蛋白质类药物的分离纯
如何认识蛋白质类药物纯度检测
如何认识蛋白质类药物纯度检测？
1 从蛋白质制剂中检测出少量的污染蛋白质是 很困难的。因为污染蛋白质的量可能低于很多 测定方法的检测下限。制剂中往往含有大量的 辅料。
2 当用一种方法测定蛋白质纯度时，可能有两 种或更多的蛋白质表现出相似的行为。这种类 似的行为可能会导致本来是混合物的样品也被 认为是均一物质的错误结论。
HPLC法应根据不同的纯化工艺选择不同的方法。 一般尽量采用与SDS- PAGE法原理不同的反相柱或其 他离子交换柱进行分析，而不主张用分子筛分析。在 质量标准中要说明采用的是什么性质的分析柱。如有 些产品不适合用反相柱，要说明原因。
1.3 毛细管电泳
毛细管电泳的方法简便、快速，灵敏度和 分辨率高，但价格昂贵，重现性差，尚未作为 常规检定。
与产品相关的杂质包括：
突变物、错误裂解的产品、二硫化物异构体、 二聚体和多聚体；化学修饰的形态：脱去酰氨 基的或氧化的形态、其他降解产物等。
4.1宿主细胞蛋白含量
概念: 宿主细胞蛋白质一般简称宿主蛋白，是指生产过
程中来自宿主或培养基的残留肽等杂质。基因工程 药物中的宿主蛋白含量，可用 ELISA法(enzymelinked immunosorbent assay)测定。
3 只用一种方法作为纯度试验的标准是很不 可靠的，必须选择多种测定纯度的方法。
最好的纯度标准是建立多种分析方法，从 等电点、相对分子质量、疏水性等不同的角度 来证明了蛋白质样品的均一性。
4 纯度最终取决于所用方法的类型和分辨力， 低分辨率方法检测合格的样品改用高分辨力方 法时就有可能证明它是不纯的。
3.3等电点测定 可以表征药物的理化性质和纯度 均一的重组蛋白质只有一个等电点，有时因加工 修饰等影响可出现多个等电点，但应有一定的范 围。所以等电点测定是控制重组产品生产工艺稳 定性的重要指标。
如何认识蛋白质类药物纯度检测
06
蛋白质类药物纯度检测技术发 展趋势与挑战
技术发展趋势分析
01
高效分离技术
随着蛋白质类药物的不断发展，对分离技术的要求也越来越高。高效分
离技术将成为未来蛋白质类药物纯度检测的重要发展趋势。
02
多维检测技术
多维检测技术能够同时获得蛋白质类药物的多个信息，如分子量、等电
点、序列等，有助于更全面地评估蛋白质类药物的纯度。
疫苗研发
蛋白质类药物在疫苗研发中发挥着重 要作用，如新冠病毒疫苗中的重组蛋 白疫苗。
蛋白质类药物纯度的重要性
01
02
03
保证药物安全性
高纯度的蛋白质类药物可 以减少杂质和污染物对患 者的危害，提高药物的安 全性。
保证药物有效性
高纯度的蛋白质类药物可 以保证药物的纯度和生物 活性，从而提高药物的有 效性。
病毒安全性
对于以病毒为载体的蛋白质类药 物，需对其携带的病毒进行安全 性检测。
不同蛋白质类药物的纯度检测指标差异
治疗性抗体药物
主要关注杂质如聚集体、宿主细 胞蛋白、残留DNA和RNA等。
重组蛋白药物
需关注杂质如未折叠或错误折叠的 蛋白、聚集蛋白、宿主细胞蛋白、 残留DNA和RNA等。
基因工程蛋白药物
便于质量控制
高纯度的蛋白质类药物便 于质量控制和监管，有利 于药物的研发和生产。
02
蛋白质类药物纯度检测方法
高效液相色谱法（HPLC）
总结词
高效、快速、准确
详细描述
高效液相色谱法是一种常用的蛋白质类药物纯度检测方法，具有高效、快速和准 确的特点。该方法利用不同蛋白质分子在固定相和流动相之间的分配平衡的差异 进行分离，并通过检测器对分离后的蛋白质组分进行定量和定性分析。
蛋白质类药物的分离纯
蛋白质类药物的制备方法简介
蛋白质类药物的制备方法主要包括基因工程技术、细胞培养 技术、蛋白质分离纯化技术等。
其中，蛋白质分离纯化技术是关键步骤，涉及多种分离纯化 方法，如沉淀法、色谱法、电泳法等。
02
蛋白质类药物的分离纯化技术
沉淀法
盐析法
通过加入适量的盐，使蛋白质在水中 的溶解度降低而析出。常用的盐有硫 酸铵、氯化钠等。
智能化分离纯化系统
将人工智能、机器学习等技术应用于蛋白质类药物的分离纯化过程， 实现自动化、智能化操作。
绿色环保技术
发展环保型的分离纯化技术，减少对环境的污染和能源的消耗，实 现可持续发展。
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在分离纯化过程中，要保持缓冲液的pH值 稳定，以维持蛋白质的稳定性和活性。
注意操作安全
低温操作
对于使用的一些危险试剂，如强酸、强碱 、易燃易爆物等，要严格遵守安全操作规 程。
在分离纯化过程中，尽量在低温环境下进 行，以减少蛋白质的降解和失活。
04
分离纯化过程中的质量控制与检 测
蛋白质含量测定
凯氏滴定法
分离纯化
根据分离需求选择适当的分离纯化方 法，如凝胶过滤、离子交换、亲和层 析等。
洗脱与收集
在分离纯化过程中，对目标蛋白质进 行洗脱和收集，确保纯度和回收率。
蛋白质复性
对于变性的蛋白质，需要进行复性处 理，以恢复其生物学活性和稳定性。
注意事项与安全措施
防止样品污染
保持pH值稳定
确保使用的所有试剂和仪器清洁无菌，避 免交叉污染。
通过滴定法测定蛋白质中的氮含 量，再根据特定的换算因子计算 蛋白质含量。
双缩脲法
利用蛋白质分子中的肽键与硫酸 铜等试剂发生显色反应，通过比 色法测定蛋白质含量。
