串联亲和纯化 - 360文档中心

29串联亲和纯化技术_一种极具潜力的分离_鉴定蛋白复合体的工具-Good

收稿日期:2005-04-08 修回日期:2005-10-103通讯作者(corresponding author)文章编号:100126325(2006)0320246206短篇综述　串联亲和纯化技术:一种极具潜力的分离、鉴定蛋白复合体的工具狄文娜,花　芳,彭小忠3(中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京100005)摘要:大多数细胞的生物学功能都是由蛋白复合体而非单一蛋白来完成的,所以识别和分析蛋白复合体的组分是研究蛋白功能所必需的。

串联亲和纯化技术(T AP )能在生理条件下有效地分离、鉴定蛋白复合体,而无需知道复合体的组成或功能,目前已成功地应用于酵母及其他生物体中的蛋白复合体的成分分析。

与质谱技术联合应用可以识别与目的蛋白相互作用的蛋白,进而揭示蛋白质相互作用网络及其功能。

关键词:串联亲和纯化(T AP );蛋白复合体中图分类号:Q816 文献标识码:AT andem affinity purification technique :an extraordinary valuabletool for purifying protein complexesDI Wen 2na ,H UA Fang ,PE NG X iao 2zhong 3(National Laboratory of M edical M olecular Biology ,Basic M edical Research C ollege ,CAMS &PUMC ,Beijing 100005,China )Abstract :　It ’s a multi 2protein com plex and not single protein that accom plish m ost of cellular activity.Therefore ,to i 2dentify and analyze the com position of protein com plex is necessary for studying the function of proteins.T andem affinity purification technique (T AP )enables the effective purification of com plex under physiological conditions without knowl 2edge of the com plex com position and function.Now ,it has been adapted to analyze the com position of the protein com 2plexes in yeast.C ombined with mass spectrometry ,T AP can identify the interacting proteins of target protein and offer great help for opening protein interacting netw ork and function out.K ey w ords :T AP (tandem affinity purification );protein complex 随着越来越多的生物全基因组测序的完成,人们日益关注这些基因所编码的蛋白质以及它们行使的功能,蛋白质组学作为另一门新的学科也越发受到人们的关注[1]。

串联亲和纯化技术的研究进展

短短十年之后，TAP与质谱技术(mass spectrometry, MS)联用(TAP-MS)已成为一种高效且实用的方法在生物大分子相互作用领域中被广泛应用。近些年，随着TAP 标签的全面改进和质谱技术的不断发展，TAPMS 的灵敏度与专一性得到很大提高，使得该技术得以在更多领域发挥重要作用，也使得我们对蛋白质复合体进行系统性研究成为可能。随着该技术的不断成熟，TAP 技术迅速向各个领域扩展。如今，TAP 已经在病毒、细菌、原生动物、植物以及哺乳动物等多个领域发挥着积极作用。
1.4 串联亲和纯化(TAP)
将细胞抽提物加入lgG亲和柱，标记蛋白一端的ProtA结合区就会与亲和柱上的IgG形成很强的结合，即使用比较严谨的洗脱条件，也不会使标记蛋白及与其作用的蛋白质所形成的蛋白质复合体被洗脱下来。这样就降低了非特异性的蛋白质相互作用，同时也保留了绝大部分自然存在的相互作用。然后用TEv蛋白酶切割标签ProA，释放仍挂有CBP的蛋白复合物；在钙离子存在的情况下，将上面的纯化产物与钙调蛋白包被的亲和珠一起孵育，通过CBP亲和标签复合物再次被纯化，最后在温和的条件下利用EG—TA洗脱除去杂蛋白和TEv蛋白酶剩余物。通过这样的两步连续纯化就可得到高纯度的天然构象的蛋白(见图2)C93。
2.1.3 在研究高等真核生物中蛋白相互作用的应用
虽然TAP技术能够对酵母细胞蛋白质的相互作用进行大规模地研究，但在高等真核细胞中的应用却受到限制，这是因为在高等真核细胞中难以进行原位蛋白标记，以及存在内源表达的蛋白质干扰，和蛋白质翻译后调控机制的不同等因素。最近Forler等将TAP技术与RNAi技术联用，发现可以很大程度上降低上述问题的影响。目前这种联用的技术被称为iTAP，而且已经在果蝇的s2细胞中得到了成功的应用。

串联亲和纯化法

串联亲和纯化法
亲和纯化是一种利用毒物与固定结合基的吸附作用，将溶液中的污染物从水中萃取出来，以达到较高的处理效果的技术。

1、原理：亲和纯化技术主要利用水溶液中污染物与某些复杂化学物质结合，
以实现将污染物从水中分离。

该技术可以有效解决水中有机污染物（如硫醇、杂芳香族烃、芳香类胺类、有机磷酸盐等）以及重金属离子等的污染问题。

它通常是通过某种固定结合基（如碱性团聚水合物材料）将复杂污染物分离出来，让污染物在当量的复杂溶液中黏结聚集，从而实现对溶液中污染物的萃取。

2、过程：亲和纯化主要包括以下步骤：
（1）向反应系统中加入一定的固定结合基；
（2）将反应系统中的污染物吸附到此固定结合基上；
（3）从反应系统中移除污染物，以达到污染物消减的目的；
（4）回收得到的固体固定结合基；
（5）处理后的溶液再次进行清洗，以消减可能存在的有机物。

