分子生物学 第四章 RNA的生物合成

第二节 转录的基本条件
一.反应体系
含DNA模板,NTP,酶，Mg2+,Mn2+ 。 其中原料为四种核苷三磷酸 NTP,DNA中的T在RNA合成中变为U ； 合成过程: 连续，方向：5'→3' 合成部位：细胞核内。
二.转录反应的模板 转录反应不但需要DNA作为模板， 而且不同的RNA聚合酶对DNA两股链 以及不同的DNA段落都有一定的选择 性。
他们的研究结果不仅破除了“酶一定是 蛋白质”的传统观点，而且也破除了“RNA 的功能只是控制蛋白质的合成”这一传统 观点。 因此他们于1989年共同获诺贝尔化学 奖。 此后RNA的重要功能不断有新的发现， 从而认识到——DNA是携带遗传信息分子， 蛋白质是执行生命功能的分子，RNA则既是 信息分子，又是功能分子。
RNA聚合酶对利福平(rifampicin)和利福霉 素(rifamycin)表现敏感的原因
大肠杆菌中σ70识别的标准启动子序 列： －TTGACA←16~18→TATAAT－； 由σ32识别的标准启动子序列： －TTGAA←13~15→CCCCAT。
3. α亚基
α亚基的相对分子质量约为4×104， 是核心酶的组建因子。 两个α亚基分别位于核心酶的首尾， 位于前端的α亚基可能与双链DNA的解链 有关，而位于尾端的α亚基可能促进解链 的双链DNA再次结合成为双螺旋结构。
• RNA聚合酶的全酶

• RNA聚合酶的核心酶

核心酶本身就能催化核苷酸间磷酸 二酯键的形成。 核心酶依靠静电作用与DNA发生非 专一性与非特异性的结合，负责RNA链 的转录延长。
2. σ亚基
σ亚基的相对分子质量约为7×104， 是构成RNA聚合酶的重要亚基。
σ亚基：识别启动子，起始转录。 σ亚基和其它肽链的结合不很牢固， 易脱离全酶。
用RNA聚合酶在体外对DNA双螺旋进行转录， 结果取决于DNA模板受到损伤的程度。
例如,将T7 DNA变性，RNA聚合酶能与单链 DNA结合，两条均能被转录。
但如果用天然的完整双链DNA为模板，则 RNA聚合酶仅能和称为启动子的顺序结合，从而 只能转录在活体内被转录的那条链。
（一） 模板的必要性
RNA转录还需要两个基本结构元 件——启动子和终止子。
DNA链上从启动子到终止子为止的 长度称为一个转录单位。 一个转录单位可以包括一个基因， 也可以包括几个基因。这在原核生物中 较常见。
三. DNA指导的RNA聚合酶
对RNA合成的酶学过程的研究起始 于20世纪50年代末。 催化RNA转录的酶称为依赖DNA的 RNA聚合酶（简称为RNA聚合酶）。 与DNA聚合酶不同，RNA聚合酶可 以自行发动RNA链的合成，因而不需要 引物，也没有转录物的校正功能，这也 与RNA代谢快，半衰期短的特点相适应。
二. RNA的结构与主要生理功能
RNA几乎总是线性单链的，极少有环状RNA分子。 但几乎每个RNA分子都有许多短的双螺旋部分，称为 发夹。 除了标准的GC和AU对之外，还有较弱的GU对可帮 助单链RNA形成二级结构。
一条正在延伸的RNA链的二级结构会影响这个RNA 分子的剩下部分的合成。
一个细胞中含有许多不同的RNA 分子，其长度为50个核苷酸到数万个核 苷酸不等。
不对称转录:模板链并非永远在同一单链上
′ 5 3′
3′ 5′
注意：RNA的合成方向都是5‟
3‟
对于不同的基因来说，其转录信息可以存 在于两条不同的DNA链上，即某条DNA单链对 某个基因是模板链，而对另一个基因则是编码 链。
如果DNA的两条链均作为RNA模板，则每个 基因必将产生两条互补的RNA。
而遗传学证明每个基因只合成了一条RNA链。 即使合成两条RNA链，其中也只有一条有功能。 事实上，在活体内只存在这两条RNA链中 的一条。
如将双链DNA加热使之变性，再加 入以此DNA为模板所合成的单链RNA， 进行退火。
结果除复性的DNA双螺旋外，还形 成了DNA-RNA杂种分子。
结果表明只有一条DNA链被转录。
