16s_rdna菌种鉴定
16S_rDNA鉴定细菌地方法
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个局部：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进展PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
试剂：培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基〔培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进展洗涤。
〕。
1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)〔1L〕：121.1g Tris，加浓盐酸约〔70ml, 60ml, 42ml〕pH大约下降0.03个单位。
(Tris-HCl缓冲液〔0.05mol/L，25Tris〕溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一) 0.5M EDTA〔pH8.0〕〔1L〕：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0〔约20g〕,高温高压灭菌，室温保存。
(配置方法 1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。
2. 参加约800mL的去离子水，充分搅拌。
3. 用NaOH调节pH值值8.0〔约20g NaOH〕。
注意：pH值至8.0时，EDTA才能溶解。
4. 加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。
6. 室温保存。
〕1.4 10×TE Buffer(缓冲液〕(pH7.4，7.6，8.0)〔1L〕：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl〔pH7.4，7.6，8.0〕取100ml，0.5M EDTA〔pH8.0〕取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
1.5 10%SDS〔W/V〕：称10gSDS，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
16S鉴定细菌的种属 ppt课件
检测：核酸蛋白仪/琼脂糖凝胶电泳
1525R 5' AAG GAG GTG WTC CAR CC 3'
试剂使用量（ 20μL体系）
PCR 反应条件
模板DNA （10ng~100ng） Taq 酶(5U/μL) 10×Taq Buffer(Mg2+) dNTPs(2.5mM) 引物F(10 μM) 引物R(10 μM) ddH2O
2μL 0.2 μL 2 μL 1 μL 0.5 μL 0.5 μL 13.8 μL
1min30s
判断16Sr DNA序列扩增是否成功:经琼脂糖凝胶电泳在1500 bp附近 出现条带，说明16s rDNA已经扩增成功。
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16S rDNA鉴定细菌的种 属
1.什么是 16S rDNA？ ➢ 16SrRNA为原核生物核糖体RNA的一个亚基，16SrDNA就是编
码该亚基的基因。 ➢ 原核生物的rRNA含有3种类型：23S、16S、5S rRNA，它们分别
含有2900、1540和120个核苷酸。
2.用16S rDNA进行细菌鉴定的原因 ➢ 16S rDNA在原核生物中普遍存在。 ➢ 16 S rDNA的相对分子量大小适中，约1500 bp，便于序列分析。 ➢ 在16S rRNA分子中， 既含有高度保守的序列区域，又有中度保
守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类 生物亲缘关系的研究。 bp=base pair
16SrDNA鉴定菌株地实用标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA 的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well ThermalCycler ； 凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB3130 3.2 试剂DNA 快速提取试剂：PrepMan Ultra ；琼脂糖；PCR 试剂：Taq 酶，10×Taq Buffer(Mg 2+)，dNTPs ，ddH 2O 等； ExoSAP-IT ；测序试剂：BigDye Terminator ，5×Sequencing Buffer ；BigDye XTerminator Purification Kit ； 3.3 耗材移液器吸头：1000μL 、200μL 、10μL ；离心管：1.5mL 、200μL ；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate ；Micro Amp TM Optical Adhesive Film ； 3.4 引物16SrDNA 名称 序列扩增长度 第1部分正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 500 bp 左右反向引物519R 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3' 第2部分 正向引物357F 5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 750bp 左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3' 第3部分 正向引物926F 5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3' 560 bp 左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'4. 操作流程5. 实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
16srDNA鉴定微生物原理PPT课件
定义
分类
0 3 16s rDNA鉴定细菌原理
16s rDNA鉴定细菌原理
33％
16s rDNA简介
66％
鉴定原理
100％
鉴定步骤
定义：
16srDNA（16SrRNA为核糖体的RNA 的一个亚基16SrDNA就是编码该亚基的 基因。）鉴定是指用利用细菌16srDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
小的扩增子大小可能是优选的
（核苷酸986-1043）尽管V6区域长度仅为58bp，但它显示出相当大的序
V6
列可变性，并能够区分大多数细菌物种，V6是用于区分炭疽芽孢杆菌和
蜡状芽孢杆菌的测定的最佳靶区域。
（核苷酸576-682,822-879,1117-1173和1243-1294）这四个高变区，特 V4、5、 别是V5，由于与其他高变区相比具有更高程度的序列保守性，因此不太 7、8 适合物种鉴定。这可能导致灵敏度较低的测定，因为针对该区域设计的