3、应用：亲和纯化技术在工业废水处理上是不可替代的，广泛应用于食品、
制药、化工、石油等工业生产过程中的各种废水处理，也有针对各种单一的污染物的处理，如废水中有机污染物、重金属离子等。

它不仅可以帮助企业在改善水质事业中发挥着重要作用，也能帮助工厂在节能、降耗、减排上发挥重要作用。

4、优势：
（1）效率高：比其他水处理技术效率还要高，可以有效处理各种水中的污染物，
主要用于去除废水中的有机物和重金属。

综上所述，亲和纯化技术是一项有效、安全、可靠的水处理技术，用于清除、净化企业的废水，可以有效解决水中有机污染物、重金属离子等的污染问题。

因此，亲和纯化技术在工业废水处理和污染的控制中起着不可替代的作用。

串联亲和纯化技术筛选Bat3的相互作用蛋白质

串联亲和纯化技术筛选Bat3的相互作用蛋白质吴为;李琴山;宋伟;缪时英;王琳芳【摘要】目的寻找与Bat3结合的蛋白质.方法采用串联亲和纯化技术,在Bat3编码序列羧基端融合Strep2和FLAG 2个分子标签,以此为诱饵筛选与其特异结合的蛋白质,最后进行质谱鉴定.结果筛选到1种蛋白质分子,命名为Ubl4A,免疫共沉淀结果显示Ubl4A可与Bat3相互结合.结论成功建立了串联亲和纯化技术平台,分离出可与Bat3相互作用的蛋白质Ubl4A.【期刊名称】《中国医学科学院学报》【年(卷),期】2014(036)001【总页数】4页(P1-4)【关键词】Bat3;凋亡;串联亲和纯化【作者】吴为;李琴山;宋伟;缪时英;王琳芳【作者单位】中国医学科学院,北京协和医学院,基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京,100005;中国医学科学院,北京协和医学院,基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京,100005;中国医学科学院,北京协和医学院,基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京,100005;中国医学科学院,北京协和医学院,基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京,100005;中国医学科学院,北京协和医学院,基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京,100005【正文语种】中文【中图分类】Q-31材料与试剂 Pfu Taq DNA polymerase、限制性内切酶、T4连接酶购自美国NEB 公司，DMEM培养基、胎牛血清购自美国GIBCO公司，转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司;Anti-strep2珠子购自德国IKA公司，Anti-Flag珠子购自美国Sigma公司，Biotin、3x-flag多肽购自美国Sigma公司。

根据NCBI中Bat3基因序列，利用PRIMER PREMIER软件设计引物：上游为TAAGCTAGCGCCACCATGGAGCCTAATGATAGTACCAG，下游为AATACGCGTAGGATCATCAGCAAAGGCC。