重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。
本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。
据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。
由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。
但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。
因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。
90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。
本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。
生物制药中的蛋白质表达与纯化技术
生物制药中的蛋白质表达与纯化技术生物制药是指利用生物技术和生物制备技术生产药品。
蛋白质是重要的生物大分子，在生物制药中，利用蛋白质表达技术制备蛋白质药物已经成为制备生物制药的重要手段之一。
在蛋白质表达和纯化中，重要的问题是选择适合的表达载体和表达宿主细胞，以及优化表达条件，提高表达能力和质量。
此外，表达的蛋白质需要纯化和质量控制等关键步骤，以保证药品的安全有效。
蛋白质表达技术蛋白质表达技术是指利用基因工程技术将目标蛋白质的编码基因导入到表达宿主细胞内，通过转录和翻译等过程表达出目标蛋白质。
根据表达载体的不同，蛋白质表达技术可分为细胞自主表达和外源表达两类。
细胞自主表达是指目标蛋白质能够在宿主细胞自身的代谢和生理过程中产生和积累。
这种表达方式常见于真核细胞，例如酵母细胞、哺乳动物细胞等。
此外，还有一些原核细胞能够自主表达复杂蛋白质，如高等厌氧菌和嗜热菌等。
外源表达是指将目标蛋白质的编码基因插入到宿主细胞的表达载体中，通过改变细胞代谢和生理状态，促进目标蛋白质的表达。
目前，外源表达技术已经被广泛应用于生物制药领域。
外源表达常用的表达宿主细胞包括细菌、真菌、昆虫、植物和哺乳动物等。
在选择表达载体和表达宿主细胞时，需要考虑到许多因素，如表达载体的复制数目、启动子、选择标记、信号序列、表达宿主细胞的生长速度、生理状态、代谢途径等。
蛋白质纯化技术蛋白质纯化是指将从表达宿主细胞中获得的蛋白质经过一系列的分离、纯化和检测等步骤，去除不必要的成分和杂质，提高目标蛋白质的纯度和活性。
在纯化过程中，需要根据目标蛋白质的生化性质和物理性质选择不同的分离和检测手段，例如亲和层析、逆向层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、凝胶电泳等。
亲和层析是利用亲和基团与目标蛋白质相互作用，实现目标蛋白质的纯化。
通常，亲和基团可与目标蛋白质的某种生化或物理性质相互作用，例如其特异抗原性、活性或生物学功能等。
例如，利用亲和层析纯化抗体、酶或膜受体等蛋白质时，通常采用大量的亲和基团，如包括Ni2 +、酵母己糖、自旋素、脂肪酸酰化酶亲和基团等。
生物技术制药试题(打印版)
生物技术制药试题1. 生物技术制药:生物技术制药是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法进行药物制造的技术。
2. 基因表达:基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子.生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。
3. 质粒的分裂不稳定:通常将质粒不稳定性分为两类:一类是结构不稳定性,也就是质粒由于碱基突变、缺失、插入等引起的遗传信息变化;另一类是分离不稳定性,指在细胞分裂过程中质粒不能分配到子代细胞中,从而使部分子代细胞不带质粒(即P-细胞)。
在连续和分批培养过程中均能观察到此两类现象发生。
一般情况下具有质粒的细胞(即P＋细胞)需要合成较多的DNA、RNA和蛋白质,因此其比生长速率低于P-细胞,从而P-细胞一旦形成能较快速地生长繁殖并占据培养物中的大多数。
4. 补料分批培养:发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。
它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。
因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。
但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。
5. 人-鼠嵌合抗体:嵌合抗体（ chimeric atibody ）是最早制备成功的基因工程抗体。
它是由鼠源性抗体的 V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。
因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。
6. 悬浮培养:非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。
