显微成像方法与技术2-2

穿透深度深。生物体(细胞、组织等)一般都是高散射体。由于散射系数反比于入射
光波长的四次方，多(N )光子成像将散射系数减弱到原来的1/N 4，使大部分入射光
强能到达样品焦平面，提高了穿透深度，有利于获取深层次组织的清晰荧光图像。

荧光收集率高。与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器(针孔)，提高了 荧光收集率。收集效率提高直接导致图像对比度提高。而共聚焦显微镜受到小孔限
10.Pinholes
11.Emission filters 12.Photomultipliers 13.Neutral density filters
14.Monitor diode
单光子激光光源

1. 多线氩离子激光器（Ar+ ）：30mW，458，477，488，514nm 2. 氦氖激光器（HeNe）：1mW，543nm
分光谱的原理
1. 获取λ-Stacke
使用LSM 510 META系统的META通道获取样品的λ-Stacke。这个通道包括分光光 栅和 32 个高灵敏度 PMT 检测器。每个探测器的最小光谱带宽为10.7nm。
2. 参考光谱的定义
不同探针定域于样品的不同区域。
不同探针在样品中交错存在，空间上无法严格区分开。

3. 氦氖激光器（HeNe）：5mW，633nm
Ar+ Laቤተ መጻሕፍቲ ባይዱer
633nm HeNe Laser 543nm HeNe Laser
多光子激发（MPE）的原理
通常情况下，一个分子或者原子每次

只能吸收一个光子，从基态跃迁到激
发态。当光强足够高时，就会发生多 光子跃迁，即一次可以吸收多个光子。 以荧光物质的双光子吸收为例：荧光 分子同时吸收两个相同频率的光子， 被激发至高能级，经过一个弛豫过程 后发生自发跃迁，辐射出一频率略小 于两倍入射光频率的荧光光子。
值孔径的物镜收集，并被一个高灵敏的单光子计数探测器记录，测量到的荧光强度 随时间涨落，相关运算就是对这种时间涨落做自相关分析。
自相关函数给出了两个信息：1.扩散时间2.激发区域内的粒子数
归一化的荧光自相关函数提供了两类的信息：振幅与被观察的平均荧光分子 数的倒数成比例；时间衰减曲线的形状反映了被观察分子的动力学特征。
多光子激发原理示意图
(1)荧光分子的多光子激发需要的激光波长比
多光子激发的特点
单光子长。例如, 双光子激发需要的激光波
长大约是单光子激发所需激光波长的二倍。 因此多光子激发能够用红外或者近红外光代 替紫外光作为激发光源。 (2)多光子激发只产生在焦点附近的一个极小 区域中。单光子吸收截面R1=10-17-10-18cm2,
物的荧光信号，并可较好地消除荧光串色的影响、最大限度减少样品荧光信号的损失。
META 技术在共聚焦显微镜的应用是荧光检测技术的重大突破，适合目前不断发展 的新荧光标记技术的应用（如多荧光蛋白标记等），使得对细胞荧光信号的动态分析 更方便和高效，如 FRAP，FRET 分析等，为生命科学研究提供了更加灵活、多样的 手段和方法。
制，如果想提高收集效率，就需要扩大孔宽度，而这将导致分辨率下降，反之亦然。