串联亲和纯化技术

串联亲和纯化技术亲和纯化技术是一种常用的蛋白质分离和纯化方法，在生物科学研究、药物研发等领域广泛应用。

它使用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用，通过一系列步骤实现目标蛋白质的高效纯化。

本文将从亲和纯化的原理、步骤以及应用方面来进行详细介绍。

亲和纯化技术的原理基于分子间的特异性识别和结合。

首先，我们需要选择一个适当的配体，该配体具有与目标蛋白质结合的能力。

配体可以是抗体、亲和色谱介质等。

当样品中含有目标蛋白质时，配体与目标蛋白质结合形成复合物。

随后，我们可以通过控制条件（如pH、离子浓度等）来解离复合物，从而获得纯化的目标蛋白质。

亲和纯化技术的步骤主要包括细胞裂解、配体固定、样品加载、洗脱和再生步骤。

首先，我们需要将细胞裂解得到包含目标蛋白质的混合物。

其次，将配体固定在纯化介质上，形成亲和色谱柱或亲和杂质。

然后，将混合物加载到亲和色谱柱上，目标蛋白质与配体发生结合。

在洗脱步骤中，通过改变洗脱缓冲液的条件，如pH或离子浓度，从而调控目标蛋白质与配体的结合，使其从亲和柱中洗脱出来。

最后，进行再生步骤，即通过再生缓冲液将配体重新恢复到初始状态，以便于下一次亲和分离的进行。

亲和纯化技术在生物科学研究和药物研发中具有重要的应用价值。

首先，在蛋白质研究领域，亲和纯化可以用于纯化目标蛋白质，获得足够纯度的样品进行结构解析、功能研究和药物筛选。

其次，在疾病诊断和治疗方面，亲和纯化可以用于纯化特定抗原，用于制备相应的诊断试剂盒或制备特异性治疗药物。

此外，亲和纯化还可以用于分离和纯化膜蛋白、酶等难以纯化的蛋白质。

在进行亲和纯化实验时，我们需要注意以下几点。

首先，选择合适的配体是关键，配体必须能够与目标蛋白质特异性结合，而不与其他非目标蛋白质结合。

其次，进行样品加载时，应注意控制加载量和速度，避免样品过量或过快，以免影响纯化效果。

此外，洗脱步骤中要根据实验需求选择适当的洗脱缓冲液，以充分洗脱目标蛋白质。

最后，在实验结束后，应及时进行亲和纯化柱的再生，以确保下次实验的有效性。

ap-ms原理

ap-ms原理
1.【问题】ap-ms原理
【答案】ap-ms原理整理如下，供大家学习参考。

Affinity Capture-MS是目前应用最广泛的蛋白相互作用研究方法。

这种方法也被称为AP-MS（Affinity Purification coupled MS），即亲和纯化串联质谱分析。

AP-MS的主要原理是基于特异性抗体或其他亲和试剂与靶标蛋白的亲和作用，通过免疫共沉淀（co-Immunoprecipitation）将靶标蛋白与靶标蛋白的相互作用蛋白从复杂的生物体系中纯化出来，进而进行质谱检测以鉴定靶标蛋白的相互作用蛋白。

经典的AP-MS实验通常包含以下4个关键步骤：1）细胞或组织的裂解；2）蛋白溶液与偶联抗体的亲和微珠的孵育；3）非特异性结合和背景蛋白的清洗以及特异性互作蛋白的洗脱；4）互作蛋白的质谱检测和分析。

理想的AP-MS实验会通过特异性抗体亲和纯化内源性表达的诱饵蛋白以检测更接近生理状态下的蛋白相互作用，但这种方案如果存在诱饵蛋白的内源表达水平低或抗体的效价不高的情况，将难以获得良好的实验结果。