蛋白质分离和纯化技术的研究和应用
蛋白质分离和纯化技术的研究和应用蛋白质是生物体内最基本的分子，其担负着细胞结构与功能、物质转运、信号传递等重要生理功能。
由于生物样品中蛋白质种类众多、含量差异较大，为了深入揭示蛋白质的生物学功能和结构特性，必须对蛋白质进行精确分离和纯化。
本文将介绍蛋白质分离和纯化技术的研究和应用。
一、蛋白质分离技术蛋白质分离是指将复杂的蛋白质混合物进行分离，得到不同种类的纯化蛋白质的过程。
在蛋白质分离的基础上，再进行进一步纯化，能够更好地揭示蛋白质的生物学特性。
（一）凝胶电泳凝胶电泳是当前最常用的蛋白质分离技术之一。
它基于蛋白质的电荷、大小、形状和亲疏水性等性质，利用电场将蛋白质分子沿着凝胶移动，实现分子大小的分离。
凝胶电泳具有分离效果好、操作简单易行、样品消耗量小以及可视化等优点。
（二）液相色谱液相色谱（Liquid chromatography）是一种通过化学亲和性、分子大小、极性与非极性等属性分离物质的分离技术。
常用的液相色谱有透析液相色谱、醚基、硅烷基、反相、离子交换、凝胶过滤等类型。
其中反相色谱在蛋白质分离中尤为重要，它基于不同蛋白质在疏水性基质表面的分配系数不同，以蛋白质的亲水性为基础进行分离。
二、蛋白质纯化技术蛋白质纯化是指在获得蛋白质的基础上，通过不同的纯化技术去除其中的杂质，得到纯度高的蛋白质分子。
蛋白质的纯化技术主要分为两类：非特异性纯化和特异性纯化。
（一）非特异性纯化非特异性纯化是指利用物理化学性质对样品进行分步纯化，将目标分子与混杂物质逐步分离开来的方法。
常用的非特异性纯化技术有盐析、凝胶过滤和透析等。
其中，盐析技术是常用的一种非特异性纯化技术，它利用富集目标蛋白质对盐的结合能力高于混杂蛋白质的特性，将混杂蛋白质和目标蛋白质分离。
（二）特异性纯化特异性纯化是指通过蛋白质与配体、抗体等生物学活性团之间的特异作用进行分离纯化的方法。
常用的特异性纯化技术包括亲和层析、免疫亲和层析等。
其中，亲和层析是一种重要的特异性纯化技术，它通过识别目标蛋白质与固定于固相材料上的亲和基团之间的特异性互作来分离纯化蛋白质。
中国医科大学2015年1月考试《生物技术制药》考查课试题
中国医科大学2015年1月考试《生物技术制药》考查课试题答案转载请注明来自百度：百度文库-吴德高的专业作品
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一、论述题（共10 道试题，共50 分。
）
1. 悬浮培养
答：培养细胞的生长不依赖支持物的表面，可在培养液中呈悬浮状态生长。
2. 双功能抗体
答：它是非天然抗体，结合抗原的两个臂具有不同的特异性。
3. 连续培养
答：将种子接入发酵反应器中，培养至一定菌体浓度后，进行不间断的培养。
4. 单克隆抗体
答：是将抗体产生B淋巴细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合所产生的抗体。
5. 生物药物
答：指从生物体、生物组织、细胞、体液等，利用物理、化学、生物技术等原理和方法方法制造一类用于预防、治疗和诊断的制品
6. 固定化培养。
生物技术制药题库
生物技术制药题库生物技术制药是一种利用现代生物技术，借助微生物、植物、动物等生物体生产药品的技术。
其中，基因工程制药利用重组DNA技术生产蛋白质或多肽类药物，细胞工程制药则是利用动、植物细胞培养生产药物的技术。
酶工程制药则是将酶或活细胞固定化后用于药品生产，而发酵工程制药则是利用微生物代谢过程生产药物的技术。
抗体工程制药则利用抗原和抗体的特异性结合性质生产药物。
先导化合物是指通过优化药用、减少毒性和副作用，使其转变为一种新药的化合物。
生物药物则是利用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等学科的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。
细胞的生长形态可以分为贴壁细胞和悬浮细胞，其中贴壁细胞需要有贴附的支持物表面，依靠贴附因子生长。
兼性贴壁细胞则生长不严格依赖支持物。
牛痘病毒可以构建多价疫苗腺病毒，逆转录病毒则用于基因治疗，杆状病毒则用于外源基因表达。
生物碱是一种含氮有机化合物，而生理活性物质则对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用。
植物抗毒素是指在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物，有些时候连续合成，有些时候在被刺激下才会产生抗毒素，或仅在被诱导下其产量才能增加。
生物转化是利用生物离体培养细胞，固定化的植物（或微生物）细胞或从这些有机体中分离得到的酶等，对外源底物进行结构修饰而获得更有价值产物的一种技术。
抗体是B细胞在抗原的刺激下分化为浆细胞，产生具有与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。
免疫球蛋白具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，而多克隆抗体则由多个克隆细胞产生的针对多种抗原决定簇的混合抗体制剂，也称第一代人工抗体。
