显微成像方法与技术2-2
显微成像技术的发展与应用
显微成像技术的发展与应用近年来，科技日新月异，人们的生活也在不断发生变化。
显微成像技术作为科技领域的一个重要分支，在医学、生物、物理等领域得到了广泛的应用，并持续地不断发展。
本文将探讨显微成像技术的发展与应用，并分析它们的意义及未来的前景。
一、显微成像技术的发展显微成像技术是一项重要的科技创新，其发展历史可以追溯到17世纪。
当时，人们开始使用简单的显微镜观察微观世界。
19世纪，发明了复合显微镜，可以增强显微镜的分辨率，进一步促进了显微成像技术的发展。
20世纪，电子显微镜的诞生，为显微成像技术带来了一场革命，具有出色的分辨率和灵敏度，即使可以观察到原子尺度的物质。
随着计算机技术的不断进步，显微成像技术的精度和速度也得到了极大的提高。
二、显微成像技术的应用1、医学应用显微成像技术在医学领域中得到了广泛的应用，特别是在癌症的检测和治疗方面。
显微成像技术可以帮助医生将肿瘤细胞分解成微小的分子级部分，以便更准确地确定癌细胞的类型和位置，为疾病的治疗提供更好的依据。
2、生物领域应用显微成像技术在生物学领域应用广泛，能够帮助科学家研究细胞和生物分子的结构及定位。
现代显微成像技术能够使用荧光标记来标记特定的生物分子，从而揭示它们在细胞内的位置和功能。
这种技术在药物研发、疾病治疗和基因研究中得到了广泛的应用。
3、材料科学领域应用显微成像技术对特定材料的结构进行分析和图像化，对材料的分析和评估提供重要的信息。
底层的结构和相互作用方式对材料的性能和机能有着决定性的影响，显微成像技术可以在这一领域发挥独特的作用。
三、显微成像技术的未来随着显微成像技术的不断发展，它在医学、生物、材料科学等领域的应用范围将不断扩大。
研究者们也在不断努力改进技术的分辨率，使其可以观察到更细微的结构。
预计，在未来几年，人工智能和机器学习等技术的不断发展，将为显微成像技术的提高提供支持，从而实现对更细微的生物和科学结构进行更加准确的分析和评估。
近代显微成像技术的研究进展与应用
近代显微成像技术的研究进展与应用狄伶【摘要】The development of microscope imaging technology was introduced, and the imaging principle and application of fluorescence microscopy, confocal microscopy and super-resolution microscopy were outlined. The technology of stimulated emission depletion (STED) was clarified in the super-resolution microscopy. With the rapid development of computer technology and photo-electricity technology, a new generation of microscopy of living cells is developed, and cells tracking, real-time observation, 3D reconstruction, fluorescence quantification and four-dimensional dynamic analysis can be carried out at molecular and ion levels.%本文简述显微成像技术的发展历史,介绍荧光成像、共聚焦显微成像和超分辨显微成像技术的工作原理及应用.超分辨显微成像技术中主要介绍受激发射损耗技术.随着计算机技术和光电技术的飞速发展,新一代显微成像技术对活细胞微观生命活动实现了分子和离子水平的形态定位、实时动态观察、三维结构重组、荧光定量分析和四维动态分析.【期刊名称】《中国医疗设备》【年(卷),期】2018(033)002【总页数】4页(P107-110)【关键词】显微成像技术;共聚焦显微镜;受激发射损耗;超分辨显微成像技术【作者】狄伶【作者单位】上海交通大学分析测试中心,上海 200240【正文语种】中文【中图分类】TH74引言显微成像技术是一种借助物理方法观察微小物体的技术手段，它的发展与物理学领域对光的认识密不可分。
MetaMorph显微成像分析
■ 从宏观到细节
同 时 获 得 相同细 胞的微观 和宏观图 像
■ 从 平 面 到立体 4D浏 览 ， 获 知细胞的 所有结构 随时间发 生 的 位 移 变化和 转移过程 ，获得前 所未 有 的 深 层 细胞信 息
活细胞成像工作站
细胞离子成像
细胞离子成像/FRET简介
钙离子是生命活动最重要的离子之一，通过测 定细胞内游离钙离子浓度，科研工作者可以得知肌 肉收缩、神经信号传导、细胞间通讯、激素反应等 生命活动的重要信息。
另外，许多非金属阴离子，如H+，NO等及细胞 膜电位的检测和线粒体膜电位的快速检测对于观察 细胞的生物学特性有着重要的价值。
长 寿 命 光 源系统 多 种 类 型 的CCD
系 统 与 膜 片钳联 用
实 时 获 得 离子图 像和 离 子 绝 对 浓度值
应用实例
同时展示多波长图像和自定义的测量曲线。当对之前的图像进行二次分 析时，通过鼠标点击曲线任意位置能够快速展示出与之相对应的图像。
CHO细胞标记Fura-2 图像来源： the Biomedical Sciences short course , Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA. Courtesy of Lynda Pierini, PhD, Cornell Medical Center, Ken Dunn, PhD, Indiana University-Purdue University,and Professor ColinIzzard, SUNY University of Albany.
