多西紫杉醇白蛋白纳米粒的制备及体外评价
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过方程拟合释药曲线，考察制剂的体外释药特性。处方优化采用星点设计撤应面优化法，应用ＳＡＳ统计软件对数
据进行处理。结果：优化处方制得的纳米粒为类球形，平均粒径６５．３ ｎｍ，Ｚｅｔａ电位＿３１．４ ｍＶ。纳米粒收率９５．Ｏ％， 包封率７４．３％，载药量４．６５％，制剂２４小时体外累积释药百分率为７４．４％。结论：难溶性抗癌药物多西紫杉醇可 以采用去溶剂化—化学交联法制备成白蛋白纳米粒，其粒径小，稳定性高，可显著提高多西紫杉醇在水相中的浓度。 其优化处方中药物的释放显著慢于原料药磷酸盐缓冲溶液的释放，具有缓释效果。 【关键词】多西紫杉醇；自蛋白纳米粒；去溶剂化—化学交联法；体外释放；星点设计—效应面优化法 【中图分类号】Ｒ９４４，Ｒ９４３。１１９２７．２ ［文献标识码】Ａ 【文章编号】１００１－５０９４（２００８）０５—０２２３—０６
ＤＴ（中国药科大学新药研究中心惠赠）；ＢＳＡ （上海昱民生物技术有限公司）；考马斯亮兰Ｇ－２５０
图１ ＤＴ－ＢＳＡ－ＮＰｓ的透射电镜照片【ｘ卯Ｏ∞） （Ｆｉｇｕｒｅ １．ＴＥＭ ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈ ｏｆＩＹｒ－ＢＳＡ－ＮＰｓ。ｘ６００００）
万方数据
２００８，ＶｏＬ３２，Ｎｏ．５ ２２５ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＳｃＯｎｃｅｓ
Ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｈｅ ＮＰｓ ＷａＳ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｌｌｃｉｅｎｅｙ ａｎｄ
ｄｒｕｇ—ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＮＰｓ ｗｅＩ＿；ｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
将以上所测值代人公式计算：包封率＝（胶体 溶液中ＤＴ总量一游离ＤＴ量）／胶体溶液中ＤＴ总 量×１００％；载药量＝胶体溶液中ＤＴ总量／（ＤＴ投 人量＋载体投入量）×１００％。
２．５ ＤＴ－ＢＳＡ．ＮＰｓ处方工艺的优化考察 ＢＳＡ处方量、ＤＴ处方量、乙醇加入量和戊二醛
加人量、固化时间、添加剂等因素对ＤＴ—ＢＳＡ—ＮＰｓ的 粒径和包封率等指标均有不同程度的影响。根据预 试验对比结果，选择前３个因素作为优化对象，先进 行单因素试验选择适宜水平，然后采用星点设计试 验优选处方。 ２．５．１ ＢＳＡ处方量对ＤＴ．ＢＳＡ—ＮＰｓ粒径、包封率及 载药量的影响ＢＳＡ处方量对ＮＰｓ粒径影响很大， 当ＢＳＡ浓度为Ｏ．Ｏｌ、Ｏ．０３、Ｏ．０５、Ｏ．１０ ｇ／ｍＬ时，ＮＰｓ 粒径分别为１９３．１、７５．３、６１．９、７９．１ ｎｍ，而达Ｏ．１５ ｇ／ｍＬ以上时，其粒径会很大以至出现沉淀。ＢＳＡ浓 度为０．０５ ｇ／ｍＬ时，ＮＰｓ包封率和载药量皆最高。 ２．５．２ ＤＴ处方量对ＤＴ．ＢＳＡ—ＮＰｓ粒径、ｚｅｔａ电位 及载药量的影响ＤＴ处方量为１—４ ｇ／Ｌ时，ＮＰｓ 粒径在６０ ｎｍ左右，而达到５∥Ｌ后，其粒径迅速增 大，同时ｚｅｔａ电位由一４５。４ ｍｖ增至－２１．４ ｍＶ，且其 胶体溶液放置几小时后出现沉淀，说明ＤＴ处方量 增加会使胶体溶液稳定性变差，但载药量则随ＤＴ 处方量的增加而提高。 ２．５．３ 乙醇加入量对ＤＴ—ＢＳＡ－ＮＰｓ粒径和收率的 影响乙醇加入量越大．ＮＰｓ收率越高，尤其在乙醇 和水的体积比值大于１后，其收率增加明显，并逐渐 接近１００％；且粒径也随之先增大后减小，当乙醇和 水的体积比大于７：４后，粒径基本上在６０ ｎＩｎ左右， 可能是由于刚加入乙醇时形成的ＮＰｓ比较疏松、粒 径大，随着乙醇加入量的增加，蛋白质去溶剂化现象 愈加明显，其疏水链卷曲的更加充分，使粒径变小。 ２．５．４处方工艺的优化以ＢＳＡ处方量（０．０１一 Ｏ．１０ ｇ／ｍＬ）、ＤＴ处方量（１—５ ｇ／Ｌ）、乙醇和水的