20、基因工程抗体是一种第三代抗体，利用DNA重组技术对抗体分子进行切割、拼接或修饰，或者直接合成基因序列，再将基因导入细胞表达产生的抗体。
21、药用酶是指可用于预防和治疗疾病的酶。
蛋白药物的制备及展望,参考文献
参考文献1蛋白药物的制备及展望材料科学与生命科学是21世纪最具发展潜力的2个学科，蛋药物的制备包括蛋白药物的分离纯化、制剂等均与这2个学科紧密相关。
这是因为一方面蛋白药物的分离纯化及制剂均需要各种新型的吸附分离功能材料及生物可相容、可降解、可吸收材料．另一方面蛋白药物的分离纯化给予生命科学的发展。
研究水平以及医疗水平的提高提供了坚实的物质基础。
随着科学与技术的不断发展以及人民对生活质量的要求在不断提高。
蛋白药物的制备必将发展成为21世纪我国最具吸引力的新技术产业之一。
1 蛋白药物的分离纯化方法：由于蛋白药物的种类非常多．目前使用的蛋白药物的分离与纯化的方法也非常多。
在实际操作中，使用的材料以及采取的分离与纯化的方法也是各不相同。
要根据具体选择的目标蛋白来决定．至于分离操作时所使用的条件，则更加千差万别。
一般地讲目前常用的从提取液或发酵液中分离纯化蛋白药物的方法大致有超滤、离心、沉降、萃取、电泳、膜分离、色谱分离等。
其中色谱分离技术是关键的一步，决定了最终产物的纯度。
目前生物制品的分离纯化的费用一般要占总生产成本的5O％以上。
对于基因工程药物．甚至要占到8O％～9O％，这是因为．在重组微生物或动物细胞培养液中提取药物要比传统抗生素的分离提取工艺复杂困难得多．其原因有以下几个方面： (1)提取液中的有效成分相对较低； (2)杂质含量较高； (3)对最终产品的纯度要求高。
在色谱分离中。
要根据分离不同的目标蛋白，选择使用不同的分离介质。
目前大部分分离介质来自国外，因此，如何制备分离介质，也给国内的企业提供了一些机遇．由于蛋白质本身的特异性，对色谱分离介质的选择有一些基本要求。
概括起来有以下几点：1、刚性：应该能够承受在较高流速时所产生的压力：2、亲水性：有些情况下疏水性的分离介质会使蛋白变性：3、孔径：有些蛋白分子体积较大，需要使用大孔径的分离介质才能达到较为理想的分离效果：4、粒径：均匀的粒径可以获得更好的柱效：5、容易衍生化：以便根据目标蛋白的不同，选择使用具有不同功能基的色谱固定相：6、稳定性：以便耐受操作过程不同pH的变化：7、毒性：防止在操作过程从外界引入毒性物质；8、特异性吸附：以便降低蛋白在分离纯化过程中的损失，提高收率；色谱分离时，由于使用的方法不同又可以分为：凝胶过滤层析(或体积排阻层析)、羟基磷灰石层析、离子交换层析、疏水作用层析、反相作用层析以及亲和层析等．各种层析方法的优缺点以及适用范围列于表1。
7.2 蛋白质与多肽类药物的制备
（3）生物状态：动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素 含量增加，对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素的分 泌使胆汁排空，对胆汁的收集不利。严重再生障碍 性贫血症患者尿中的EPO含量增加。
（4）原料来源：血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪 颚下腺中提取，而稳定性以颚下腺来源为好，因其 不含蛋白水解酶。 （5）原料解剖学部位：猪胰脏中，胰尾部分含激 素较多，而胰头部分含消化酶较多。如分别摘取则 可提高各产品的收率。 胃膜素以采取全胃粘膜为好，胃蛋白酶则以采取 胃底部粘膜为好，因胃底部粘膜富含消化腺。
目前试图合成大的蛋白质以及建立快速简便的合 成方法是多肽合成化学的特征。
在多肽合成中，一般需要以下几个主要步骤： ①氨基保护和羧基活化；
②羧基保护和氨基活化；
③接肽和除去保护基团。
三、 多肽类药物
（一）概述 活性多肽是生化药物中非常活跃的一个领域，生 物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺、组织器 官、分泌细胞和体液中产生或获得的。
（二）主要多肽类药物的制备
1、胸腺素（Thymocln） 胸腺激素制剂总的说来都与调节免疫功能有关。
（1）结构和性质 胸腺素组分5是由在80℃热稳定的 40~50种多肽组成的混合物，分子量在1000～15000之 间，等电点在3.5～9.5之间。 为了便于不同实验室对这些多肽的鉴别和比较，根 据它们的等电点以及在等电聚焦分离时的顺序而命名。 共分三个区域：α区包括等电点低于5.0的组分，β区包 括等电点在5.0～7.0之间的组分，γ区则指其等电点在 7.0以上者（此区内组分很少）。对分离的多肽进行免 疫活性测定，有活性的称为胸腺素。
等电聚焦电泳除了用于分离蛋白质外，也可用于 测定蛋白质的等电点。
2、根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质
蛋白质药物的稳定性与制备技术
蛋白质药物的稳定性与制备技术在现代医学领域，蛋白质药物正发挥着日益重要的作用。
从治疗癌症、糖尿病等严重疾病，到缓解自身免疫性疾病的症状，蛋白质药物为患者带来了新的希望。
然而，蛋白质药物的稳定性和制备技术却面临着诸多挑战，这些挑战直接影响着药物的疗效、安全性和市场应用。
蛋白质药物的稳定性是其研发和生产过程中至关重要的因素。