MetaMorph生物学显微成像和分析
资料2-1放大镜的使用方法
资料2-1 放大镜的使用方法放大镜的使用方法有两种：一种是将需要观察的物体放置在一个固定的位置上，再将放大镜靠近物体的一侧，然后沿着肉眼与物体之间的直线方向，缓缓地移动放大镜，直至看清楚物体的细微结构为止；另一种方法是将放大镜放置在一个固定的位置上，将需要观察的物体放置在放大镜之下（靠近放大镜），然后沿着肉眼与放大镜之间的直线方向缓缓地移动物体，直至看清楚物体的细微结构为止。
资料2-2 显微镜使用的注意事项1.取送方法因为反光镜是通过镜柄插放在镜臂下面的，目镜是插放在镜筒上的，所以它们很容易滑落而受到损害。
取送显微镜一定要一手握住镜臂，一手托住镜座，在任何情况下都不允许用一只手提着显微镜。
另外，也不允许学生取下反光镜和目镜到处乱照。
2.镜头的保护目镜和物镜平时放在显微镜箱内的专用的盒内，课间要用专用的塑料袋或布袋随时罩好。
镜头脏了，只能用专用的擦镜纸擦拭，擦拭时要顺着一个方向擦。
如果擦拭后仍不干净，可蘸一点二甲苯再擦。
注意，绝不能把镜头直接放到二甲苯中浸泡，这样会使镜头开胶，导致镜片脱落。
3.粗、细准焦螺旋的使用在调节粗、细准焦螺旋使镜筒下降时，一定要用眼睛直接看着镜筒缓缓下降。
否则，有可能砸坏物镜和玻片标本。
显微镜使用时间过长，镜筒容易出现下滑现象，要及时检查和维修。
4.转换器的使用转动转换器时，不要用手指扳物镜。
这容易使物镜镜头松动，改变焦距，影响观察的清晰度。
正确的方法是：手指握准转换器的边缘转动。
资料2-3 电子显微镜电子显微镜是一种精密分析仪器，是利用高速运动的电子束代替光波的一种显微镜。
工作原理为在一个高真空系统中，由电子枪发射电子束，穿透被研究的试样，经电子透镜聚焦放大，在荧光屏上显示一放大的物像，称为通用式电子显微镜；而用电子束在试样上逐点扫描，然后用电视原理进行放大成像显示在电视显像管上的，称为扫描式电子显微镜。
我国在1965年试制成功20万倍电子显微镜，后来又成功研制了80万倍电子显微镜。
光学显微技术
7、微分干涉显微
differentialmicroscope） （differential-interference microscope） 1952年，Nomarski在相差显微镜 年 在相差显微镜 原理的基础上发明。 原理的基础上发明 DIC显微镜使细胞的结构 显微镜使细胞的结构， 。 DIC显微镜使细胞的结构，特 别是一些较大的细胞器， 别是一些较大的细胞器，如 优点: 优点 能显示结构的三维立体投影影 DIC显微镜 显微镜 线粒体等， 核、线粒体等，立体感特别 与相差显微镜相比，标本可厚,折 像。与相差显微镜相比，标本可厚 折 下的硅藻 适合于显微操作。目前 强，适合于显微操作。，故影像立体感更强。 射率差别更大， 射率差别更大 故影像立体感更强。 （伪彩色） 伪彩色）
3Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and decreased. therefore brightness, is decreased.
