远缘杂交早代稳定小麦导入了外源DNA 片段并发生了DNA 重排

318 中国科学 C 辑 生命科学 2005, 35 (4): 318~325

远缘杂交早代稳定小麦导入了外源DNA 片段

并发生了DNA 重排

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张连全 刘登才** 颜泽洪 郑有良

(四川农业大学小麦研究所, 都江堰 611830)

摘要 在植物界, 多倍体植物非常普遍. 具有A, B, D 三个部分同源染色体组的普通小麦是异源多倍体物种的一个典型代表. 近几年, 模拟普通小麦的起源过程进行的研究表明, 从四倍体小麦注入节节麦整个基因组形成异源六倍体小麦的早期阶段, DNA 序列和基因表达发生了可能有利于遗传“二倍化”的变化. 利用普通小麦-黑麦远缘杂交自然结实的早代稳定特异小麦99L2研究发现: (ⅰ) 99L2至少导入了两个黑麦染色体上的DNA 片段, 表明可能存在不同于传统的小 麦-外源染色体配对重组的外源DNA 导入机制; (ⅱ) 99L2自身的DNA 序列发生了变化, 表明外源DNA 部分片段注入小麦染色体组过程中, 也可能导致小麦自身DNA 序列发生变化. 关键词 小麦 黑麦 远缘杂交 早代稳定 基因组进化

2005-04-15收稿, 2005-06-20收修改稿

* 国家自然科学基金项目(批准号: 30270804和30070462)、教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-04-0908)、长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0453)、人事部留学人员科技活动项目及四川省科技厅和四川省教育厅资助 **联系人, E-mail: dcliu7@

对小麦、大麦、水稻等自花授粉作物而言, 要从品种(系)杂交后代中获得稳定的品系一般都在5代以上. 如果杂交后代能够提早稳定, 无疑会缩短品种选育年限, 提高育种效率. 通过花药培养产生单倍体, 之后经过染色体加倍处理获得纯合品系的单倍-二倍化育种方法可以加快育种进程[1], 提高育种效率. 在水稻, 发现用特殊的二倍体水稻品系或从二倍体自发产生的三倍体水稻或四倍体水稻与正常二倍体水

稻杂交, 在F 2代获得部分稳定的二倍体株系, 这些F 2株系在形态上和DNA 水平上都呈现稳定, 同时具有双亲的DNA, 但是表现出偏父或偏母的现象, 有的还出现了双亲没有的新带, 这种F 2代稳定现象应用于水稻育种也可以大大缩短周期[2,3].

与品种(系)间杂交不同的是, 作物与其外源物种染色体的遗传基础存在很大差异, 作物远缘杂交后代通常表现为疯狂分离, 更难稳定, 甚至不能得到稳

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第4期张连全等: 远缘杂交早代稳定小麦导入了外源DNA片段并发生了DNA重排319

定后代. 不过, 运用远缘杂交染色体消除现象[4,5], 然后人工进行染色体加倍处理, 可以在早代迅速获得纯合稳定的作物品系. 虽然以前没有关于普通小麦(Triticum aestivum L., 2n = 42, AABBDD)-黑麦(Secale cereale L., 2n = 2x = 14, RR)远缘杂交染色体消除现象的报道, 但是我们从普通小麦地方品种新中长(Shinchunaga)与中国栽培黑麦(秦岭黑麦)的属间杂种自然自交结实早代, 未经染色体加倍处理, 意外地获得遗传稳定材料99L2[6]. 99L2的形态特征与正常普通小麦类似, 染色体数为42, 减数分裂中期Ⅰ染色体配对正常, 通常为21个二价体.

本研究比较了早代稳定的特殊小麦新材料99L2及其小麦亲本新中长和黑麦亲本秦岭黑麦的生化与分子标记, 发现99L2不但转入了黑麦异源DNA片段, 而且发现99L2的DNA序列存在重排现象.