取优化处方工艺制得的ＤＴ－ＢＳＡ·ＮＰｓ胶体溶液 适量，蒸馏水稀释，磷钨酸负染。透射电镜观察粒子 形态（见图１），马尔文激光粒度仪测定粒径分布 （Ｄ）及Ｚｅｔａ电位（ｕ）（见图２）。由图ｌ可见，ＮＰｓ 里类球形。由图２可见，ＮＰｓ平均粒径为６５．３ ｎｍ， Ｚｅｔａ电位为一３１．４ ｍＶ，表明ＮＰｓ比较稳定。
ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｗｉｔｈ ａｌｌ ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ６５．３ ｎｍ，Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ一３１．４ ｍＶ．ｙｉｅｌｄ ｏｆ ９５．Ｏ％，ｄｒｕｇ—ｌｏａｄ一
【接受Ｅｌ期】２００８－０３－２１
‘通讯作者：平其能，教授，博士生导师； 研究方向： 药物新剂型与新技术； Ｔｅｌ：０２５－８３２７１０９８；Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｉｎｇｑｎ＠ｃｐｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
万方数据
—２００８ｉ篙誓专凳‰２２４ 年第３２卷 第５期 第 页
药。’学ｑ进～’展ｐ
２２４ ２００８，Ｖｏ／．３２，Ｎｏ．５ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
ｉｎｇ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ４．６５％．ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ７４．３％ａｎｄ ２４ ｈ－ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ７４．４％． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＴ ｉｎ ｗａｔｅｒ．ＤＴ－ ＢＳＡ·ＮＰｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ａ ｓｍａｌｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ，ｈｉ曲ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ讥 ｖｉｔｒｏ．
Ｉ仪器与试剂
试剂盒（南京建成生物工程研究所）；２５％戊二醛 （中国医药集团上海试剂公司）；其余试剂均为分 析纯。
２方法与结果
２．１ ＤＴ－ＢＳＡ－ＮＰｓ的制备 取处方量ＢＳＡ溶于水相，置于３０℃恒温水浴，
以４８０ ｒ／ｒａｉｎ持续搅拌的同时向水相中滴加ＤＴ无 水乙醇溶液至处方量，继续滴加无水乙醇至一定比 例，加入２％戊二醛水溶液，继续搅拌固化２４小时， 于３５℃旋转蒸发去除有机溶剂，过０．２２ ｔｔｍ微孔滤 膜，即得ＤＴ．ＢＳＡ—ＮＰｓ胶体溶液，冻于后得到红棕色 粉末。 ２．２ ＤＴ．ＢＳＡ．ＮＰｓ的形态、粒径及Ｚｅｔａ电位
ＨＰＬＣ法色谱条件：色谱柱：Ｓｈｉｍ—ｐａｃｋ ＣＬＣ—
ＯＤＳ（６．０ ｍｍ×１５ ｍｍ，６炉），流动相：甲醇一水
（７８：２７），检测波长：２２９ ｎｎｌ，柱温：４０℃。在此色谱 条件下，以ＤＴ峰面积（Ａ）对其浓度（Ｃ）进行线性回 归，所得标准曲线方程为：Ａ＝４４０４Ｃ＋３９０．５３（帮 ＝１），可见ＤＴ在０．２—５０ ｍｇ／Ｌ浓度范围内，线性 关系良好。
药学进展
·研究与交流·
２００８年９３２卷９５期第２２５页
Ｄ｜硼Ａ
Ｕ｜∞Ｎ
图２ ｌｙｒ－ＢＳＡ－ＮＰｓ的粒径分布和Ｚｅｍ电位（Ｆｉｇｕｒｅ ２．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉ∞ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅ ８ｉ跫ａｎｄ Ｚｅｍ ｐｏｔｅｎｆｉａｌ ０ｆ ＤＴ－ＢＳＡ－ＮＰｓ）
２．３ ＮＰｓ收率的测定方法 取ＤＴ－ＢＳＡ．ＮＰｓ胶体溶液适量，超高速冷冻离