作用：科学家认为这些跨物种的相似性 证明了某个特殊的基因完成了一些许多 生命形式所必须的基本功能，因此在进 化过程中保留了这些序列。 保守序列区域反映了生物物种间的亲缘 关系，16S rDNA分子的序列特征为不同 分类级别的近缘种系统分类奠定了分子 生物学基础。
鉴定原理
高变区
细菌16S核糖体RNA（rRNA） 基因含有9个“高变区”（V1V9），其在不同细菌中表现出相 当大的序列多样性。没有一个区 域可以区分所有细菌;因此，需要 进行系统研究，比较每个区域对 特定诊断目标的相对优势。
感谢聆听，批评指导
汇报人：王伟
球菌。V2似乎也是区分分枝杆菌属的最佳靶标。V2具有100bp的平均长
度，这是DNA探针的相对大的靶区域。
16SrDNA鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂：1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，O等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator ddH2Purification Kit；3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well ReactionPlate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；3.4引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'500 bp左右反向引物519R5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3'750bp左右反向引物1115R5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3'第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1 4.操作流程5.实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
16S_rDNA鉴定细菌地方法
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个局部：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进展PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
试剂：培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基〔培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进展洗涤。
〕。
1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)〔1L〕：121.1g Tris，加浓盐酸约〔70ml, 60ml, 42ml〕pH大约下降0.03个单位。
(Tris-HCl缓冲液〔0.05mol/L，25Tris〕溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一) 0.5M EDTA〔pH8.0〕〔1L〕：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0〔约20g〕,高温高压灭菌，室温保存。
(配置方法 1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。
2. 参加约800mL的去离子水，充分搅拌。
3. 用NaOH调节pH值值8.0〔约20g NaOH〕。
注意：pH值至8.0时，EDTA才能溶解。
4. 加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。
6. 室温保存。
〕1.4 10×TE Buffer(缓冲液〕(pH7.4，7.6，8.0)〔1L〕：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl〔pH7.4，7.6，8.0〕取100ml，0.5M EDTA〔pH8.0〕取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
1.5 10%SDS〔W/V〕：称10gSDS，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
用16S rDNA方法鉴定细菌种属
用16S rDNA 方法鉴定细菌种属一、实验目的1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。
二、实验原理细菌rRNA （核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。
16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。
16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA 含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。
在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S 、16S 、23S rDNA 的拷贝数相同。
16S rDNA 由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：细菌基因组的提取：PCR 的基本原理 ：PCR 技术的基本原理 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
16S鉴定细菌的种属精品PPT课件
特异引物扩增１６ＳｒDNA序列：这个过程一般先用Primer Premier 来设计引物，接下来在利用PCR进行特征序列的扩增。如果是乳酸菌 可以用通用引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1495r： 5′- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。以下是我已Enterococcus KLDS 6.0610的16SrDNA为例设计的引物
验证ＰＣＲ产物 扩增是否成功
选取近似菌种序列 构建系统发育树
与数据库中已知 细菌比较获得样品
种属信息
ＤＮＡ测序获得 １６ＳｒＤＮＡ序列
4
1.弃尽培养液，向培养皿中加入650 μl的Solution A，室温静置1分钟。 2. 用移液枪的取650 μl的细胞悬浮液转移至Collection Tube中。 3.加入0.8 μl的RNase A1，激烈振荡15秒钟，然后室温静置1分钟。 4. 弃去上层有机相，再加入1 ml的4℃预冷的Solution C充分混匀后12,000 rpm离心2分钟 5. 弃去上层有机相，然后将水相溶液转移至置于Collection Tube上的Filter Cup中 6. 弃Filter Cup，在滤液中加入400 μl的DB Buffer，混合均匀。 7. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作6混合溶液转移至 Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。 8. 将500 μl的Rinse A加入至Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 9. 将700 μl的Rinse B加入至Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 10. 重复操作步骤9。 11. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入 50～200 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。 12. 12, 000 rpm离心1分钟洗脱DNA。