因此，很多研究者会选择在细胞体系中过表达带有融合标签（例如Flag，Myc，HA等）的诱饵蛋白，针对蛋白标签进行亲和纯化，以获得更好的检测结果。

泛素化蛋白检测方法

泛素化蛋白检测方法泛素化蛋白检测方法是用来检测细胞中是否存在泛素化蛋白质的一种技术手段。

泛素化是一种重要的细胞调控方式，参与了细胞内很多生物学过程，如蛋白质降解、DNA损伤修复、信号转导等。

因此，泛素化蛋白的检测对于了解细胞生理和病理过程具有重要意义。

本文将介绍几种常用的泛素化蛋白检测方法。

1.免疫印迹法免疫印迹是一种常用的蛋白质检测方法，可以用于检测泛素化蛋白质的表达水平。

该方法通过将细胞裂解，并用SDS-进行蛋白质分离，然后将蛋白质转移至膜上。

接着，使用特异性的抗体识别泛素化蛋白质，并通过化学发光或荧光信号的检测来定量泛素化蛋白的含量。

这种方法简单、快速、灵敏，并可同时检测多种泛素化蛋白。

2.免疫组化免疫组化是一种能够在细胞和组织水平上检测蛋白质分布和定位的方法。

通过将细胞或组织切片，并使用特异性抗体标记泛素化蛋白质，然后通过对比传统组织学方法进行分析，可以了解泛素化蛋白质在细胞或组织中的表达和编码特征。

免疫组化可以定量检测泛素化蛋白质在细胞和组织中的表达水平，同时还能对泛素化蛋白质的亚细胞定位进行研究。

3.蛋白质质谱法蛋白质质谱法是一种用于检测蛋白质修饰的方法，可以用来分析和鉴定泛素化蛋白。

这种方法首先通过产生离子化的蛋白质片段，并利用质量分析仪进行分离和鉴定。

具体而言，可以根据泛素化蛋白质的谱峰与非泛素化蛋白质的谱峰相对比，来确定泛素化蛋白质的存在与否。

蛋白质质谱法具有高灵敏度和高特异性的特点，并且可以检测多种不同的泛素化位点。

4.串联亲和纯化法串联亲和纯化法是一种用于检测和鉴定泛素化蛋白质的方法。

该方法首先通过将泛素蛋白识别域（UBD）与亲和纯化基质结合，然后选择性地富集泛素化蛋白质。

接着，将富集的蛋白质再进行定量分析或质谱分析，以确定泛素化蛋白质的存在和性质。

这种方法具有很高的特异性和灵敏度，并且可以检测细胞中不同泛素化位点的蛋白质。

总结起来，泛素化蛋白检测方法包括免疫印迹法、免疫组化、蛋白质质谱法和串联亲和纯化法。

利用串联亲和纯化技术分离大肠杆菌GroEL蛋白复合物

微生物学通报
Microbiology China
tongbao@
DEC 20, 2011, 38(12): 18481854 © 2011 by Institute of Microbiology, CAS
生物实验室
利用串联亲和纯化技术分离大肠杆菌 GroEL 蛋白复合物
魏波 1,2∆ 廖翔 2∆ 周围 2 王羽 1,2 李玉霞 2 高原 2 岳俊杰 2* 梁龙 2* 呼和巴特尔 1*
魏波等: 利用串联亲和纯化ssfully used to express fusion protein GroEL-TAP in Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. An efficient method for preparation of native protein complexes was developed and all experimental parameters of tandem affinity purification were optimized. The highly pure protein complexes composed of both tagged GroEL-TAP and natural GroEL were obtained with our expression and purification system. These results showed that our TAP system worked well to specifically purify protein complex participated with target protein in Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. This study provided satisfactory experimental base for follow-on works on identifying virulence protein participated complexes. Keywords: Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7, Tandem affinity purification (TAP), Chaperonin GroEL 随着蛋白质组学的发展 , 蛋白质相互作用的研究成为阐释基因功能的重要手段。串联亲和纯化 (Tandem affinity purification, TAP)是由 Rigaut 等 [1] 1999 年建立的 , 在真核细胞中表达融合两种不同性质亲和标签的靶蛋白 , 通过融合的标签进行两步亲和层析分离纯化靶蛋白参与形成的复合物。其优点主要在于 : 经过两步不同性质亲和层析得到的产物特异性高 , 非特异吸附导致的假阳性率非常低。 TAP 技术通常选择可在非变性条件下洗脱的标签 , 用于分离纯化天然状态的复合物 , 鉴定其蛋白组成 , 研究蛋白间相互作用。 2003 年 Gully D.等 [2]报道了分别利用 N 端 TAP 与 C 端 TAP 在 E. coli 中分离出与 ACP 相互作用的 MukB 与 Isc 蛋白 , 表明 ACP 还存在未被发现的生理功能 , 同时初步表明 TAP 技术在原核生物中应用的可行性。 2005 年 Butland G. 等 [3] 利用 TAP 研究了大肠杆菌中保守蛋白与未知蛋白的相互作用网络。这些工作表明 , 串联亲和纯化技术在原核生物的蛋白质相互作用中有很好的应用前景。肠出血性大肠杆菌 O157:H7 是常见致病菌 , 已知其致病机理跟一些毒力蛋白相关。本实验室致力于大肠杆菌 O157:H7 致病的分子机理研究 , 为开展相关的毒力蛋白相互作用研究 , 构建了在原核细胞表达的串联亲和纯化标签载体 pTAP。其中的标签分别为蛋白 G (Protein G, ProG) 和链亲和素结合肽 (Streptavidin-binding peptide, SBP), 标签之间含 2 个 TEV 酶特异的酶切位点 [4]; 此外 , pTAP 载体还含有绿色荧光蛋白 (Green fluorescent protein, GFPuv) 编码序列 , 作为检测融合蛋白是否成功表达的标志物 [5] 。本实验以分子伴侣 GroEL 为靶蛋白 , 成功地在大肠杆菌 O157:H7 中表达了 GroEL-TAP 融合蛋白 , 对串联亲和纯化过程进行了的详细优化 , 最终得到 GroEL 形成的复合物 , 不含任何杂蛋白。本文将详细讲述串联亲和纯化技术的建立和优化 ; 这些工作为后续以已知的毒力蛋白为靶蛋白 , 寻找与之相互作用的新蛋白 , 进而研究蛋白相互作用对毒力的影响提供了坚实的实验基础。