ＬＣ－ＩＯＡ高效液相色谱仪（日本岛津公司）；ＲＥ－ ５２Ａ型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；ＴＫ－１２Ｂ 型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）； Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳ激光粒度仪（英国马尔文公司）； Ｈ－７０００型透射电镜（日本日立公司）；ＭＫ３型全自动 酶标仪（美wenku.baidu.comＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ公司）；ＳＯＲＶＡＵＰ Ｔ－８８０型超高速冷冻离心机（美国Ｋｅｎｄｒｏ Ｉ．ａｂｏｒａｔｏ－ ｒｙ）；透析袋（截留分子质量：８ ０００—１２ Ｏ∞：＞。
【Ｋｅｙ ｗｒｏｄｓ］Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ；ＢＳＡ—ＮＰｓ；Ｄｅｓｏｌｖａｆｉｏｎ—ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ；Ｒｅｌｅａｓｅ／ｎ ｖ／胁ｏ；Ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎ－Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
多西紫杉醇（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ，ＤＴ）是由Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ 公司开发上市的一种新型紫杉烷类抗癌药物，其作 用机制是促进微管蛋白聚合及抑制微管解聚，从而 破坏肿瘤细胞的有丝分裂ｌｌＪ，用于治疗各种癌症， 尤其是晚期乳腺癌和非小细胞癌Ｂ】。由于ＤＴ在水 中的溶解度非常／ｂ（约１０ ｍｓ／Ｌ），因此上市的静脉 注射剂泰素帝＠浓溶液中含有大量的吐温８０，且需 用１３％乙醇稀释后方能注射ＨＪ，由于吐温８０具有 溶血性且黏性大，临床实验中大多数患者产生明显 的过敏反应【４】，故近年来开发不含有吐温８０的ＤＴ 新制剂一直是研究的热点”Ｊ。本文以牛血清白蛋 白（ＢＳＡ）作为载体。采用去溶剂化—化学交联法制备 ＤＴ自蛋白纳米粒（ＤＴ—ＢＳＡ·ＮＶｓ），成功地提高了ＤＴ 在水相中的浓度。由于载体ＢＳＡ本身具有安全无 毒、无免疫原性、可生物降解及生物相容性好等优 点，同时纳米粒（ＮＰｓ）载体系统具有独特的靶向性、 缓释性以及提高药物稳定性、减少毒副作用等特点， 尤其当ＮＰｓ粒径小于１２０ ｎｎｌ时具有渗透滞留增强 效应（ＥＰＲ效应）Ｍ’７】，因而ＤＴ—ＢＳＡ．ＮＰｓ有望降低 泰素帝＠的毒副作用，减少给药体积，同时靶向肿瘤 组织，提高局部药物浓度。
心ｌ小时（４℃，２３５４０８×ｇ），取上清液。蒸馏水稀 释适宜倍数，与考马斯亮兰应用液反应１０分钟， 酶标仪上于５９５ ｎｍ处测定吸光度（Ａ螂。），代入 标准曲线方程计算得到未去溶剂化的ＢＳＡ浓度， 再代入公式计算：纳米粒收率（％）＝（投入的ＢＳＡ 总量一未去溶剂化ＢＳＡ量）／投入的ＢＳＡ总量 ×１００％。 ２．４ ＤＴ．ＢＳＡ．ＮＰｓ包封率与载药量的测定方法
【Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅ／ｎ ｖｉｔｒｏ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｅｌｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ（ＤＴ—ＢＳＡ—ＮＰｓ）ａｎｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｏｆ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＤＴ—ＢＳＡ－ＮＰｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａ玎ｅｄ ｂｙ ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ—ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｍｏＩｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ＮＰｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ＴＥＭ．Ｔｈｅ ｄｉｓ－ ｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ＮＰｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｍａｌｖｅｒｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ａｎａｌｙｚｅｒ．