像基因注入、核移植、转基 基因注入、核移植、 因等的显微操作常在这种显 微镜下进行。 微镜下进行。
四种类型显微镜对成纤维细胞观察效果的比较： 四种类型显微镜对成纤维细胞观察效果的比较： (A) 明视野显微镜 (B) 相差显微镜 (C) 微分干涉显微镜 (D) 暗视野显微镜
单分子定位显微成像技术介绍
单分子定位显微技术（Single Molecule Localization Microscopy，简称SMLM）是一种基于荧光显微技术的高分辨率成像方法，它的原理是通过利用单个荧光分子的闪烁信号来定位样品中的单个分子，从而实现高分辨率成像。
SMLM技术可以实现分子级别的可视化，其分辨率可以达到10纳米以下，远高于传统显微技术。
由于其高分辨率和高灵敏度，SMLM 技术已经成为生物学、化学、材料科学等多个领域中重要的研究工具。
一、原理SMLM的原理基于单个荧光标记的瞬时发光特性。
当激光或其他光源激发荧光标记时，标记会发射荧光光子。
这些光子在相机或光探测器上被捕获，并转化为电子信号。
在SMLM 中，通过分析这些光子的时间和空间分布，可以确定每个荧光标记的位置。
SMLM的关键在于利用光学显微镜的成像系统将荧光标记限制在光学焦点内，使得每次只有单个标记被激发发光。
因此，可以记录每个标记的光子发射时间和位置信息，并将这些信息用于精确定位标记的位置。
SMLM技术包括多种方法，其中最常用的是单分子激发的STORM（stochastic optical reconstruction microscopy）和PALM（photoactivated localization microscopy）。
在SMLM过程中，需要解决许多技术挑战，包括背景噪声的影响、荧光标记的失活和漂移等问题。
为了解决这些问题，研究者们开发了各种算法和图像处理技术，如滤波、校正和重建方法等。
这些技术的应用可以提高SMLM的空间分辨率和信噪比，并为更深入的细胞生物学研究提供了新的工具。
图 1 STORM其中，STORM是最常用的SMLM技术，其基本原理是利用亚波长分辨率下荧光发光的闪烁特性，对单个发光染料的位置进行定位，进而构建出超分辨率的图像。
STORM技术将样品在一定范围内随机激发，从而使样品中的荧光染料分子以随机的方式发光。
利用图像处理算法，可以对发光点的位置进行高精度的计算，得到超分辨率图像。
光学显微镜技术
光学显微镜技术第一章概述第一节显微镜的作用人眼对微观世界观察的局限性光学显微镜是人类探索微观世界的光学精密仪器光学显微镜的发展在很大程度上决定了人们对生命现象的认识第二节显微镜的类型根据照明源的性质一、光学显微镜：利用可见光（或紫外光）为照明源，一般有单式及复式显微镜两类。
复式显微镜可分为：1.普通型：常规使用。
2.特种型：如荧光、相衬显微镜等；供专门观察和研究。
3.高级型：万能显微镜。
4.共焦激光扫描显微镜（Confocal）。
第三节光学显微镜的发展简史1625年法布尔提出显微镜的概念1610年伽利略制造出具有物镜、目镜及镜筒的复式显微镜1611年开普勒说明了显微镜的原理1665年虎克制造出放大140倍的显微镜，提出“Cell”的概念1684年惠更斯制造出双透镜目镜：惠更斯目镜19世纪阿贝提出显微镜的完整理论1902年艾夫斯建立了双目镜系统1935年泽尼克发现了相衬原理，并因此获得诺贝尔奖20世纪60年代微分干涉衬显微镜问世20世纪80年代共焦激光扫描显微镜开始应用第四节显微镜的基本光学原理一、折射与折射率光线的折射现象物质的折射率二、透镜的性能凸透镜可以会聚光线凹透镜可以发散光线三、透镜的成像质量象差：是指透镜所形成的象与理想象在形状、颜色等方面存在差异。
色差：由于不同的颜色光线折射率差异而形成的象差。
色差的校正（1）采用单色光为光源。
（2）利用透镜的性质。
四、显微镜的成象（几何成象）原理利用凸透镜成象原理物镜成象：利用物体在凸透镜一倍焦距以外二倍焦距以内，成倒立的放大的实象。
目镜成象：是利用物体在凸透镜一倍焦距以内，成正立的放大的虚象。
显微镜成象原理：第二章、显微镜的主要光学技术参数第一节数值孔径（Numerical Aperture，NA）数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体间介质的折射率（η）和孔径角（u）半数正弦的乘积。
用公式表示：NA= ηsin u/2数值孔径代表了物镜或聚光镜光通量的大小，是衡量物镜或聚光镜性能高低的重要指标。