蛋白质是由氨基酸组成的大分子，其结构复杂且脆弱，容易受到多种因素的影响而发生变性、降解或聚集。
环境因素如温度、湿度、pH 值的变化，以及物理应力如搅拌、剪切等，都可能破坏蛋白质的三维结构，从而影响其生物活性。
此外，蛋白质还可能与容器表面、辅料等发生相互作用，导致稳定性下降。
温度对蛋白质药物的稳定性有着显著影响。
过高的温度可能导致蛋白质的热变性，使其失去原有的结构和功能。
例如，一些蛋白质药物在常温下可能会迅速降解，因此需要在低温条件下储存和运输。
湿度也是一个关键因素，高湿度环境可能促使蛋白质吸湿，进而引发水解反应或促进微生物生长。
pH 值的变化同样不容忽视。
蛋白质通常在特定的 pH 范围内保持稳定，偏离这个范围可能导致电荷分布的改变，影响蛋白质的折叠和稳定性。
例如，某些抗体药物在酸性条件下容易发生聚集。
物理应力对蛋白质药物的稳定性也有损害。
搅拌和剪切过程中产生的机械力可能使蛋白质分子伸展、断裂，从而影响其结构完整性。
除了外部环境因素，蛋白质药物自身的特性也会影响其稳定性。
蛋白质的纯度、氨基酸序列、翻译后修饰等都会对其稳定性产生影响。
例如，含有二硫键的蛋白质如果二硫键发生错误配对，就可能导致结构不稳定。
为了提高蛋白质药物的稳定性，研究人员采取了多种策略。
一方面，通过优化制剂配方，选择合适的辅料来稳定蛋白质的结构。
例如，使用糖类如蔗糖、海藻糖等作为保护剂，可以防止蛋白质在干燥或冷冻过程中的变性。
另一方面，采用先进的包装技术，如选择合适的容器材料和密封方式，减少外界因素对药物的影响。
在蛋白质药物的制备技术方面，也经历了不断的发展和创新。
生物药物的制备与质量控制习题集
生物药物的制备与质量控制习题集一、单项选择题（每小题2分共15题）1蛋白质类物质的分离纯化往往是多步骤的，其前期处理手段多采用下列哪类的方法。
（B ）A。
分辨率高B。
负载量大 C.操作简便 D.价廉2、下列药物哪些是重组 DNA 药物（B ）A.蛋白质工程药物B.基因药物 C。
天然生物药物 D。
半合成生物药物3、下列药物中属于糖类药物的是（ A )A。
甲壳素 B。
卵磷脂 C.肌苷酸 D.氯霉素4、4、冬虫夏草的入药部位为（ A ）A.虫体和子座 B。
子囊 C.孢子囊 D。
全草5.下列哪项不属于新型疫苗（ C ）A．亚单位疫苗B．合成肽疫苗 C．多联苗D．抗独特型抗体6.下列哪种方法是由于细胞内冰晶的形成导致细胞破碎的 ( C )A。
真空干燥 B. 酶解法 C. 冻融法 D。
渗透压法7。
某抗生素以醋酸丁酯为流动相进行 pH 纸层析，酸性条件下比移值大，碱性条下比移值小，则该抗生素为( B ） A。
弱碱性 B. 弱酸性 C.强碱性 D.强酸性8.从四环素发酵液中去除铁离子,可用（B ）A。
草酸酸化 B。
加黄血盐 C. 加硫酸锌 D. 氨水碱化9.用大肠杆菌作宿主表达重组 DNA 药物，缺点是（ C ）A.蛋白质表达量低B.生长慢C.产物无糖基修饰D.难以获得工程菌10.下列药物哪些是重组 DNA 药物 (B ）A.蛋白质工程药物 B。
基因药物 C.天然生物药物 D.半合成生物药物11.生物药物原料的保存可采取有机溶剂脱水法，常用的有机溶（D )A．甲醛B．酒精C．苯酚D．丙酮12。
选用110 树脂分离纯化链霉素，交换时 pH 应为（ C ）A．2～4 B。
4～6 C。
6～8 D. 12～1413.能够除去发酵液中钙、镁、铁离子的方法是（ C ）A. 过滤 B。
萃取C。
离子交换 D. 蒸馏14。
下列哪项不属于新型疫苗 ( C ）A．亚单位疫苗B．合成肽疫苗 C．多联苗 D．抗独特型抗体15。
利用产氨短杆菌发酵法生产肌苷酸,第一步是用诱变育种的方法筛选缺乏哪种酶的腺嘌呤缺陷型菌株，并在发酵培养基中提供亚适量的腺嘌呤。
请举四种蛋白质类制品分离纯化方法,并说明一下其原理
请举四种蛋白质类制品分离纯化方法,并说明一下其原理
以下是四种蛋白质类制品分离纯化方法及其原理的举例:
1. 盐析法：盐析法是利用蛋白质在不同盐浓度下溶解度的差异进行分离纯化。
具体来说，在蛋白质溶液中添加适量中性盐，使得蛋白质的溶解度降低并析出，从而达到分离纯化的目的。
这种方法的原理是蛋白质与盐离子形成复合物，且复合物的溶解度较低，因此在盐浓度较高时，蛋白质会沉淀出来。
2. 等电点沉淀法：等电点沉淀法是利用蛋白质在不同 pH 值下的等电点进行分离纯化。
具体来说，将蛋白质溶液调节至其等电点 pH 值，使得蛋白质失去电荷，形成稳定的沉淀，从而达到分离纯化的目的。
这种方法的原理是蛋白质在不同 pH 值下带电荷的数量不同，因此在等电点时，蛋白质会沉淀出来。
3. 低温有机溶剂沉淀法：低温有机溶剂沉淀法是利用蛋白质在低温下溶解度的差异进行分离纯化。
具体来说，将蛋白质溶液引入与水可混溶的有机溶剂中，使得蛋白质的溶解度降低并析出，从而达到分离纯化的目的。
这种方法的原理是蛋白质在水中的溶解度受温度和溶剂性质的影响，而在有机溶剂中，蛋白质的溶解度较低，因此可以分离纯化。
4. 亲和色谱法：亲和色谱法是利用蛋白质与配体之间的特异性结合进行分离纯化。
具体来说，利用具有特异性结合能力的载体，将待分离的蛋白质与载体结合，然后通过改变洗脱液 pH 值或离子强度等方法，将结合在载体上的蛋白质洗脱出来。
这种方法的原理是蛋白