ＷａＳ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ，ｂａｓｅｄ ０ｎ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅ ｏｆ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｒａｔｉｏ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｉｔｔｉｎｇ ｏｆ ｒｅｌｅａｓｅ ｃｕｒ矿ｅ．Ｔｈｅｉｒ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ＷａＳ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ Ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎ—Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｄａｔａ ｗｅｒｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｕｓｉｎｇ ＳＡＳ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＤＴ－ＢＳＡ·ＮＰｓ ｗｅｒｅ
２００８，Ｉｉｏ／．３２，Ｎｏ．５ ２２３ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
貉学进展
·研究与交流· ２００８年第３２卷第５期第２２３页
多西紫杉醇白蛋白纳米粒的制备及体外评价
张晓燕，平其能。
（中国药科大学药学院药剂学教研室．江苏南京２１０００９）
【摘要】 目的：制备多西紫杉酵白蛋白纳米粒，考察白蛋白和多西紫杉醇的处方量及乙醇加入量等因素对其形 态、粒径、Ｚｅｔａ电位、收率、包封率、载药量和体外释药特性的影响。并对处方工艺进行优化。方法：采用去溶剂化一 化学交联法制备多西紫杉醇白蛋白纳米粒，透射电镜观察纳米粒形态，马尔文激光粒度仪测定其粒径分布及Ｚｅｔａ 电位，考马斯亮兰一酶标仪法测定纳米粒收率，ＨＰＬＣ法测定纳米粒包封率和载药量；以累积释药百分率为指标，通
取ＤＴ—ＢＳＡ—ＮＰｓ胶体溶液适量，蒸馏水稀释４ 倍，超高速冷冻离心ｌ小时（４℃，２３５ ４０８×ｇ），取上 清液０．１ ｍＬ，加入０．９ ｍＬ流动相稀释，进样，ＨＰＬＣ 法测定游离ＤＴ量。
移取ＤＴ－ＢＳＡ—ＮＰｓ胶体溶液０．１ ｍＬ，加入ｌ％ 胃蛋白酶水溶液１．０ ｍＬ，３７℃水浴中反应３０分 钟，加入２．９ ｍＬ甲醇涡旋２分钟，１２０００ ｒ／ｍｉｎ离心 １０分钟，移取０．１ ｍＬ上清液，用０．９ ｍＬ流动相稀 释，ＨＰＬＣ法测定ＤＴ总量。
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ／ｎ Ｖｉｔｒｏ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎ ｉｎｇ Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ
ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｙａｈ，ＰＩＮＧ Ｑｉ－ｎｅｎｇ
（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ肼ｍ册口ｃｅ眦洒，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｃｈｉｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９， Ｃｈｉｎａ）