16SrDNA方法鉴定细菌种属1
16SrDNA方法鉴定细菌种属116S rDNA方法鉴定细菌种属一．目的1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。
二、原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。
因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。
随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
1、16S rRNA 普遍存在于原核生物中。
rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。
2、在16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。
16s rDNA鉴定微生物原理.ppt
0 2 微生物定义、分类
微生物是个体难以用肉眼观察的 一切微小生物的统称。
微生物定义、分类
微生物包括：细菌、病毒、真菌以及一 些小型的原生生物、显微藻类等在内的 一大类生物群体，它个体微小，与人类 关系密切。
微生物划分为以下8大类：细菌、病毒 、真菌、放线菌、立克次体、支原体、 衣原体、螺旋体。有些微生物是肉眼可 以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等 。还有微生物是一类由核酸和蛋白质等 少数几种成分组成的“非细胞生物”， 但是它的生存必须依赖于活细胞。
谢谢
感谢聆听，批评指导
汇报人：王伟
• 9、春去春又回，新桃换旧符。在那桃花盛开的地方，在这醉人芬芳的季节，愿你生活像春天一样阳光，心情像桃花一样美丽，日子像桃子一样甜蜜。 2020/12/102020/12/10Thursday, December 10, 2020
• 10、人的志向通常和他们的能力成正比例。2020/12/102020/12/102020/12/1012/10/2020 7:36:12 AM
16srDNA是细菌染色体上编码 16srRNA相对应的DNA序列，存在于所 有细菌染色体基因中。
16s rDNA简介
01
02
16S rRNA与16S rDNA的区别
16S中的"S"是一个沉降系数，亦即反映生 物大分子在离心场中向下沉降速度的一个 指标，值越高，说明分子越大。 rDNA 和 rRNA中的小写字母"r"是ribosome(核糖体) 的缩写。 rDNA指的是基因组中编码核糖体 RNA（rRNA）分子的对应的DNA序列，也 就是编码16S rRNA的基因。 rRNA指的是 rDNA的转录产物，它是构成核糖体的重要 成分，核糖体由许多小的rRNA分子组装而 成，16S rRNA是其中一个组件. 一般所分析 的对象都是16s rDNA，因为DNA提取容易， 也比较稳定。。
菌种鉴定的分子生物学方法
菌种鉴定的分子生物学方法——16S rDNA 测序鉴定菌种一． 原理细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA 。
5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。
而16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。
在细菌的16SrDNA 中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA 片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA 互补，而细菌的16S rDNA 可变区的差异可以用来区分不同的菌。
因此，16SrDNA 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。
随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA 序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
二． 技术路线该方法包括细菌基因组DNA 提取、16S rDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
具体技术路线如下：三． 方法步骤（一）细菌基因组DNA 提取（酶解法）1. 挑取单菌落接种到10 mL LB 培养基中37℃振荡过夜培养。
细菌培养液基因组DNADNA 提取PCR 扩增16S rDNA 片段片段回收连接克隆载体阳性克隆鉴定 测序2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
16S_rDNA鉴定细菌的方法
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂：1.1 培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高pH大约下降0.03个单位。
(Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）50ml 0.1mol/LTris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
(配置方法1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。
2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌。
3. 用NaOH调节pH值值8.0（约20g NaOH）。
注意：pH值至8.0时，EDTA才能溶解。
4. 加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。
6. 室温保存。
）1.4 10×TE Buffer(缓冲液）(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
用16SrDNA方法鉴定细菌种属
用16S rDNA 方法鉴定细菌种属一、实验目的1。
掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。
二、实验原理细菌rRNA(核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。
16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。
