 3、克隆位点位于氨苄青霉素抗性（ampR)或四环
素抗性基因(tetR)内，插入外源基因后可导 致相应基因失活
载体pBR322的结构图
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
SalI
pBR322
(4.36 kb)
基因决定性状（一）
青霉菌能产生对人类有用的抗生素——青霉素 返回
基因决定性状（二）
❖ 家蚕能够吐出蚕丝为人类利用
定向基因改造设想
设想 一
设想 二
设想 三
能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？
能否让细菌“吐出”蚕丝？
能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等 珍贵的药物？
经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了 可以定向改造生物的新技术——重组DNA技术
类型 质粒 噬菌体 病毒
载体分类
克隆载体 用于克隆和扩增目的基因的载体
基本特点: 1、复制起点 2、克隆位点（多克隆位点），供外源DNA插入 3、选择标记基因，以指示载体或重组DNA分子
是否进入宿主细胞 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数 5、易导入受体细胞
注：前三个特点必不可少
表达载体 用于表达外源基因，合成目的蛋白的载体
阳性菌落
Ampr Tcs
提 取 DNA 电泳
重 组 DNA
2. 酶切鉴定 3.PCR分析
4. 核酸分子杂交分析
美国生物制药产品种类及数量（PHRAM）疾来自种类 产品数量疾病种类
产品数量
感染性疾病
39
神经系统疾病
28
艾滋病及相关疾病 19
皮肤病
19
消化系统疾病
11
血液疾病9不育症基因组⑵ 制备cDNA cDNA
⑶ 聚合酶链 反应（PCR） 合成
DNA模板 引物 dNTP Taq DNA聚合酶
⑷ 人工合成
二 目的基因和载体连接
1.平端连接
T4 连接酶 2.互补黏端连接
3. 加同聚物尾连接
4. 加人工接头连接
三 重组DNA导入宿主细胞
重组DNA导入宿主细胞的过程称转化
ori
pUC系列
（1）来自pBR322，分子量为2.7KB，含复制起点 （2）含氨苄青霉素抗性基因，且无克隆位点 （3）含标记基因LacZ，编码β-半乳糖苷酶N端146个
氨基酸 （4）多克隆位点位于LacZ内
pUC18和pUC19载体
pU C 18
H in d II I S p h I P stI S a lI X b a I B a m H I S m a I K p n I S a c I E c o R I
E c o R I S a c I K p n I S m a I B a m H I X b a I S a lI P stI S p h I H in d I II
pU C 19
LacZ
Apr
(2.68kb)
Ori
第二节 重组DNA技术的基本原理
基本操作
获取-切割-连接-转化-筛选
一 获取目的基因 ⑴ 制备 基因组DNA
除具有克隆载体基本原件外，还应具备表达元件
原核：启动子－核糖体结合位点－转录终止信号 真核：增强子－启动子－终止信号－ＰolyＡ信号
质粒载体
(一)质粒 质粒的特点 举例
质粒
概念 游离于细菌染色体外，能自主复制的闭环双链DNA
pBR322载体
特点： 1、分子量较小，为4361bp，可容纳的外源DNA较
细胞类型： 原核细胞 真核细胞
大肠杆菌 链球菌 枯草杆菌 酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞
四 筛选和鉴定重组DNA
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
1. 平板筛选 插入失活
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
无菌落
筛选重组子
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
谢谢大家!
限制酶的分类
1. I型：具有限制和DNA修饰作用，在识别位点约
1000bp处切割DNA，位点不确定
2. II型：基因工程中的常用限制酶，能在DNA分子内
部的特异位点识别和切割双链DNA，切割位点的序列 可知、固定
3. III型：具有限制和修饰活性，能在识别位点附近切
割DNA，切割位点不确定
限制酶的识别和切割位点
5
生长发育不良症
3
妊娠预防
2
心脏病
26
呼吸系统疾病
22
自主免疫系统疾病 19
移植
13
遗传疾病
11
糖尿病及并发症
7
眼病
3
骨质疏松
2
肿瘤疾病
175
生物技术与传统中药
中药现代化——核心是建立与现代基因学说相应的现代中药理论 现代中药理论的建立——确立中药与基因表达的关系
中药药靶（基因）或作用位点基因的寻找 中药化学组：中药有效成分包括较单一的成分和多种成分 中药临床药效的科学评价与分析方法 生物技术的应用 中药基因组——利用现代生物技术研究分析中药对人体（细胞）基因 表达（蛋白质）的影响。 技术平台：大规模基因表达分析（基因芯 片、SAGE、蛋白质组等技术）以及相关信息数据库的建立 中药化学组——利用现代仪器分析技术分析有效成分及其药物代谢、 动力学。 技术平台：色谱及色谱-质谱，色谱-波谱，波谱-波谱联用 等分析技术与层析、临界萃取等分离技术 中药新剂型
第一节 重组DNA技术的主要工具
重组DNA技术必备工具
限制酶 切割DNA
连接酶 连接DNA
载体
承载目的DNA并导入细胞
其它工具酶
一、 限制性核酸内切酶
1. 分布：主要由细菌产生 2. 特点：特异性，即识别特定核苷酸序列， 切割特定切点 3. 结果：产生具黏性未端（碱基互补配 对）、平端的DNA片段