据进行处理。结果：优化处方制得的纳米粒为类球形，平均粒径６５．３ ｎｍ，Ｚｅｔａ电位＿３１．４ ｍＶ。纳米粒收率９５．Ｏ％， 包封率７４．３％，载药量４．６５％，制剂２４小时体外累积释药百分率为７４．４％。结论：难溶性抗癌药物多西紫杉醇可 以采用去溶剂化—化学交联法制备成白蛋白纳米粒，其粒径小，稳定性高，可显著提高多西紫杉醇在水相中的浓度。 其优化处方中药物的释放显著慢于原料药磷酸盐缓冲溶液的释放，具有缓释效果。 【关键词】多西紫杉醇；自蛋白纳米粒；去溶剂化—化学交联法；体外释放；星点设计—效应面优化法 【中图分类号】Ｒ９４４，Ｒ９４３。１１９２７．２ ［文献标识码】Ａ 【文章编号】１００１－５０９４（２００８）０５—０２２３—０６
ＤＴ（中国药科大学新药研究中心惠赠）；ＢＳＡ （上海昱民生物技术有限公司）；考马斯亮兰Ｇ－２５０
图１ ＤＴ－ＢＳＡ－ＮＰｓ的透射电镜照片【ｘ卯Ｏ∞） （Ｆｉｇｕｒｅ １．ＴＥＭ ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈ ｏｆＩＹｒ－ＢＳＡ－ＮＰｓ。ｘ６００００）
万方数据
２００８，ＶｏＬ３２，Ｎｏ．５ ２２５ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＳｃＯｎｃｅｓ
Ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｈｅ ＮＰｓ ＷａＳ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｌｌｃｉｅｎｅｙ ａｎｄ
ｄｒｕｇ—ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＮＰｓ ｗｅＩ＿；ｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
将以上所测值代人公式计算：包封率＝（胶体 溶液中ＤＴ总量一游离ＤＴ量）／胶体溶液中ＤＴ总 量×１００％；载药量＝胶体溶液中ＤＴ总量／（ＤＴ投 人量＋载体投入量）×１００％。
２．５ ＤＴ－ＢＳＡ．ＮＰｓ处方工艺的优化考察 ＢＳＡ处方量、ＤＴ处方量、乙醇加入量和戊二醛
加人量、固化时间、添加剂等因素对ＤＴ—ＢＳＡ—ＮＰｓ的 粒径和包封率等指标均有不同程度的影响。根据预 试验对比结果，选择前３个因素作为优化对象，先进 行单因素试验选择适宜水平，然后采用星点设计试 验优选处方。 ２．５．１ ＢＳＡ处方量对ＤＴ．ＢＳＡ—ＮＰｓ粒径、包封率及 载药量的影响ＢＳＡ处方量对ＮＰｓ粒径影响很大， 当ＢＳＡ浓度为Ｏ．Ｏｌ、Ｏ．０３、Ｏ．０５、Ｏ．１０ ｇ／ｍＬ时，ＮＰｓ 粒径分别为１９３．１、７５．３、６１．９、７９．１ ｎｍ，而达Ｏ．１５ ｇ／ｍＬ以上时，其粒径会很大以至出现沉淀。ＢＳＡ浓 度为０．０５ ｇ／ｍＬ时，ＮＰｓ包封率和载药量皆最高。 ２．５．２ ＤＴ处方量对ＤＴ．ＢＳＡ—ＮＰｓ粒径、ｚｅｔａ电位 及载药量的影响ＤＴ处方量为１—４ ｇ／Ｌ时，ＮＰｓ 粒径在６０ ｎｍ左右，而达到５∥Ｌ后，其粒径迅速增 大，同时ｚｅｔａ电位由一４５。４ ｍｖ增至－２１．４ ｍＶ，且其 胶体溶液放置几小时后出现沉淀，说明ＤＴ处方量 增加会使胶体溶液稳定性变差，但载药量则随ＤＴ 处方量的增加而提高。 ２．５．３ 乙醇加入量对ＤＴ—ＢＳＡ－ＮＰｓ粒径和收率的 影响乙醇加入量越大．ＮＰｓ收率越高，尤其在乙醇 和水的体积比值大于１后，其收率增加明显，并逐渐 接近１００％；且粒径也随之先增大后减小，当乙醇和 水的体积比大于７：４后，粒径基本上在６０ ｎＩｎ左右， 可能是由于刚加入乙醇时形成的ＮＰｓ比较疏松、粒 径大，随着乙醇加入量的增加，蛋白质去溶剂化现象 愈加明显，其疏水链卷曲的更加充分，使粒径变小。 ２．５．４处方工艺的优化以ＢＳＡ处方量（０．０１一 Ｏ．１０ ｇ／ｍＬ）、ＤＴ处方量（１—５ ｇ／Ｌ）、乙醇和水的
取优化处方工艺制得的ＤＴ－ＢＳＡ·ＮＰｓ胶体溶液 适量，蒸馏水稀释，磷钨酸负染。透射电镜观察粒子 形态（见图１），马尔文激光粒度仪测定粒径分布 （Ｄ）及Ｚｅｔａ电位（ｕ）（见图２）。由图ｌ可见，ＮＰｓ 里类球形。由图２可见，ＮＰｓ平均粒径为６５．３ ｎｍ， Ｚｅｔａ电位为一３１．４ ｍＶ，表明ＮＰｓ比较稳定。
ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｗｉｔｈ ａｌｌ ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ６５．３ ｎｍ，Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ一３１．４ ｍＶ．ｙｉｅｌｄ ｏｆ ９５．Ｏ％，ｄｒｕｇ—ｌｏａｄ一
【接受Ｅｌ期】２００８－０３－２１
‘通讯作者：平其能，教授，博士生导师； 研究方向： 药物新剂型与新技术； Ｔｅｌ：０２５－８３２７１０９８；Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｉｎｇｑｎ＠ｃｐｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
万方数据
—２００８ｉ篙誓专凳‰２２４ 年第３２卷 第５期 第 页
药。’学ｑ进～’展ｐ
２２４ ２００８，Ｖｏ／．３２，Ｎｏ．５ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
ｉｎｇ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ４．６５％．ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ７４．３％ａｎｄ ２４ ｈ－ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ７４．４％． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＴ ｉｎ ｗａｔｅｒ．ＤＴ－ ＢＳＡ·ＮＰｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ａ ｓｍａｌｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ，ｈｉ曲ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ讥 ｖｉｔｒｏ．
Ｉ仪器与试剂
试剂盒（南京建成生物工程研究所）；２５％戊二醛 （中国医药集团上海试剂公司）；其余试剂均为分 析纯。
２方法与结果
２．１ ＤＴ－ＢＳＡ－ＮＰｓ的制备 取处方量ＢＳＡ溶于水相，置于３０℃恒温水浴，
以４８０ ｒ／ｒａｉｎ持续搅拌的同时向水相中滴加ＤＴ无 水乙醇溶液至处方量，继续滴加无水乙醇至一定比 例，加入２％戊二醛水溶液，继续搅拌固化２４小时， 于３５℃旋转蒸发去除有机溶剂，过０．２２ ｔｔｍ微孔滤 膜，即得ＤＴ．ＢＳＡ—ＮＰｓ胶体溶液，冻于后得到红棕色 粉末。 ２．２ ＤＴ．ＢＳＡ．ＮＰｓ的形态、粒径及Ｚｅｔａ电位
ＨＰＬＣ法色谱条件：色谱柱：Ｓｈｉｍ—ｐａｃｋ ＣＬＣ—
ＯＤＳ（６．０ ｍｍ×１５ ｍｍ，６炉），流动相：甲醇一水
（７８：２７），检测波长：２２９ ｎｎｌ，柱温：４０℃。在此色谱 条件下，以ＤＴ峰面积（Ａ）对其浓度（Ｃ）进行线性回 归，所得标准曲线方程为：Ａ＝４４０４Ｃ＋３９０．５３（帮 ＝１），可见ＤＴ在０．２—５０ ｍｇ／Ｌ浓度范围内，线性 关系良好。
药学进展
·研究与交流·
２００８年９３２卷９５期第２２５页
Ｄ｜硼Ａ
Ｕ｜∞Ｎ
图２ ｌｙｒ－ＢＳＡ－ＮＰｓ的粒径分布和Ｚｅｍ电位（Ｆｉｇｕｒｅ ２．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉ∞ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅ ８ｉ跫ａｎｄ Ｚｅｍ ｐｏｔｅｎｆｉａｌ ０ｆ ＤＴ－ＢＳＡ－ＮＰｓ）
２．３ ＮＰｓ收率的测定方法 取ＤＴ－ＢＳＡ．ＮＰｓ胶体溶液适量，超高速冷冻离