串联亲和纯化技术原理

串联亲和纯化技术原理引言：串联亲和纯化技术是一种用于分离和纯化蛋白质的常用方法。

其原理是利用特定的亲和配体与目标蛋白质发生特异性结合，从而实现目标蛋白质的高效分离和纯化。

本文将详细介绍串联亲和纯化技术的原理及其在生物制药和生物学研究中的应用。

一、串联亲和纯化技术的基本原理1. 亲和配体的选择串联亲和纯化技术的第一步是选择适合的亲和配体。

亲和配体是一种能够与目标蛋白质特异性结合的分子，它通常是一种蛋白质或化学修饰物。

常用的亲和配体有金属离子、抗体、亲和标签等。

2. 亲和柱的制备与校正根据选择的亲和配体，可以制备相应的亲和柱。

亲和柱是一种固定了亲和配体的柱状基质，如琼脂糖、硅胶等。

为了确保亲和纯化的高效性和特异性，亲和柱需要进行校正，以确定适宜的结合和洗脱条件。

3. 样品的处理与加载在进行串联亲和纯化之前，需要对样品进行预处理。

通常包括细胞裂解、蛋白质提取、富集等步骤。

预处理后的样品被加载到亲和柱上，目标蛋白质与亲和配体发生特异性结合。

4. 洗脱与再生洗脱是将目标蛋白质从亲和柱上洗脱下来的过程。

洗脱条件通常是改变pH值、离子浓度、温度等。

洗脱得到的蛋白质溶液即为目标蛋白质的纯化产物。

亲和柱在洗脱后需要再生，以去除非特异性结合的杂质。

二、串联亲和纯化技术在生物制药中的应用1. 蛋白质药物的纯化串联亲和纯化技术广泛应用于蛋白质药物的纯化过程中。

通过选择适当的亲和配体，可以高效地纯化目标蛋白质药物，并去除其他蛋白质、核酸、小分子等杂质。

这种方法具有高效、特异性好、纯化度高等优点，可以满足药物的高纯度要求。

2. 疫苗的制备串联亲和纯化技术也可用于疫苗的制备。

例如，通过将目标抗原蛋白质与亲和配体结合，可以高效地纯化目标抗原，然后将其制备成疫苗。

这种方法可以提高疫苗的纯度和效力，减少潜在的副作用。

三、串联亲和纯化技术在生物学研究中的应用1. 蛋白质相互作用的研究串联亲和纯化技术在研究蛋白质相互作用方面发挥了重要作用。

串联亲和纯化技术名词解释

串联亲和纯化技术名词解释嘿，咱今天来聊聊串联亲和纯化技术呀！这玩意儿就像是一个超级厉害的“捕鱼神器”呢！你想啊，在一个大池塘里，有各种各样的鱼，咱想要特定的那几条。

串联亲和纯化技术就好比是一张超级精准的大网，能把咱想要的目标给捞上来，而且还能把其他杂七杂八的东西都给筛掉。

它是怎么做到的呢？简单来说，就是通过一系列巧妙的设计和步骤。

首先呢，给目标分子加上一个“标签”，就像给鱼身上做个记号一样。

然后呢，利用这个标签，让它和特定的物质结合起来。

这就好比鱼被带有特殊诱饵的网给吸引住了。

接下来呀，经过一系列的操作和处理，就能把带着标签的目标分子给纯化出来啦！是不是很神奇？这就好像你在一堆玩具里找你最喜欢的那个小汽车，你给它贴上一个只有你认识的贴纸，然后通过一些特别的方法，就能准确无误地把它找出来啦！串联亲和纯化技术也是这样，它能在那么多复杂的分子里，精准地找到我们想要的那一个或那几个。

它的用处可大了去了！在生物学研究里，那简直就是个大功臣。

研究人员可以用它来分离和纯化各种蛋白质呀、核酸呀等等。

这就像是一个神奇的魔法棒，能帮助科学家们解开好多生物奥秘呢！比如说，要研究一个蛋白质的功能，没有这个技术可就麻烦啦！就像你要在一个大迷宫里找一个小宝藏，没有地图可太难啦！但是有了串联亲和纯化技术，就等于有了一张详细的地图，能让科学家们轻松找到目标，然后好好研究它。

而且哦，这个技术还在药物研发等领域发挥着重要作用呢！它能帮助找到那些对疾病有治疗作用的分子，就像在一堆宝石里找出最闪亮的那颗，然后用它来做出神奇的药物。

你说这串联亲和纯化技术是不是特别牛？它就像一个默默工作的小能手，在生物学的世界里发挥着巨大的作用。

咱可不能小瞧了它呀！它可是帮助我们探索生命奥秘的重要工具呢！所以啊，咱得好好认识它、了解它，说不定哪天咱也能用上它来做点厉害的事情呢！你说是不是呀？。

串联亲和纯化技术及其应用

细胞生物学杂志Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２００６，　２８：　６９４－６９８ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｊｃｂ．ｏｒｇ收稿日期：２００５－１２－３１接受日期：２００６－０６－１５＊通讯作者。

Ｔｅｌ：　０５７１－８６９７１４２５，　Ｆａｘ：　０５７１－８６９７１０９９，　Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｏｎｇａｎｄｗａｎｇ＠ｚｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ串联亲和纯化技术及其应用洪奇华　陈安国＊（浙江大学动物科学学院，杭州　３１００２９）摘要串联亲和纯化（ｔａｎｄｅｍ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＴＡＰ）是一种能快速研究体内蛋白质相互作用的新技术，经过两步特异性亲和纯化，可快速得到生理条件下与靶蛋白质存在真实相互作用的蛋白质。