质与配体之间的相互作用可以影响蛋白质的溶解度、电离性质等，从而进行分离纯化。
基因工程药物蛋白的分离纯化与质量控制
应首先选择能除去含量最多杂质的方法
应尽量选择高效的分离方法
应将最费时、成本最高的分离纯化方法安 排在最后阶段
合适分离纯化介质的选择
常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和 Sepharose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：
对目标蛋白具有较高的分离效率 对目标蛋白不会造成变性 化学性能和机械性能稳定，重复性好 价格低廉
(3) 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对
pH、温度、金属离子、 有机溶剂、剪切力、表
面张力等十分敏感，容易是其失活、变性；
(4) 种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或
(5)
复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各
异
(6)
的生物活性物质；
(5) 应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求
(6)
（2）原材料和培养基的来源及其质量；
（3）生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式 （连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工 艺控制条件因素几方式等；
（4）初始物料的物理、化学和生物学特性：包括产物浓 度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解 度、pH、黏度、流体力学性质和热力学性质。
发酵液 细胞分离
胞内产 物 细胞破碎 固液分离
包涵体 变性 复性
细胞碎片分离
胞外产 物
浓 缩 初步分离 高度纯化 制 剂
产品
基因工程药物分离纯化的一般流程
A 重组基因工程药物分离纯化方法选择 的基因原则
针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 合适分离纯化介质的选择 分离纯化过程的规模化
（2）病毒的去除：成品中必须检查是否含有病毒。 病毒最大的来源是由宿主细胞带入。经过色谱分离， 一般能将病毒除去，必要时也可以用紫外线照射使 病毒失活，或用过滤法将病毒去除。
蛋白质类药物的分离纯化方法
蛋白质类药物的分离纯化方法1. 引言大家好，今天咱们来聊聊蛋白质类药物的分离和纯化，听起来有点儿复杂，但其实这就像是做一道美味的菜，得先把食材洗干净，再好好烹饪。
蛋白质药物呢，在医学界可是个大明星，能帮助我们治疗各种疾病，比如癌症、糖尿病等。
但，要想把这些蛋白质从细胞中提取出来，绝对不是件容易的事儿！所以，我们今天就来看看这些“厨师”们是怎么把蛋白质做成药的，哎呀，话说得有点儿远了，咱们还是先从分离开始说吧。
1.1 蛋白质的提取提取蛋白质就像是捞面条，要把那细细的面条从汤里捞出来。
首先，我们需要破坏细胞壁，让里面的蛋白质“溜”出来。
这个过程一般使用化学方法，比如用某种溶剂，或者物理方法，比如超声波破碎。
经过这一步，蛋白质就像被捞出来的面条，漂浮在液体中，真是让人忍不住想尝一尝呢！1.2 初步分离提取之后，接下来就要进行初步分离了。
这个阶段主要是把提取的液体里的杂质去掉，比如脂肪、DNA、RNA等，这些可不是我们想要的“配菜”。
这里用到的方法有离心分离，就像把沙子和水分开那样，转一转，重的杂质沉到底，轻的液体则留在上面，真是妙不可言！2. 纯化过程纯化过程就是把蛋白质变得更“纯净”，就像精炼金子一样。
首先，我们可以使用“层析法”。
想象一下，层析法就像是在超市里挑水果，首先筛选出大的，再挑出好的，最后剩下的就是我们想要的蛋白质啦。
层析法有很多种，比如凝胶过滤层析、离子交换层析等，各有各的特点，就看你怎么选了。
2.1 凝胶过滤层析凝胶过滤层析就像是在过独木桥，桥面有不同大小的孔，蛋白质根据大小不同，会选择不同的路径。
大颗粒的蛋白质走得快，小颗粒的蛋白质则慢吞吞地挪，最终得到的就是一条“精致”的蛋白质之路。
2.2 离子交换层析再说说离子交换层析，这就像是在游乐园里玩过山车。
这里的蛋白质根据电荷的不同，互相“推来推去”。
有正电的和负电的蛋白质会互相吸引、排斥，最终留下的都是那些经过层层筛选的“勇士”，它们就是咱们的目标蛋白质啦！3. 验证与储存在完成了分离和纯化之后，我们得对这些蛋白质进行验证，看看它们到底是不是我们想要的。
生物分离与纯化技术模拟试卷十二答案
生物分离与纯化技术模拟试卷十二答案装订线一、名词解释（每小题3分，共15分）1．反渗透：在只有溶剂能通过的渗透膜的两侧，形成大于渗透压的压力差，就可以使溶剂发生倒流，使溶液达到浓缩的效果，这种操作成为反渗透。
2．树脂工作交换容量：单位质量干树脂或单位体积湿树脂所能吸附的一价离子的毫摩尔数称为树脂交换容量，在充填柱上操作达到漏出点时，树脂所吸附的量称为树脂工作交换容量。
3．两性树脂：同时含有酸、碱两种基团的树脂叫两性树脂4．流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或租临界体等，都称为流动相。