对探测光路的要求低。由于激发光与发射荧光的波长差值加大以及自发的三维滤波 效果，多光子显微镜对光路收集系统的要求比共聚焦显微镜低得多，光学系统相对 简单。

适合多标记复合测量。许多染料荧光探针的多光子激发光谱要比单光子激发谱宽阔， 这样，可以利用单一波长的激发光同时激发多种染料，从而得到同一生命现象中的 不同信息，便于相互对照补充。例如，EGFP 和DsRed 的单光子激发波长分别为488 nm 和568 nm，无法实现利用一束单波长激光同时激发。Jakobs 等利用双光子技术， 用925 nm激光同时激发了两种荧光蛋白，观察了它们在Escherichia coli 内的表达情 况。
LSM 510 META系统 META 通道：分光 光栅和 32 个高灵敏度 PMT 检测器）
LSM 510 META系统光路图
1.Optical fibers 2.Motorized collimators 3.Beam combiner
4.Main dichroic beamsplitter
5.Scanning mirrors 6.Scanning lens 7.Objective lens 8.Specimen 9.Secondary dichroic beamsplitter 10.Confocal pinhole 11.Emission filters 12.Photomutiplier 13.META detector 14.Neutral density filters 15.Monitor diode 16.Fiber out
3. Main dichroic beam splitter wheel (8 positions)
4.Projection lens 5.CCD detector 6.Camera mirror
7. Auxiliary beam splitter wheel (8 positions)
8.Channel 1of the emission filter wheel (6+1 posotions) 9.Pinhole channel 1 (motorized in x, y and z) 10.Detector channel 1: fiber-coupled APD 11.Channel 2 of the emission filter wheel (8 posotions) 12.Pinhole channel 2 (motorized in x, y and z) 13.Detector channel 2: fiber-coupled APD
德国蔡司 LSM 510 & ConfoCor 2 系统之倒置荧光显微镜及双屏显示器 显微镜型号：Axiovert 200 MOT
LSM 510系统光路图
1.Optical fibers conducting laser light 2.Collimators 3.Beam combiner 4.Main dichroic beamsplitter 5.Scanner 6.Scanning lens 7.Secondary dichroic beamsplitter 8.Secondary dichroic beamsplitter 9.Secondary dichroic beamsplitter
LSM 510 META系统介绍
德国蔡司 LSM 510 META系统之倒置荧光显微镜及双屏显示器 显微镜型号：Axio Observer Z1 数码冷CCD：型号Axio Cam MRm，像素1388*1040，光谱范围3501000nm
蔡司（Zeiss）公司的 LSM 510 META可以通过 META 通道（分光光栅和 32 个高灵 敏度 PMT 检测器）同时对样品的各段波长信号进行快速采集，并通过先进的 Emission Fingerprinting 技术对光谱进行精确分析，以区分发射光谱高度重叠的标记
FCS技术的优点
FCS 测量与传统的其他方法相比其主要优点在于：很高的灵敏度(甚至达到单分子探 测的水平)、测量时不破坏研究体系的平衡状态、可以进行实时监测。FCS 技术通过 对微小体积内荧光分子激发荧光的涨落做相关分析，可以得到产生荧光涨落过程的
信息。在传统的方法中，样品的体积由聚焦激光束和针孔确定，荧光通过一个高数
光谱串扰
激发串扰和发射串扰
以GFP和DsRed为例，说明如何避免激发串扰。
假如细胞内同时转入了GFP和DsRed，可以458nm激发GFP的荧光，543nm激发DsRed
的荧光，此时检测到的基本是单个探针的荧光。 如果以488nm或514nm激发，则会同时激发二者的荧光。
传统的解决串扰的方法是通过滤光片的选取来检测某一探针的最强荧光光谱区段，以 与光谱上相邻近的探针的荧光区分开。 例如，同时被GFP和YFP标记的细胞，以488nm激发时，同时可检测到GFP和YFP两者 的荧光。为区分二者的荧光，可用500-520nm滤光片收集GFP的荧光，而用535-545nm 滤光片收集YFP的荧光。虽然这个方法不能完全清除相邻探针的荧光串扰，但主要贡 献还是来自所检测的探针。
多光子激发的光源
发生双光子吸收的概率依赖于两个光子在荧光基团内吸收截面的空间位置重叠和到达 时间重叠。双光子激发需要非常高的局部瞬时强度，为得到该强度，激光脉冲峰与基
底之比可达106。但如此强的能量只集中在极短的激光光脉冲宽度(1 飞秒= 10- 15秒)内，
占空比很小，对生物样本并不会造成很大的伤害。双光子显微镜使用高能量锁模脉冲 激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度 只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80 至 100 兆赫。例如使用76MHz重复率的100飞秒的 激光脉冲，单脉冲能量只有纳焦耳量级。利用多光子激发，对原本必须用紫外波长(例 如350nm)单光子激发的样本可改用红光波长的双光子(700nm)激发，大大减小了对样本 的伤害。而且，多光子激发可以使用调谐激光器，例如可调谐兰宝石激光器，可输出 700-1000nm波长的激光。
单光子与双光子荧光激发比较 (样品为罗丹明B水溶液)
这是多光子激发的一个基本点。而单光子激
发区域为两个锥形区, 在整个照明区均产生 荧光。
双光子激发与单光子激发的比较
多光子激光扫描显微镜的特点

对生物样品的光损伤小。克服了共聚焦显微镜在活体细胞和组织观测中的主要缺陷, 减少了焦点外的光学损害和背景光强度, 极大地降低了紫外光对生物体正常生理活 动的破坏和影响, 为活体观测和研究提供了有利条件。
单光子激发荧光： 整个照明区均产生荧光
双光子吸收截面R2≈10-49cm41s/光子, 三光 子吸收截面R3≈10-75cm6ıs2/光子2。对于聚焦 光束产生的对角锥形激光分布, 多光子激发 被限制在焦点附近的一个极小区域中, 从而 实现“点成像”,具有固有的三维成像能力,
双光子激发荧光： 仅在焦点附近产生荧光
荧光互相关函数得到的信息：两种成分有没有发生相互作用， 函数的幅度与结合成分的比例成正比。
用荧光互相关FCCS识别和检测凝血酶
ConfoCor2荧光相关谱实验装置
ConfoCor 2系统光路图
1.Optical fiber of the laser module 2.Motorized collimato
钛宝石锁模飞秒激光器（MIRA-900F，美国Coherent公司） 输出脉冲宽度：120fs 重复频率：76MHz 平均输出功率：1.3W 可调谐波长范围：700-980nm
荧光相关谱技术
荧光相关谱(Fluorescence correlation spectroscopy，简称FCS)技术是一项近年发 展很快的实验技术，在生物学领域研究中、特别是对活体中动态过程的测量显示出广 阔的应用前景。 FCS 技术测量单个粒子或分子经过一个非常小的荧光激发区域(一般小于1μｍ3)时所 发出的荧光，通过分析荧光涨落的自关联函数得到粒子扩散系数、激发区域内的粒子 数等信息。

有效观测时间长。荧光染料的光致漂白(即染料分子会因激发次数过多结构受到破 坏而失效)是制约实验观测、影响实验结果准确性的主要因素之一。对于共聚焦显 微镜, 由于整个激光照射区域内的染料分子都会被激发, 导致非焦点区域的染料过 早漂白。而双光子激发只产生在焦点附近的一个极小区域中, 从而大大减少了对非 观测区荧光染料的破坏，使实验能够在保持生物体活性的前提下长时间进行。
3. 光谱分离
为了分离光谱，需要样品的λ-Stacke和样品中各个探针的参考光谱。 Linear Unmixing软件通过线性运算来实现光谱分离，即计算每个像素点各个探针 发射信号的强度。因为每一个像素点对应样品的一点，此点检测的光谱S(λ)sum是 各个探针在此点发射信号的累积，可以下式表示。
所以，已知各个探针的参考谱S(λ)dyeA，B and C，就可计算出各个探针的荧光强度 intensitydyeA，B and C。