ＬＣ－ＩＯＡ高效液相色谱仪（日本岛津公司）；ＲＥ－ ５２Ａ型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；ＴＫ－１２Ｂ 型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）； Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳ激光粒度仪（英国马尔文公司）； Ｈ－７０００型透射电镜（日本日立公司）；ＭＫ３型全自动 酶标仪（美wenku.baidu.comＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ公司）；ＳＯＲＶＡＵＰ Ｔ－８８０型超高速冷冻离心机（美国Ｋｅｎｄｒｏ Ｉ．ａｂｏｒａｔｏ－ ｒｙ）；透析袋（截留分子质量：８ ０００—１２ Ｏ∞：＞。
【Ｋｅｙ ｗｒｏｄｓ］Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ；ＢＳＡ—ＮＰｓ；Ｄｅｓｏｌｖａｆｉｏｎ—ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ；Ｒｅｌｅａｓｅ／ｎ ｖ／胁ｏ；Ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎ－Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
多西紫杉醇（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ，ＤＴ）是由Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ 公司开发上市的一种新型紫杉烷类抗癌药物，其作 用机制是促进微管蛋白聚合及抑制微管解聚，从而 破坏肿瘤细胞的有丝分裂ｌｌＪ，用于治疗各种癌症， 尤其是晚期乳腺癌和非小细胞癌Ｂ】。由于ＤＴ在水 中的溶解度非常／ｂ（约１０ ｍｓ／Ｌ），因此上市的静脉 注射剂泰素帝＠浓溶液中含有大量的吐温８０，且需 用１３％乙醇稀释后方能注射ＨＪ，由于吐温８０具有 溶血性且黏性大，临床实验中大多数患者产生明显 的过敏反应【４】，故近年来开发不含有吐温８０的ＤＴ 新制剂一直是研究的热点”Ｊ。本文以牛血清白蛋 白（ＢＳＡ）作为载体。采用去溶剂化—化学交联法制备 ＤＴ自蛋白纳米粒（ＤＴ—ＢＳＡ·ＮＶｓ），成功地提高了ＤＴ 在水相中的浓度。由于载体ＢＳＡ本身具有安全无 毒、无免疫原性、可生物降解及生物相容性好等优 点，同时纳米粒（ＮＰｓ）载体系统具有独特的靶向性、 缓释性以及提高药物稳定性、减少毒副作用等特点， 尤其当ＮＰｓ粒径小于１２０ ｎｎｌ时具有渗透滞留增强 效应（ＥＰＲ效应）Ｍ’７】，因而ＤＴ—ＢＳＡ．ＮＰｓ有望降低 泰素帝＠的毒副作用，减少给药体积，同时靶向肿瘤 组织，提高局部药物浓度。
心ｌ小时（４℃，２３５４０８×ｇ），取上清液。蒸馏水稀 释适宜倍数，与考马斯亮兰应用液反应１０分钟， 酶标仪上于５９５ ｎｍ处测定吸光度（Ａ螂。），代入 标准曲线方程计算得到未去溶剂化的ＢＳＡ浓度， 再代入公式计算：纳米粒收率（％）＝（投入的ＢＳＡ 总量一未去溶剂化ＢＳＡ量）／投入的ＢＳＡ总量 ×１００％。 ２．４ ＤＴ．ＢＳＡ．ＮＰｓ包封率与载药量的测定方法
【Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅ／ｎ ｖｉｔｒｏ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｅｌｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ（ＤＴ—ＢＳＡ—ＮＰｓ）ａｎｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｏｆ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＤＴ—ＢＳＡ－ＮＰｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａ玎ｅｄ ｂｙ ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ—ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｍｏＩｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ＮＰｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ＴＥＭ．Ｔｈｅ ｄｉｓ－ ｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ＮＰｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｍａｌｖｅｒｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ａｎａｌｙｚｅｒ．