1 材料与方法

1.1 供试材料

F3代稳定材料99L2及其自交F4, F5, 以及小麦亲本新中长和黑麦亲本秦岭黑麦, 均保存在四川农业大学小麦研究所. 秦岭黑麦是我国的一个栽培黑麦品种, 它对白粉病、条锈病免疫; 新中长是日本的抗赤霉病小麦地方品种, 由日本横滨大学Shi Taketa博士提供.

99L2的产生过程[6]: 新中长与秦岭黑麦的15株F1杂种植株自然结实共获得F2种子3粒, 分单株在实验室发芽获得3个植株F2-1, F2-2和F2-3. 三叶期移栽到田间, 但是F2-1和F2-3在苗期被地下害虫咬死, 只剩下F2-2. 从F2-2的自交后代发现所有的F3植株性状稳定, 取此稳定品系代号为99L2. 尽管F2-2的其他2个姊妹植株被虫咬死, 未能产生后代, 不能在F2及F3进行相互比较, 但是F2-2的结实情况和农艺性状与其后代F3类似, 这表明F2-2植株可能已纯合稳定, 即99L2在F2代可能已纯合.

1.2 根尖细胞有丝分裂染色体、花粉母细胞减数分裂观察

对根尖采用Schiff试剂染色, 碱性品红常规压片进行体细胞染色体观察. 处于减数分裂中期Ⅰ——四分体时期的花药用卡诺氏液Ⅰ固定, 用碱性品红制片, 观察统计染色体配对构型.

1.3 染色体C带及基因组原位杂交(GISH)分析

分带参照Gill等人[7]的方法, 小麦、黑麦染色体的鉴别分别参照Gill等人[7]和Lukaszewski等人[8]的标准进行. 基因组原位杂交分析参照美国Kansas State University网上(/wgrc/Protocols)公布的方法.

1.4 生化标记检测

SDS-PAGE分析参照颜泽洪等人[9]的方法; APAGE分析采用ISTA1986年颁布的APAGE(pH3.2)标准程序电泳分析醇溶蛋白.

1.5 RAPD分析

黑麦染色体臂2RS上的12个RAPD引物(OPA-08, OPC-07, OPB-12, OPJ-13, OPJ-18, OPI-09, OPM-01, OPO-10, OPP-06, OPT-12, OPY-07, OPY-20)被选取, 其PCR反应体系和程序参照Brunell等人[10]. 扩增产物在含有0.8%的琼脂糖凝胶中以1×TAE缓冲液为介质电泳, 凝胶成像系统观察.

1.6 SSR分析

选用位于小麦42条染色体臂上不同位置的58对SSR引物, 其引物的特征及SSR扩增参考Röder等人[11]. 扩增产物在含有0.5%EB和2.0%的琼脂糖凝胶中以5 V/cm, 1×TAE缓冲液为介质电泳. 所用引物如下: 引物编号1~4: X gwm164, X gwm550, X gwm192, X gwm233; 引物编号5-35: X gwm135-1AL, X gwm232- 1DL, X gwm614-2AS, X gwm328-2AL, X gwm356-2AL, X gwm374-2BS, X gwm261-2DS, X gwm157-2DL, X gwm- 369-3AS, X gwm674-3AL, X gwm547-3BL, X gwm161- 3DS, X gwm52-3DL, X gwm3-3DL, X gwm4-4AS, X gwm- 368-4BS, X gwm107-4BL, X gwm113-4BL, X gwm538- 4BL, X gwm251-4BL, X gwm304-5AS, X gwm174-5DL, X gwm494-6AL, X gwm570-6AL, X gwm469-6DS, X gwm- 332-7AL, X gwm400-7BS, X gwm43-7BS, X gwm611- 7BL, X gwm428-7DL, X gwm295-7DS; 引物编号36~ 58: X gwm136-1AS, X gwm11-1BS, X gwm140-1BL, X gwm- 106-1DS, X gwm337-1DS, X gwm512-2AS, X gwm-429-