16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法.16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟,其种类少,含量大(约占细菌RNA 含量的80％)，分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称.在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S 、16S 、23S rDNA 的拷贝数相同。
16S rDNA 由于大小适中，约1。
5Kb 左右,既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难,因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌,其技术路线如下：细菌基因组的提取：PCR 的基本原理 :PCR 技术的基本原理 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。
PCR 由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离,使之成为单链，以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火（复性):模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料,靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火——延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
细菌16SrDNA测序鉴定
细菌16SrDNA测序鉴定一、细菌总DNA提取二、16SrDNA的扩增1、以单菌落或菌悬液为模板的16SrDNA扩增体系25ul体系Buffer(含有Mg2+)：2.5 uldNTP：2.5 ul：3，-primer：0.5ul5，-primer：0.5ul模板：1个单菌落（或1 ul在LB培养液中37℃，12h的菌悬液）吐温20：2ulTaq酶：0.3水：16.7（或15.7ul）细菌16S rDNA的通用引物为Pf-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和Rf-TACCTTGTTACCACTT许敬亮博士论文66页：扩增采用通用的引物，其正向序列为：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向互补序列为： 5'-TTCAGCATTGTTCCAT-3'。
黄婷婷博士论文70页：5’端：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（Escherichia coli bases 8 to 27），3’端：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'（Escherichia coli bases 1507 to 1492）。
2、以总DNA为模板的16SrDNA扩增体系25ul体系Buffer(含有Mg2+)：2.5 ul (购买)dNTP：2.5 ul：3，-primer：0.5ul5，-primer：0.5ul模板：1 ulTaq酶：0.3（或0.2ul）双蒸水：17.7（或17.8ul）3、PCR反应条件94℃，5min；95℃，变性30s；50℃～52℃（可根据扩增情况进行适当调节），退火30s；72℃，延伸1min；30个循环；72℃，延伸15min；10℃(or4℃)，保温10min(or nh)。
4、检测扩增效果取1～3 ul扩增产物,适量load buffer，以DL2000为Marker，上0.75%琼脂糖凝胶跑电泳（电压挑低些80～100，胶长些，利于各扩增产物分离及回收切胶）注：扩增条件摸索时每个模板只扩1管即可三、16SrDNA的回收扩增出的每一管16SrDNA经0.75%琼脂糖凝胶电泳检测后，将效果好的各管16SrDNA合并使达到60～100ul样量，100ul16SrDNA+10ul溴酚蓝跑电泳回收胶(电泳液需换成新鲜的,DL2000为Marker)，EB染色后在紫外灯下切下16SrDNA 条带放入1.5ml离心管中(离心管事先称重)，按DNA凝胶回收试剂盒操作说明回收16SrDNA，取回收16SrDNA 2ul(Dl2000为Marker)跑电泳观察浓度(亮度)与纯度(条带数与位置)。
16S_rDNA鉴定细菌的方法
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分:1。
提取细菌基因组DNA，2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3。
琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6。
BLAST比对获取相似片段.7。
构建系统进化树试剂：1.1 培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
1.2 1M Tris-HCl （pH7。
4, 7。
6, 8.0）（1L）：121。
1g Tris，加浓盐酸约（70ml， 60ml， 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0。
03个单位。
（Tris—HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）50ml0。
1mol/L Tris）溶液与x ml 0。
1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)1.3 0.5M EDTA（pH8.0)(1L）:186.1g Na2EDTA•2H2O,用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
（配置方法1。
称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中. 2。
加入约800mL的去离子水，充分搅拌。
3。
用NaOH调节pH值值8。
0（约20g NaOH）。
注意:pH值至8.0时，EDTA才能溶解。
4。
加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。
6。
室温保存。
）1。
4 10×TE Buffer(缓冲液)（pH7.4，7.6,8。
0）（1L)：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris—HCl（pH7.4,7。
6,8。
0）取100ml,0.5M EDTA（pH8。
0)取20ml.高温高压灭菌,室温保存。
16srdna菌种鉴定原理
16srdna菌种鉴定原理宝子！今天咱来唠唠16S rDNA菌种鉴定原理，这可超级有趣呢！在微生物这个超级微小又超级神秘的世界里，要想知道一个小细菌到底是啥种类，就像在一个超级大的人群里找到一个人的身份一样难。
不过呢，微生物们有它们自己独特的“身份证”，这个“身份证”就是16S rDNA啦。
16S rDNA是啥呢？它其实是细菌的核糖体RNA（rRNA）的一个亚基的基因序列哦。
你可以把细菌想象成一个小小的工厂，那核糖体就是这个小工厂里生产蛋白质的超级重要的“机器”。