【显微光学】显微镜光学原理及技术参数详解
显微镜光学原理及技术参数详解目录1 第一章：显微镜简史 (2)2 第二章显微镜的基本光学原理 (2)2.1 折射和折射率 (2)2.2 透镜的性能 (2)2.3 影响成像的关键因素—像差 (2)2.3.1 色差（Chromatic aberration） (3)2.3.2 球差(Spherical aberration) (3)2.3.3 慧差(Coma) (3)2.3.4 像散（Astigmatism） (3)2.3.5 场曲（Curvature of field） (4)2.3.6 畸变（Distortion） (4)2.4 显微镜的成像（几何成像）原理 (4)2.5 显微镜光学系统简介 (5)3 第三章显微镜的重要光学技术参数 (5)3.1 数值孔径 (6)3.2 分辨率 (6)3.3 放大率 (7)3.4 焦深 (7)3.5 视场直径（Field of view） (7)3.6 覆盖差 (8)3.7 工作距离 (8)4 第四章显微镜的光学附件 (8)4.1 物镜 (9)4.2 目镜 (11)4.3 聚光镜 (11)4.4 显微镜的照明装置 (12)4.5 显微镜的光轴调节 (13)5 第五章各种显微镜检术介绍 (14)5.1 金相显微镜 (14)5.2 偏光显微镜（Polarizing microscope ） (17)5.3 体视显微镜（Stereo microscope） (19)1第一章：显微镜简史随着科学技术的进步，人们越来越需要观察微观世界，显微镜正是这样的设备，它突破了人类的视觉极限，使之延伸到肉眼无法看清的细微结构。
显微镜是从十五世纪开始发展起来。
从简单的放大镜的基础上设计出来的单透镜显微镜，到1847年德国蔡司研制的结构复杂的复式显微镜，以及相差，荧光，偏光，显微观察方式的出现，使之更广范地应用于金属材料，生物学，化工等领域。
2第二章显微镜的基本光学原理2.1折射和折射率光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现像，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。
简述相机显微成像的流程
简述相机显微成像的流程
相机显微成像流程简述如下：
1. 光线通过显微镜物镜聚焦，将被观察物体放大成倒立实像。
2. 实像经过目镜再次放大后，若采用传统光学显微镜，则人眼通过目镜直接观察；若需拍摄记录，则将显微镜配置数码成像组件（如CCD或CMOS）。
3. 成像传感器捕捉到的光信号经过滤色镜分解为RGB三原色，并转化为电信号。
4. 电信号通过模拟前端（AFE）进行放大和模数转换（ADC），生成数字图像信号。
5. 数字信号传输至内置图像处理系统进行色彩校正、噪声抑制等处理，最终形成清晰的显微图像输出至计算机或其他显示设备。
总结：光线经显微镜聚焦后由成像传感器捕获并转换为数字信号，再经处理生成可存储和显示的显微图像。
显微镜的正确调试和使用
显微镜的正确调试和使用在了解了显微镜各主要部件的名称、构造和功能之后，为了更好地发挥显微镜的各种功能，提高工作效率，保证在显微观察及显微照像过程中取得最佳效果，使用人员必须了解和掌握显微镜正确的调试方法和使用方法。
尤其在新一代显微镜中，具备了多种功能，能进行多种显微镜检方法观察，正确的试调方法和使用方法就显得尤为重要。
下面以Axioplan万能研究显微镜为例，简述调试及使用方法。
1. 显微镜照明光路系统的调整为了使显微镜的视野能受到均匀而又充分的照明，在显微镜初次安装和调试时，就必须把照明光路系统调整好，这是正确使用显微镜，并获得正确、可*结果的重要手段和最基本的要求。
此外，正确掌握照明光路系统的调整，是使用显微镜过程中更换光源灯泡后所必经的步骤，也是在日常使用过程中不时地检验显微镜性能的必要手段。
显微镜照明光路系统的调整主要有以下4项内容： (1) 照明光源灯室在显微外的初步调整① 首先将灯室的外壳打开，压弹簧夹子将卤素灯泡装入插座中，安装时避免手指直接接触灯泡（可用柔软的布或纸隔住），以免灯泡上留有指纹等脏物，影响灯泡的使用寿命。
② 把灯室摆在桌面上，接通电源后，用专用的螺丝刀调节灯的调焦旋钮孔（标有“←→”），使灯丝投影在1-2m外的墙上，将灯丝成像调至清晰；然后调节灯的高低位置调节丝孔（标有“──”），使灯丝位置高低适当；再调节灯的左右位置调节螺丝孔（标有“──”），使灯丝左右位置合适。
