第三章 菌种选育的理论与技术

自然突变有两种情况，一种是生产上所不希望有的，表 现为菌种的衰退和生产质量的下降；另一种是对生产有 益的。为此，为了确保生产水平不致下降，生产菌株经 过一定时期的使用后须纯化，淘汰衰退的；保存优良的 菌种。这就是通常所指的菌株的自然分离。
自然选育是一种简单易行的选育方法，它可以达到纯化 菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量的目的。 但是自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生 产水平大幅度的提高。因此，经常把自然选育和诱变育 种交替使用，这样可以收到良好的效果。
3 ．吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全 中断。
4 ．紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体 巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的 缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。
二、诱变育种步骤
•出发菌株的选择
•处理菌悬液的制备
•诱变处理
•中间培养
•分离和筛选
(一)出发菌株的选择
1 ．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较 敏感，容易达到好的效果。
3 、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须 非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且 切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感， 甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。
诱变剂的选择
1．碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使 用，回复突变率高，效果不大。
2．亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损 伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为 “超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变 剂之一。
操作步骤： 1 ．将细菌培养液以 3000r ／ min 离心 5min ，倾去 上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗 涤。 2 ．将菌悬液放入一已灭菌的，装有玻璃珠的三角 瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性 滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一 般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达 108 个／ ml 左右，作为待处理菌悬液。
2015/9/23
采样
平板分离
增殖培养
或
原种斜面
或
平板分离
原种斜面
复筛
原种斜面
增殖培养
平板分离
平板分离
原种斜面
原种斜面
定性或 半定量 测定
再复筛
初步工艺条件摸索
初筛
较优菌株
进一步的生产性能试验和毒性试验
新菌种选育基本过程
第三节
诱变育种
以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机 率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-610-10左右。
(二)操作步骤 1．单孢子悬液制备 取 斜 面 ， 加 入 6ml 0.1mol/L pH6.0的磷酸缓冲液，用接种环刮下 孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由 此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓 度可达106个/ml，此为待处理孢子悬液。 2．MNNG溶液的制备 用分析天平称取2mg， 加入2ml 0.1mol/L pH 6.0磷酸缓冲液，于暗 处振荡溶解。
3．诱变处理 吸取MNNG溶液lml，加入到 1m1孢子悬液中，30℃振荡30min，立即稀 释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个 稀释度分离培养，30℃ 3天后计数。 4．死亡率计算 将未处理的孢子液1ml加入 1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离， 30℃下培养3天。根据处理前后的活孢子数可 计算出死亡率。 5．挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选。
诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今 为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。
一、诱变剂和诱变处理
物理诱变剂：射线如紫外线、 X— 射线、 γ— 射线，快中子；
物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的 是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线， 对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安 全。
其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿 透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用， 否则有一定危险性。
化学诱变剂：
化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。
化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。 使用化学诱变剂的优缺点：
1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射 更有效。
2 、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的 合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿， 一个蒸气罩。而用电离辐射进行工作时，设备 费用大，并要注意安全性。
F-菌株， F+ 菌株
吖啶橙处理
F- 菌株
Hfr菌株，可通过 F+ 菌株和 F-菌株杂交获得。
方法：将A平皿上的F+ 菌株菌落影印到铺有F-菌株的基
本培养基B平板上，经培养后，在B平皿上因个别细胞杂 交而出现重组体菌落，这样就可以在 A平皿上的相应位 置上获得Hfr菌株。 2.杂交的方法
方法：
让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小 时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几 代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异 就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养， 直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞 同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落， 以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。
(五)分离和筛选
筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到 初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。 因此在具体方法上就有差异。 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物 与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈 的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。 在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的 菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶 段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。
2 ．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较 相像，也是良好的出发菌株。 3 ．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多 次诱变能积累较多的提高。 4．出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理 比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。
5 ．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细 胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大 部分是隐性的，特别是高产基因。 6 ．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱 变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理 会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱 变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞； 有的作用于休止期，就可选用孢子。
(二)处理菌悬液的制备
这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、 活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的 培养，并要离心，洗涤，过滤。
(三)诱变处理
根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍， 结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。
(四)中间培养
由于在发生了突变尚未表现出来之前，有 一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀 释过程( 生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将 突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和 获得稳定菌株都是极为重要的。
第三，通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递 规律，丰富并促进遗传学原理的发展。
微生物杂交育种基本程序
微生物杂交育种一般程序：
选择原始亲本 直接亲本之间亲和力鉴定 杂交
分离到基本培养基或选择培养基培养
重组体分析鉴定
筛选重组体
亲本选择
标记 亲和力
亲本标记和亲和力测定 A+ B+ CD-
双亲本杂交
重组及重组体分离
亲株A
亲株A
A+ B+ C+ D+
A标记 BC+ 亲和力 D+
பைடு நூலகம்
亲株B
亲株A 微生物杂交程序
二、细菌杂交育种
（一）细菌接合与F性因子 供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞向受 体细胞转移的过程。 Conjugation is the mechanism by which genetic material is transferred between two cells by plasmids.
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自然选育（自然分离）的一般程序，是把菌种制备成单 孢子悬浮液，经过适当的稀释以后，在固体平板上进行 分离，挑取部分单菌落进行生产能力的测定，经反复筛 选，以确定生产能力更高的菌株代替原来的菌株。 自然选育的菌种来源于自然界、菌种保藏机构或生产 过程，从自然界中选育菌种的过程较为复杂，而从生产 过程或菌种保藏机构得到菌种的自然选育过程较为简单。 因此，下面以从自然界中选育菌种的过程为例，阐述菌 种自然选育的主要步骤。 其具体做法一般分为四个步骤：样品采集、增殖培养、 纯种分离和筛选等。如果产物与食品制造有关，还要对 菌种进行毒性鉴定。
（二）细菌杂交方法与技术
1.杂交亲本菌株选择、标记菌株和性别菌株的获得 （1）杂交亲本菌株——根据试验选择不同遗传特性的两亲本菌 株，并且要带一定选择性标记和非选择性标记。这些携带有一 定选择性标记和非选择性标记而用于杂交配对的菌株为直接亲 本。 （2）标记菌株——最常用的标记为营养缺陷 （3）性别菌株的获得 F+菌株， F+ × FF+
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F因子的特性 ①F因子可以转移； ②F因子可自发失去； ③F因子可经吖啶橙等处理而失去； ④F因子一旦消失不能再现，除非与另外的F+细 胞接触而获得； ⑤F因子可自体复制 F因子的存在状态 自主态：含有自主态F因子的细胞叫F+细胞 整合态：含有整合态F因子的细胞叫Hfr细胞