16S rDNA就像是这个“机器”的一部分的设计蓝图，而且这个蓝图在不同种类的细菌里是有区别的呢。
就好比不同品牌的手机，它们内部的一些小零件的设计是不一样的。
16S rDNA在不同细菌里长度大概在1500个碱基对左右，这里面有一些区域是非常保守的，就像手机都有屏幕这个基本的部件一样。
而还有一些区域呢是可变的，就像不同手机品牌的屏幕可能在分辨率、色彩显示等方面有差别。
这些保守区和可变区组合起来，就成了细菌独一无二的特征啦。
那科学家们怎么利用16S rDNA来鉴定菌种呢？他们就像侦探一样哦。
首先得把细菌的16S rDNA这个基因序列从细菌里提取出来。
这就有点像从一个神秘的小盒子里找出特定的小纸条一样。
提取出来之后呢，就要对这个基因序列进行测序啦。
测序就像是把小纸条上的字一个一个读出来，然后记录下来。
得到这个基因序列之后，就可以和数据库里已经知道的各种细菌的16S rDNA序列进行比对啦。
数据库里有超级多不同细菌的“身份证信息”呢。
这就好比是拿着我们刚得到的小纸条，去一个巨大的图书馆里找有没有一样或者相似的纸条。
如果找到很相似的，那就可以大概率判断这个细菌是属于哪一类啦。
而且呀，16S rDNA鉴定菌种有好多优点呢。
它在细菌里广泛存在，几乎所有的细菌都有这个“身份证”。
这就像每个人都有自己的身份证一样普遍。
而且这个方法相对来说比较简单，不需要特别复杂的仪器设备就能做初步的鉴定。
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16S rDNA方法鉴定细菌种属
一．目的
1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；
2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。
二、原理
随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。
因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。
随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
1、16S rRNA普遍存在于原核生物中。
rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。
2、在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。
3、16S rRNA的相对分子量大小适中，约1 540 个核苷酸，便于序列分析。
4、可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
利用16S rDNA鉴定细菌的技术路线：
三、操作步骤
（一）细菌基因组DNA提取
1. 挑单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。
2. 取2 mL培养液到2 mLEppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
3. 加140 μLTE打散细菌，再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。
37℃放置10分钟。
4. 加入400 μL Digestion Buffer，混匀。
再加入3 μL Protein K，混匀，55℃温育5分钟。
5. 加入260 μL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。
10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。
7. 重复第六步。
8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。
吸附柱转移到一个新的1.5mL的离心管。
9. 加入50μL预热(60℃)的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。
12000 rpm离心2分钟，流下的
液体即为基因组DNA。
10. 电泳。
取3μL溶液电泳检测质量。
（二）PCR扩增
1. 根据已发表的16S rDNA序列设计保守的扩增引物。
16S (F) 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
16S (R) 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
2. PCR扩增体系：
在0.2 mL Eppendorf管中加入1μL DNA，再加入以下反应混合液：
16S (F) 1μL (10μM)
16S (R) 1μL (10μM)
10×PCR Buffer 5μL
dNTP 4μL
Taq酶0.5μL
加ddH2O使反应体系调至50μL，简单离心混匀。
3. PCR反应
将Eppendorf管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。
扩增条件为：
94℃ 3 min
94℃30 sec
50℃45 sec 35 cycles
72℃100 sec
72℃7 min
4. PCR产物的电泳检测
拿出Eppendorf管，从中取出5μL反应产物，加入1μL上样缓冲液，再加入4ul的ddH2O 混匀。
点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。
电泳1 hr。
在紫外灯下检测扩增结果。
（三）扩增片段的回收
根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。
否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段。
1）称量一2mL.的Eppendorf管质量，记录。
2）在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2 mL的Eppendorf管内，称量。
计算凝胶质量。
3）每100 mg凝胶加入100 μL Binding Buffer，混匀。
60℃温育至凝胶融化。
4）全部转入UNIQ-10柱中。
10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
5）加入500 μL Binding Buffer，10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6）加入70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。
7）再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。
吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。
8）加入30μL预热的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。
12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为回收的DNA片段。
（四）DNA片段测序
将回收的片段送至生物公司测序，测序引物为16S PCR引物。