(2) 光源发光体（灯丝）在显微镜内位置的检验和校正目的是为了把发光体的像端端正正地调入物镜的视域范围内，从光源的角度去确保显微镜的视域受到充分而均匀的照明，这是调整库勒照明系统的前提条件。
需要的基本工具：对中望远镜购置显微镜时已配备。
① 拔掉灯库内的毛玻璃套筒，把灯室装回显微镜上；② 选用10×物镜，开亮光源程序找样品并调焦清晰，再换用40×物镜把样品调焦清晰（40×物镜可以看清灯丝的全貌）；③ 把聚光镜的孔径光阑和视场光阑均开到最大；④ 拔掉其中一个目镜，换上对中望远镜，抓住白色部分，另一手伸缩黑色接目镜，就可在视野中看到灯丝像；⑤ 如灯丝位置不合适，调“──”孔，把灯丝像沿水平方向调好，调“──”孔，把丝像沿垂直方向调好，直至将灯丝像调至刚好充满物镜孔径的光圆像；⑥ 调整完毕后，将毛玻璃套筒插回原位，拔掉对中望远镜，换回目镜作下一步调整。
相干反斯托克斯拉曼散射显微成像技术
第36卷 第10期中 国 激 光Vol.36,No.102009年10月CHINESE JO URNA L OF LASERSOctober,2009文章编号:025827025(2009)1022477208相干反斯托克斯拉曼散射显微成像技术尹 君1,2林子扬2 屈军乐2 于凌尧2 刘 星2 万 辉2 牛憨笨21华中科技大学光电子科学与工程学院,湖北武汉4300742深圳大学光电子学研究所,光电子器件与系统(教育部/广东省)重点实验室,广东深圳518060摘要 回顾了相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微成像技术的理论和技术的发展,介绍和比较了CAR S 显微成像技术对抽运光源的要求,以及典型的CARS 显微成像系统。
对CARS 显微成像技术中无法避免的最重要的非共振背景噪声问题做了详细的分析,对不同的抑制非共振背景噪声的方法进行了比较和讨论,对CARS 显微成像技术目前存在的问题和可能解决途径进行了简要的分析。
关键词 激光光学;显微成像方法;相干反斯托克斯拉曼散射;非共振背景噪声;超连续谱;光子晶体光纤中图分类号 O437.3;Q631 文献标识码 A doi :10.3788/CJL 20093610.2477Coh er en t Ant i 2St ok es Ra man Scat tering Micr oscopic Ima ging Techn iqueY in Jun 1,2 Lin Ziyang 2 Qu Junle 2 Y u Linyao 2 Liu Xing 2 Wan Hui 2 Niu Hanben 21College of Optoelect r onic Scien ce a nd Engin eer ing ,Hu azhon g Un iver sity of S cience an d Technology ,Wuha n ,Hu bei 430074,China2Key La bor a tor y of O pt oelectr on ic Devices a nd Syst em s of Ministr y of Educa tion an d Gua ngdong Pr ovince ,Instit ute of O pt oelectr on ics ,Shenzhen Un iver sit y ,S hen zhen ,Gua ngdong 518060,Chin aAbstr a ct I n this pape r,theor etical and technical development of coher ent anti 2Stoke s Raman scatte ring (CA RS)microscopy is r eviewe d.The re quire me nts of CA RS micr oscopy on the pump laser sour ce and typical e xpe rime ntal instr ume ntation ar e discussed and compared.We inve stigate the non 2r esonance background noise which is the most cr itical problem and can not be avoide d in the CA RS micr oscopy.Differ ent me thods for suppre ssing non 2re