ＴＡＰ方法最初用于酵母中，因其具通用性、高效性、高纯度及假阳性低等特点得到了快速发展，至今已成功运用于许多其他生物。

现主要介绍ＴＡＰ方法的原理、ＴＡＰ标签及其在不同物种中的应用。

关键词蛋白质相互作用；串联亲和纯化；标签；应用细胞内蛋白质间相互作用的分析是蛋白质组学研究的一个重要内容。

近年发展起来的高分辨率质谱技术为蛋白质复合体的鉴定提供了有力工具，因此确定蛋白质复合体的限制因素不是蛋白质鉴定，而是蛋白质复合体纯化。

寻求一种快速、方法可信和标准的蛋白质复合体纯化方法非常重要。

用传统方法（如亲和层析或免疫共沉淀）难以得到接近天然状态的蛋白质复合体，尤其是细胞中存在的一些低丰度蛋白质复合体（它们可能在生命过程中起重要的调节作用）。

Ｒｉｇａｕｔ等［１］首先提出了一种研究蛋白质相互作用的新方法——串联亲和纯化（ｔａｎｄｅｍ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，　ＴＡＰ）技术，特别适用于研究蛋白质在生理条件下的相互作用。

该技术通过在靶蛋白质一端嵌入一个特殊的蛋白质标签（ＴＡＰｔａｇ），不破坏靶蛋白质调控序列，且靶蛋白质表达量与体内水平相当；经过两步连续的亲和纯化获得接近自然条件的特定蛋白质复合体，后用质谱技术或Ｅｄｍａｎ降解法进行蛋白质鉴定。

串联亲和纯化偶联质谱技术

串联亲和纯化偶联质谱技术
近年来，串联亲和纯化偶联质谱技术（AP-MS）已成为生物学研
究中不可或缺的工具。

该技术使用亲和纯化将蛋白质复合物从细胞或组织中分离出来，并使用质谱技术识别和定量这些复合物中的蛋白质。

AP-MS技术的主要优势在于它能够鉴定蛋白质复合物中的成员和相互作用伙伴，同时还能够确定它们之间的结构和功能。

然而，AP-MS技术在实践中还存在一些困难，例如假阳性结果和蛋白质表达量差异的问题。

为了克服这些问题，研究人员正在开发新的方法和技术，如使用多种亲和纯化和质谱技术的组合，以及数据处理和分析算法的改进。

在未来，AP-MS技术将继续发挥重要作用，帮助我们更好地理解蛋白质相互作用和复合物的形成，从而拓展我们对生物学系统的认识。

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亲和纯化原理

亲和纯化原理
亲和纯化是一种常用的蛋白质纯化方法，其原理是利用特定配体与目标蛋白之间的高亲和性相互作用来实现目标蛋白的选择性结合和纯化。

在蛋白质纯化过程中，亲和纯化技术因其操作简便、纯化效果好、选择性强等优点而备受青睐。

本文将介绍亲和纯化的基本原理及其在生物制药领域的应用。

亲和纯化的基本原理是利用配体与目标蛋白之间的特异性相互作用。

通常情况下，配体会被固定在固定相上，例如琼脂糖或者磁珠上，而目标蛋白则通过与配体的特异性结合而被选择性地吸附在固定相上。

随后，通过洗脱等步骤，可以将非特异性结合的蛋白质去除，从而实现目标蛋白的纯化。

亲和纯化的选择性来源于配体与目标蛋白之间的特异性相互作用。

这种相互作用可以是多种多样的，例如亲和素-受体、抗体-抗原、金属离子-亲和标记等。

其中，亲和素-受体相互作用是亲和纯化中最常用的一种，因为亲和素与受体之间的结合强度高、特异性好，可以在不同的条件下实现目标蛋白的选择性结合和纯化。

在生物制药领域，亲和纯化技术被广泛应用于重组蛋白药物的
生产中。

由于重组蛋白药物通常需要高纯度的蛋白质作为药物原料，因此亲和纯化技术可以有效地实现对重组蛋白的高效纯化。

此外，
亲和纯化技术还可以用于从复杂的生物样品中富集目标蛋白，例如
从细胞培养上清液中富集重组蛋白，从血清中富集特定蛋白等。

总的来说，亲和纯化是一种重要的蛋白质纯化技术，其原理简单、操作方便、选择性强，因此在生物制药领域得到了广泛的应用。

随着生物制药行业的不断发展，亲和纯化技术也将不断完善和改进，为生物制药的发展提供更加可靠的技术支持。

SPR技术体外转录和翻译GST融合蛋白免疫共沉淀串联亲和纯化等鉴定分析蛋白质之间相互作用介绍(精品)