按照传统的观点，RNA只是基因表 达的中间物——DNA将携带的遗传信 息转到RNA分子中，而RNA分子以其 信息指导蛋白质的合成——RNA的主要 功能是控制蛋白质的生物合成。
1981年Cech T发现四膜虫rRNA前体 能通过自我拼接切除内含子，表明RNA也 具有催化功能，称之为核酶。 随 后 Altman S 证 明 ， RNase P 中 的 RNA（M1 RNA） 在 适 当 条 件 下 （ 高 浓 度 Mg2+或存在多胺化合物）单独也具有加工 tRNA5′端的催化活性。
这一实验是第一次证明新加入的核 心酶可以利用从全酶中释放出来的σ亚基 ，重新启动新一轮的RNA转录，σ亚基是 可以重复使用的蛋白质因子 。
大肠杆菌σ亚基的种类
大肠杆菌的σ亚基主要为σ70。 其它细菌与大肠杆菌有类似的RNA 聚合酶，但是亚基数目和相对分子质量 可能有所不同。 不同的σ亚基有不同的DNA序列识 别专一性。
（二） RNA聚合酶对模板的选择
RNA聚合酶对模板的选择包含两层意思。 其一是不同的RNA聚合酶转录不同的基因， 合成不同的RNA。 其二是RNA聚合酶对DNA的两股链有选择性。
转录(transcription)的不对称性就是指 转录只以双链DNA中的一条链作为模板进行转 录，将遗传信息由DNA传递给RNA的现象。
模板链（template strand）及反意义链：
指导RNA合成的DNA链为模板链或Watson链 ， 又称为反（意）义链或负链（-链）；
编码链(coding strand)及有意义链：不指导 RNA合成的另一条DNA链为编码链（即非模板链 或CricK链 ），又称为有（意）义链或正链（+ 链）。
α亚基还直接与位于Sextama盒的 cAMP－CAP正控制调节因子结合，发动 RNA的转录。 有学者认为，它决定哪些基因被转录。
当噬菌体T4感染E.coli时，其α亚基 即在精氨酸上被ADP-核糖化。
这种修饰作用使该RNA聚合酶全酶对其 原先识别的启动子的亲和力减弱。 所以也有人认为，α亚基的功能可能 参与全酶和启动子的牢固结合。
4. β亚基
β亚基的相对分子质量约为16×104，是聚 合NTP，合成RNA链的主要亚基。 在组建成全酶后，β亚基会形成两个功能 位点： 其一为起始位点（I），对利福平表现敏感， 只能专一性地与ATP和GTP结合，这一特点也 决定了RNA的第一个核苷酸为A或G； 其二是延伸位点(E),对利福平不敏感，对 NTP没有专一性的选择，从而保证RNA链的延 伸。
第四章 RNA的生物合成
第一节
RNA的生物合成
一. RNA的生物合成 在生物界，RNA的生物合成有两种方 式。 一是RNA指导的RNA合成，即在酶 的作用下以RNA为模板合成核糖核苷酸 链的过程，此种方式常见于病毒。
二是DNA指导的RNA合成，即在酶的作用下 以DNA为模板合成核糖核苷酸链的过程，此为 生物体内的主要合成方式，称为转录 (transcription)。 转录产生的初级转录本是RNA前体（RNA precursor），需经加工过程（processing） 方具有生物学活性。
归纳起来，RNA的主要功能有以下几个方 面： 1. RNA在遗传信息的翻译中起着决定的作用。 2. RNA具有重要的催化功能和其他持家功能。 3. RNA转录后加工和修饰依赖于各类小RNA和 其蛋白质复合物。 4. RNA对基因表达和细胞功能具有重要调节 作用。 5. RNA在生物的进化中起重要作用。
其活性形式(全酶)为15S，由5种不同的多 肽链构成，按分子量大小排列分别为 β‟(160000),β(155000),σ(32000－92000), α(40000)和ω(9000)。
全酶形状为椭圆球形,可结合约60个核苷酸。
二）大肠杆菌RNA聚合酶的功能
1. 核心酶（core enzyme） 1969年，Richard Burgess和Andrew Travers采用SDS凝胶电泳技术从E.coli中 分离出构成原核生物RNA聚合酶的各个 亚基，证明核心酶是由两个α亚基和一个 β亚基，一个β‟亚基组成。 核心酶：全酶脱离σ亚基剩下的β„βα2 （ω）称为核心酶。