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F因子的四种细胞形式
本章内容
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 概述 自然选育 诱变选育 杂交育种 原生质体融合育种
第一节 概述
菌种选育的意义：

提高产量 改进菌种性能 产生新的发酵产物 去除多余组分
第二节 自然育种 概念：


在生产过程中，不经过人工诱变处理，利用 菌 种 的 自 然 突 变 （ Spontaneons Mutatiton）而进行菌种筛选的过程，称为 自然选育或自然分离。 自然突变就是指某些微生物在没有人工参与 下所发生的那些突变。称它为自然突变绝不 意味着这种突变是没有原因的。
5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三 角瓶内装30ml培养液)，120r/min振荡培养 4～6h。
6．取中间培养液稀释分离、培养。 7．挑取菌落进行筛选。
亚硝基胍诱变曲霉菌
N— 甲 基 —N'- 硝 基 -N- 亚 硝 基 胍 (NGN ， MNNG 或 TG) 对真核或原核微生物都有强烈的 诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据 认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下 生成亚硝酸，直接作用于细胞内的 DNA复制系 统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH 的升高而增强。
3 ．取 2 ～ 4m1 制备的菌液加到直径 9cm 培养皿内， 放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、 15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫 外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式 在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行， 或用黑纸包住，避免白炽光。
4．取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进 行稀释分离，计数活菌细胞数。
a）F+菌株，
F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。
b）F-菌株，
不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收 F因子而变成雄性菌株（F+）；
c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。
d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因 子。 细胞表面同样有性菌毛。
第四节 杂交育种
一、杂交的意义
第一，通过具有不同遗传性状菌株的杂交，使遗 传物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物 质基础，扩大变异范围，使两亲株的优良性状集 中于重组体内，获得新品种。
第二，通过杂交后获得具有新遗传特性的重组体， 不仅可克服因长期诱变造成的生活力下降，代谢 缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降 低对诱变剂的“疲劳”效应。
紫外线的诱变育种
紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长 为 253.7 nm 。 灯 与 处 理 物 的 距 离 为 15 ～ 30cm ，照射时间依菌种而异，一般为几秒至 几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示， 希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。
被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左 右，霉菌孢子和酵母细胞为 106～ 107个/ml。 由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深， 约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手 工进行搅拌，使照射均匀。 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时 和照射后的处理应在红灯下进行。