Inhibitory by-products
•T7 RNA polymerase •Translation machinery E. coli •Energy regenerating system
Inhibitory by-products
microtiterplate 96x RTS 100
PCR tubes 4x12 RTS 100
continuous exchange cell-free (CECF) principle
持续交换和非细胞体系的原理
偶联的转录和翻译过程
T7-RNA polymerase
gene
gene
E.coli lysate
DNA
coupled transcription / translation
protein
原子力显微镜检测蛋白质相互作用；
计算机方法；化学交联技术鉴定蛋白质相
GST PULL-DOWN：通过与GST融合蛋白质探针蛋白质相互作用从可溶性蛋白质库中亲和纯化一个未知蛋白质，再通过GST与谷光苷肽偶联球珠的结合收集相互作用蛋白质，从而分离出蛋白质复合物。
GST融合蛋白纯化基本程序
1 含有表达质粒的细菌培养； 2 诱导表达； 3 收集菌体； 4 加蛋白酶抑制剂，冰上破碎细胞； 5 离心取上清，按1：1的比例加谷光苷肽琼脂糖球珠，在4C，温和混匀30分钟； 6 离心收集琼脂糖球珠，用PBS轻轻混匀悬浮，反复三次； 7 将混合物装柱，让PBS流出； 8 加还原性的GSH将融合蛋白洗脱； 9 SDS-PAGE检测蛋白质纯化情况。
持续交换和非细胞体系的原理
供给腔反应腔
DNA template Protein
供给腔

质谱分析蛋白质的相互作用

蛋白质间的相互作用存在于生物体每个细胞的生命活动过程中，互交叉形成网络，成细胞中一系列重要生理活动的基础。

其中，多数蛋白质是通过与配体分子结合或者是作为1个大的生物复合体的一部分，与细胞完整性维持、遗传物质复制、基因表达调控、信号转导、免疫应答等一系列生命过程。

研究蛋白质间相互作用的方式和程度，将有助于蛋白质功能的分析、疾病致病机理的阐明和治疗和新型药物的开发等众多难题的解决。

因此，确定蛋白质间相互作用关系、绘制相互作用图谱已成为蛋白质组学研究的热点。

近年来有许多方法被用于蛋白质相互作用的研究，酵母双杂交技术，免疫共沉淀技术，串联亲和纯化技术，化学交联技术，蛋白质芯片技术，荧光共振能量转移技术，噬菌体展示技术等。

酵母双杂交技术Fields和song等首先在研究真核基因转录调控中建立起来的，是在真核细胞中检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用的方法。

该系统是通过两个分别称之为“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”的融合蛋白形成一个完整的转录激活因子，从而激活报告基因的表达，通过在营养缺陷型培养基上生长或呈现显色反应来检测系统的功能。

酵母双杂交系统可在全基因组规模上进行蛋白质一蛋白质相互作用高通量的研究。

免疫共沉淀技术免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。

其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。

然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。

这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

串联亲和纯化偶联质谱技术

串联亲和纯化偶联质谱技术
串联亲和纯化偶联质谱技术是一种结合亲和纯化和质谱分析的
方法，用于鉴定蛋白质相互作用和识别蛋白质复合物的组成。

该技术首先利用亲和纯化技术从混合物中富集目标蛋白质及其结合伴侣，然后通过偶联质谱技术对富集物进行分析，鉴定蛋白质相互作用和确定复合物组成。

此技术的优点在于，能够对复杂的蛋白质混合物进行高效、准确的筛选，同时能够以较高的灵敏度和特异性检测出蛋白质相互作用。

与传统的亲和纯化和质谱分析相比，串联亲和纯化偶联质谱技术能够更加全面地分析蛋白质复合物，同时也能够更加深入地研究蛋白质相互作用的动态变化和功能调控。

因此，串联亲和纯化偶联质谱技术在生命科学领域中被广泛应用，如用于发现新的信号通路、鉴定药物靶点、探究蛋白质功能等方面。

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蛋白质与蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction, PPI)研究方法概述

蛋白质与蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）研究方法概述目前检验蛋白质之间相互作用的实验方法主要有：酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）、噬菌体展示技术（Phage display）、串联亲和纯化-质谱（Tandem affinity purification-mass spectrometry, TAP-MS）以及GST pull-down。

其原理与适用范围如下：（1）酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）实验原理：双杂交系统的建立基于对真核生物调控转录起始过程的认识。

细胞起始基因转录需要有转录激活因子的参与，转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域（binding domain，简称为BD）和转录激活结构域（activation domain，简称为AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。

在酵母双杂交系统中，“诱饵”蛋白X（也就是已知的蛋白）克隆至DNA-BD载体中，表达DNA-BD/X融合蛋白；待测试蛋白Y克隆至AD载体中，表达AD/Y融合蛋白。

一旦X与Y蛋白间有相互作用，则DNA-BD和AD也随之被牵拉靠近，恢复行使功能，激活报告重组体中基因的表达。

图解：说明：其中，UAS即upstream activating sequence，上游激活序列。

适用范围：已知一种蛋白X，在体内（in vivo）筛选与其相互作用的蛋白，但前体是需预备一批可能与已知蛋白X相互作用的蛋白Y。

（2）噬菌体展示技术（Phage display）实验原理：将编码多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性，导入了各种各样外源基因的一群噬菌体，就构成一个展示各种各样外源肽的噬菌体展示库。