(三) 模板中信息连续性 在模板中，基因信息通常是不连续的。这 在真核生物中较常见。 在信息内部或者在信息之间，往往存在一 些不表达的插入顺序及间隔顺序。 这些插入顺序和间隔顺序一般可能与信息 顺序一起转录。
初生RNA中的插入顺序或间隔顺 序，有的在RNA转录后的“加工”过 程中被删除； 有一些间隔顺序被保留在mRNA 中，作为多顺反子mRNA合成蛋白质 时的“标点符号”，或在蛋白质合 成中起调控作用（例如，原核生物 mRNA中不同顺反子之间的间隔顺 序）。
核心酶与σ亚基结合构成了RNA聚合 酶的全酶。
由于σ亚基的结合，使全酶的构象发 生改变，全酶依靠特定的空间结构与启 动子特异的碱基序列发生专一性的结合， 负责RNA的转录起始。
Ekkenhard Bautz利用杂交竞争实验 （Hybridization－competition）证实： 由于有σ亚基的结合才赋予全酶识别 Sextama盒（R位点）、Pribnow盒（B位 点），选择并紧密与模板链发生特异性 结合的功能，在降低全酶与DNA的非专 一性结合力的同时增强与R位点、B位点 的专一性结合力。
尽管一种σ亚基可以起始大部分基因 的转录，但是仍然存在其它σ亚基，相对 分子质量分别为28×103、32×103、 38×103、54×103），以识别不同启动子， 诱导特殊基因的协调表达。 如在温度高达42℃时E.coli细胞内 σ32亚基被启用，与核心酶结合后，识别 17种以上的热激蛋白基因的特殊启动子， 表达热激蛋白以适应环境的改变。
也正是由于全酶与启动子的紧密结 合力，在保证了相对较高的发动转录效 率同时，也降低了RNA聚合酶的移动速 度。
只有当全酶完成转录发动后σ亚基离 开全酶，核心酶依靠与DNA的非专一性 静电结合力才能提高RNA链的延伸速度。
Travers和Burgess在体外利用E.coli的RNA 聚合酶的核心酶转录T4噬菌体的RNA，通过检 测[14C]ATP的放射性强度，以评价RNA的延伸 效率，通过检测[γ－32P]ATP，或[γ－32P]GTP 放射性强度，以评价RNA转录的起始效率，结 果发现在转录10min后加入RNA聚合酶核心酶， 可以明显检测到RNA转录的重新启动。
实验证明：在RNA聚合酶参与RNA合 成的系统中，若是缺少DNA模板，或者事 先用脱氧核糖核酸酶（DNase）处理，破 坏DNA模板，这个系统就不能合成RNA。
若在这个系统中补加DNA，或者使 源自文库Nase钝化，或分离除去DNase，这个系 统就能恢复合成RNA的正常功能。
新合成的RNA碱基顺序完全与该系统 中DNA的碱基顺序互补。 新生RNA即是模板DNA的互补体。 这说明，在RNA聚合酶参与的反应中， DNA不但能起动RNA的合成，而且它也能 决定RNA产物的全部碱基顺序。 另一方面，在DNA链上有许多可以构 成回文结构的对称顺序。它是转录调控 因子的识别信号。这都说明模板在转录 作用中所处的重要地位。
5’ 3’ 5’
模板链 （-链） 5’ 3’
5’
编码链 （+链）
编码链
5’…G C A G T A C A T G T C…3’ DNA 3’…c g t c a t g t a c a g…5’ 模板链 转录 5’…G C A G U A C A U G U C…3’ N… Ala Val 翻译 His Val …C mRNA 多肽链
（一） 大肠杆菌RNA聚合酶的结构、功能与基因
一） 大肠杆菌RNA聚合酶的结构
在 原 核 生 物 中 ， 所 有 类 型 的 RNA （ mRNA ， rRNA，tRNA）都由一种RNA聚合酶转录。
大肠杆菌的RNA聚合酶，具有很复杂的结构。
每分子RNA聚合酶除有两个α亚基外，其 余亚基均只有一个，故全酶（holoenzyme）为： α2β‟ βσω(465000) 。