ＷａＳ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ，ｂａｓｅｄ ０ｎ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅ ｏｆ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｒａｔｉｏ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｉｔｔｉｎｇ ｏｆ ｒｅｌｅａｓｅ ｃｕｒ矿ｅ．Ｔｈｅｉｒ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ＷａＳ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ Ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎ—Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｄａｔａ ｗｅｒｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｕｓｉｎｇ ＳＡＳ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＤＴ－ＢＳＡ·ＮＰｓ ｗｅｒｅ
２００８，Ｉｉｏ／．３２，Ｎｏ．５ ２２３ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
貉学进展
·研究与交流· ２００８年第３２卷第５期第２２３页
多西紫杉醇白蛋白纳米粒的制备及体外评价
张晓燕，平其能。
（中国药科大学药学院药剂学教研室．江苏南京２１０００９）
【摘要】 目的：制备多西紫杉酵白蛋白纳米粒，考察白蛋白和多西紫杉醇的处方量及乙醇加入量等因素对其形 态、粒径、Ｚｅｔａ电位、收率、包封率、载药量和体外释药特性的影响。并对处方工艺进行优化。方法：采用去溶剂化一 化学交联法制备多西紫杉醇白蛋白纳米粒，透射电镜观察纳米粒形态，马尔文激光粒度仪测定其粒径分布及Ｚｅｔａ 电位，考马斯亮兰一酶标仪法测定纳米粒收率，ＨＰＬＣ法测定纳米粒包封率和载药量；以累积释药百分率为指标，通
取ＤＴ—ＢＳＡ—ＮＰｓ胶体溶液适量，蒸馏水稀释４ 倍，超高速冷冻离心ｌ小时（４℃，２３５ ４０８×ｇ），取上 清液０．１ ｍＬ，加入０．９ ｍＬ流动相稀释，进样，ＨＰＬＣ 法测定游离ＤＴ量。
移取ＤＴ－ＢＳＡ—ＮＰｓ胶体溶液０．１ ｍＬ，加入ｌ％ 胃蛋白酶水溶液１．０ ｍＬ，３７℃水浴中反应３０分 钟，加入２．９ ｍＬ甲醇涡旋２分钟，１２０００ ｒ／ｍｉｎ离心 １０分钟，移取０．１ ｍＬ上清液，用０．９ ｍＬ流动相稀 释，ＨＰＬＣ法测定ＤＴ总量。
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ／ｎ Ｖｉｔｒｏ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎ ｉｎｇ Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ
ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｙａｈ，ＰＩＮＧ Ｑｉ－ｎｅｎｇ
（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ肼ｍ册口ｃｅ眦洒，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｃｈｉｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９， Ｃｈｉｎａ）