5．离子交换平衡：当正反应、逆反应速率相等时，溶液中各种离子的浓度不再变化而达平衡状态，即称为离子交换平衡。
二、单选题（每小题1分，共15分）1．其他条件均相同时，优先选用那种固液分离手段（B ） A. 离心分离 B 过滤 C. 沉降 D.超滤2．人血清清蛋白的等电点为4.64，在PH 为7的溶液中将血清蛋白质溶液通电，清蛋白质分子向（A ）A ：正极移动；B ：负极移动；C ：不移动；D ：不确定。
3．影响电泳分离的主要因素（B ）A 光照B 待分离生物大分子的性质C 湿度D 电泳时间4．当向蛋白质纯溶液中加入中性盐时，蛋白质溶解度 （ C ）A 、增大B 、减小C 、先增大，后减小D 、先减小，后增大5．关于用氢键形成来判断各类溶剂互溶规律，下列（A ）项是正确的叙述。
A 、氢键形成是能量释放的过程，若溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。
B 、氢键形成是能量吸收的过程，若溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。
C 、氢键形成是能量释放的过程，若溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。
D 、氢键形成是能量吸收的过程，若溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。
6．反渗透膜的孔径小于( C )A 0.02～10µmB 0.001～0.02µmC <2nmD < 1nm7．凝胶层析中，有时溶质的Kd>1，其原因是（ B ）A 、凝胶排斥B 、凝胶吸附C 、柱床过长D 、流速过低8．在选用凝胶层析柱时，为了提高分辨率，宜选用的层析柱是 （A ）A 、粗且长的B 、粗且短的C 、细且长的D 、细且短的9．在萃取液用量相同的条件下， 下列哪种萃取方式的理论收率最高 （ C ）A.单级萃取B.三级错流萃取C.三级逆流萃取D.二级逆流萃取10．用大孔树脂分离苷类常用的洗脱剂是（B ）A 、水B 、含水醇C 、正丁醇D 、乙醚E 、氯仿11．不能用于糖类提取后的分离纯化的方法是（B ）A 、活性炭柱色谱法B 、酸碱溶剂法C 、凝胶色谱法D 、分级沉淀法E 、大孔树脂色谱法12．分离纯化早期，由于提取液中成分复杂，目的物浓度稀，因而易采用 （ A ）A 、分离量大分辨率低的方法B 、分离量小分辨率低的方法C 、分离量小分辨率高的方法D 、各种方法都试验一下，根据试验结果确定13．气相色谱柱主要有（C ）。
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溶液中，运动粒子与溶液之间存在阻力F阻：
F阻 6rV 当F引=F阻时：EQ 6rV
V EQ
6r
V EQ
6r
● 粒子泳动速度V与场强E、粒子电量Q成正比；
● V与粒子半径r、溶液粘度η成反比； ● V与粒子形状有关。
非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受 到更大的阻力。
电泳过程示意图
• 蛋白质-SDS复合物的电荷密度趋于一致。 • 不同蛋白质-SDS复合物形状相似（长椭球状）。 • 电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合
物的大小，即取决于蛋白质分子量的大小， 而
与蛋白质原来所带电荷量无关。
测定蛋白质分子量
• 当蛋白质分子量为17,000～165,000时，复合物电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈 线性关系：lgMW=lgK－bm
阳离子 pH<pI
O HH+
NH
+ 3
Pr COO-
兼性离子
pH=pI
O HH+
NH 2 Pr COO-
阴离子
pH>pI
利用蛋白质两性电离的性质，可通过电 泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋 白质。
② 蛋白质的胶体性质
蛋白质分子量很大，分子粒径为1～100nm， 属亲水胶体在水中能形成稳定胶体溶液。蛋白质 分子表面的水化膜和表面电荷是稳定亲水溶胶的 两个重要因素。
（沉淀）
（疏水胶体）
蛋白质的非变性沉淀
● 沉淀过程中，蛋白质结构和性质都不发生变化， 在适当条件下，可以重新溶解形成溶液。
● 是分离、纯化蛋白质的基本方法。如：等电点 沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等。
● 去除变性因素后，恢复原有空间构象和生物活 性。
核糖核酸酶可逆变性
天然状态， 有催化活性
尿素或 2-巯基乙醇
③ 蛋白质的沉淀
• 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、 所
带的电荷和水化作用有关。 • 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 • 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出 来蛋白质沉淀——