串联亲和纯化(tap)技术在蛋白质组学中的应用

串联亲和纯化(tap)技术在蛋白质组学中的应用近年来，蛋白质组学在生物化学、计算生物学和药物发现等领域发展迅速，其中串联亲和纯化(tap)技术作为定量研究蛋白质组学的有效工具更加受到重视和应用。

下面介绍串联亲和纯化(tap)技术在蛋白质组学中的应用：一、什么是Tap技术?Tap技术是串联亲和纯化(tap)技术，是一种用于精细定量测定蛋白质复合物在体外环境下的蛋白质组学分析技术。

它是一种基于亲和纯化和串联技术来测量细胞内蛋白质复合物的新技术。

二、Tap技术的优势1. 灵活：Tap技术可以灵活的检测各种复合物并且可以从微量的活细胞状态中进行采样，可以有效查明复合物结构体和活动关系；2. 灵敏度高、定量准确：利用Tap技术可以定量精且准确测量复合物的抑制作用；3. 去除背景噪声：Tap技术较之传统技术可以更加有效地抑制或消除干扰并有效提取特定信号；4. 高分辨率：Tap技术可以快速直接检测活细胞中复合物，实现对蛋白质复合物的形成和活性的高分辨率检测。

三、Tap技术的应用1. Tap技术在蛋白质组学研究中的应用：Tap技术可以有效地检测细胞复合物结构体和活动关系，获得高分辨率的活细胞复合物表达和调控水平，从而实现快速、准确地研究细胞生物学功能；2. Tap技术用于标记大分子研究：把Tap技术与标记大分子技术结合，可以使研究者根据需要获取完整的复合物组蛋白；3. Tap技术在药物研发过程中的应用：Tap技术作为高通量的筛选方法可用于研发新的活性化合物、抗原和抗体，以及作为药物的分子靶标筛选工具等；4. Tap技术在临床检测中的应用：Tap技术可以作为非侵入性、安全有效的检测方法，用于检测肿瘤标记物（如α-肿瘤抗原）体外诊断，以及病毒、重组蛋白等的诊断等。

总之，串联亲和纯化(tap)技术在蛋白质组学研究中无疑发挥着重要的作用，它的应用涉及到生物化学、计算生物学、药物研发和临床检测等多个领域。

Tap技术的运用，能够更加快捷有效地揭示蛋白的结构、功能以及调控机制，进而为更好地理解细胞中的代谢网络，提供新的思路、技术支持。

串联亲和纯化(TAP)技术的研究进展

圉３Ｎ端ＴＡＰ标签
２．２差减式标签（ｓｕｂｔｒａｅｔｉｏｎｔａｇ）【２】若两种复合物共同拥有一个相同的亚基，其中之一是我们的目的复合物时，直接分离会产生共分离现象，这时可采用差减式标签策略。将两种复合物的共同亚基与ＴＡＰ标签融合，而非必需复合物中的另一个蛋白质仅与单一的Ｐｉｎｔａ标签（无ＴＥＶ切点和ｃＢＰ）融合。因此，在第一次亲和纯化后，非必需复合物仍与ＩｇＧ珠结合而不被洗脱，仅有靶复合体被洗脱。２．３分裂式标签（ｓｐｌｉｔｔａｇ）【２】在生物体中，当两种不同复合物的亚基存在协同作用并可形成一个新的复合物时，由于其相互作用的部分较小，大部分仍保持游离状态或者这两种亚基主要是与其他复合物紧密结合时。用一般的方法不易将这一新复合物分离出来。而用分裂式标签可将这一含量稀少的复合物分离出来。该方法是将ＴＡＰ标签模体分开。分别融合于一个特定复合体的两个亚基，即一个亚基同ＰｒｏｔＡ和ＴＥｖ融合。而另一个和ＣＢＰ融合。在第一次亲和纯化时，仅包括ＣＢＰ的非特定复合体因不能结合ＩｇＧ珠而被除去，经过ＴＥＶ蛋白酶处理后。进行第二次亲和纯化，只有含两个靶亚基相作的复合物才能经过第二次亲和纯化得到分离。２．４顺序肽亲和标签（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｐｅｐｔｉｄｅａＩｉｎｉｔｙｔａｇ。ＳＰＡ）在ＴＡＰ标签的基础上。Ｚｅｇｈｏｕｆ等“０Ｊ发展了一种ＳＰＡ标签，将
１９９９年，德国的Ｒｉｇａｕｔ和Ｓｅｒａｐｈｉｎ共同开发出一套新的研究蛋白相互作用的技术——串联亲和纯化（ＴａｎｄｅｍＡｆｆｉｎｉ．ｔｙＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ。ＴＡＰ）ｕ．２ｊ。它是利用一种经过特殊设计的蛋白标签，经过两步连续的亲和纯化得到更接近自然状态的特定的蛋白复合物，能够在真实的生理条件下研究蛋白质的相互作用的技术。在一定程度上打破了蛋白质组学研究的瓶颈。