蛋白质的肽链相互聚集，从溶液中析出。
蛋白质胶体颗粒的沉淀
+
+
+
+
+ ++
---
-
-
- --
（疏水胶体）
2）蛋白质的分离纯化方法
盐析 电泳 透析 层析 分子筛 超速离心
① 盐析（Salting out)
定 义：加入大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并 使从溶液中沉淀析出的现象。
原 理：破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层。 中性盐：(NH4ห้องสมุดไป่ตู้2SO4；Na2SO4；NaCl等。
优 点：Pr不变性，常用。
CH2=CH
N, N’-甲 叉 双丙烯酰胺
常规聚丙烯酰胺凝胶电泳主要特点
凝胶由上、下两层凝胶组成
上层——大孔径浓缩胶，浓度2～3％；
下层——小孔径分离胶，浓度5～15％； 缓冲液中主要阴离子——Gly-, Cl-； 凝胶pH不同
电极缓冲液——pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液； 浓缩胶——pH6.8的Tris-HCl缓冲液； 分离胶——pH8.9 的Tris-HCl缓冲液； 三种物理效应——样品浓缩效应，凝胶分子筛效应， 电荷效应。
MW —— 蛋白质分子量； m —— 相对迁移率； K —— 常数； b —— 斜率 。
② 电泳（electrophoresis)
定义：带电粒子在电场力作用下向着所带电荷相 反方向泳动的现象叫电泳。
原理：
● Pr分子在溶液中可带净负电荷或净正电荷，可在电场中移动。
● 不同Pr分子携带电荷量不同，分子大小也
不同，可彼此分离。
不同，故在电场中泳动速度
电场中，带净电荷Q的粒子所受电荷引力：
溶解性
决定离子交换种类
选择不同孔径的介质 与疏水、反相介质
决定亲和配基 决定分离体系及蛋
① 两性解离与等电点
蛋白质分子中存在游离氨基和羧基，具有两 性解离性质。
当蛋白质溶液处于某pH时，蛋白质分子解离 成正、负离子的趋势相等，净电荷为零，此时溶 液pH称为蛋白质的等电点pI。
NH
+ 3
Pr
COOH
SDS的作用原理
• 阴离子SDS能与蛋白质结合。 • 当SDS总量为蛋白量的3～10倍、且SDS单位浓度大于1mol./L时，两者的结合是定
量的，每克蛋白质约结合1.4克SDS。 • 蛋白质分子结合SDS后，所带负电荷的量远远超过其原有电荷量，从而消除了不
同种类蛋白质间电荷负荷的差异。
SDS的作用原理
A. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）
以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。
聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，有弹性，透明，
化学性质稳定，对pH和温度变化小，吸附和
电渗作用小，是很好的电泳支持介质。
丙烯酰胺——单体 N，N’-甲叉双丙烯酰胺——交联剂
四.生物药物的制备 3.蛋白质类药物的分离纯化方法
生产过程
上游构建 （基因工程）
发酵生产 (发酵工程)
纯化制备
蛋白质的分离纯化
● 来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞； ● 分离和纯化过程都必须在温和条件下进行。
1）蛋白质的基本特性
产物特性
作用
等电点 及条件
相对分子量
疏水性 结合的程度
生物特异性
催化合成
CH2=CH C=O NH2
丙烯酰胺
CH2-CH (CH2¯ CH)n CH2-CH ( CH2-CH)m
C=O
C=O
C=O
NH2
NH
NH2
CH2
NH
CH2-CH ( CH2-CH)n
C=O CH2-CH ( CH2-CH)m
C=O
C=O
NH2
NH2
CH2-CH CH2-CH
聚丙烯酰胺
CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O
——分离效果好，分辨率高。
Tris-HCl pH=6.8 T=3%
Tris-Gly pH=8.3
Tris-HCl pH=8.9 T=7.5%
Tris-Gly pH=8.3
板状电泳
B. SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳
当电泳体系含有十二烷基硫酸钠（SDS）时,电泳 迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，可直接 由电泳迁移率计算蛋白质分子量。
去除 变性因素
非折叠状态， 无活性， 二硫键被还原
天然状态， 二硫键恢复， 而且正确配对
蛋白质的变性沉淀
•在强烈沉淀条件下，蛋白质胶体溶液的稳定性、 蛋白质分子结构和性质均被破坏，沉淀不能重新 溶解于水。 •由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变 化，所以是变性沉淀。 •加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀、生物 碱沉淀等都属于不可逆沉淀。