sonant background noise are pre sented and compared.Finally,a brief analysis of e xisting problems in CA RS microscopy and possible solutions is presented.Key wor ds laser optics;microscopic imaging me thod;cohere nt anti 2Stokes Raman scatter ing;non 2r esonance background noise;super continuum;photonic cr ystal fiber收稿日期:2009207208;收到修改稿日期:2009208210基金项目:国家自然科学基金(60627003)、广东省高等学校科技创新团队项目(06CXT D009)和教育部高等学校博士学科点专项基金(2007059000)资助课题。
显微镜的原理和使用方法
显微镜的原理和使用方法-装片的制作显微镜的结构和使用2显微镜的成像①光源天然光或人工光源→反光镜→光圈→物体→物镜凸透镜→在镜筒内形成物体放大的实像→目镜→把经物镜形成放大的实像进一步放大②显微镜放大倍数=物镜放大倍数×目镜放大倍数3高倍显微镜的使用①用低倍显微镜观察取镜与安放：a. 右手握镜臂,左手托镜座;b. 显微镜放在实验台的前方稍偏左;对光：a. 转动转换器,使低倍物镜对准通光孔;b. 选一较大的光圈对准通光孔,左眼注视目境,转动反光镜,使光线通过通光孔反射到镜筒内,通过目镜,可能看到自亮的视野;低倍镜观察：a. 把所要观察的玻片标本放在载物台上,用压片夹压住,标本要正对通光孔的中心;b. 转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓下降,直到物镜接近玻片标本为止此时实验者的眼睛应当看物镜镜头与标本之间,以免物镜与标本相撞;c. 左眼看目镜内,同时反向缓缓转动粗准焦螺旋,使镜筒上升,直到看到物像为止,再稍稍转动细准焦螺旋,使看到的物像更加清晰;②高倍镜观察a. 移动装片,在低倍镜下使需要放大观察的部分移动到视野中央;b. 转动转换器,移走低倍物镜,转换为高倍物镜;c. 调节光圈,使视野亮度适宜;d. 缓缓调节细准焦螺旋,使物像清晰③注意事项a. 使用显微镜一定要严格按照取镜→安放→对光→压片→观察的程序进行;b. 下降镜筒时,一定要用双眼从侧面注视物镜,使之接近装片,但又要防止镜头触及装片;否则会压碎装片和损坏物镜l0x物镜的工作距离为0. 5-1 cm;c. 有必要使用高倍物镜时,必须先在低倍物镜下将目标移到视野的中心,然后换用高倍物镜;因为在低倍物镜下看到的物像放大倍数小,但看到的标本实际面积大,容易找到目标；与低倍物镜相比,高倍物镜下看到的物像人,同样的视野面积看到的标本的实际面积小,在装片不动的情况下,高倍物镜看到的只是低倍物镜视野的中心部分;d. 换高倍物镜时,千万不可将镜筒升高,正确的做法是直接转动转换器,换上高倍物镜即可;e. 使用高倍物镜之后,透镜与装片之间的距离很近,使用粗准焦螺旋容易压碎玻片和损坏透镜,或者由于物像一闪而过,找不到要观察的目标．因此,必须用细准焦螺旋调焦,细准焦螺旋只在调节图像清晰度时使用;④原理说明1. 识别镜头：1目镜：装在镜筒的上端,通常备有2－3个,上面刻有5×、10×或15×符号以表示其放大倍数,一般装的是10×的目镜;放大倍数越大镜筒越短;2物镜：装在镜筒下端的转换器上,一般有2-3个物镜,其中最短的刻有“10×”符号的为低倍镜,较长的刻有“40×”符号的为高倍镜,放大倍数越大镜筒越长2. 放大倍数：显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积,如物镜为10×,目镜为10×,其放大倍数就为10×10=100;放大的是物体的直线长度和宽度而不是面积;3. 工作距离：是指显微镜处于工作状态物象调节清楚时物镜的下表面与盖玻片盖玻片的厚度一般为上表面之间的距离,物镜的放大倍数愈大,它的工作距离愈小;如物镜是10×的工作距离比物镜是40×的工作距离大;4. 明暗程度：1显微镜用光源,自然光和灯光都可以,以灯光较好,因光色和强度都容易控制;2反光镜它有平、凹两面,再经通光孔照至标本;可向任意方向转动,凹面镜聚光作用强,适于光线较弱时使用,平面镜聚光作用弱,适于光线较强时使用;3光圈或遮光器在通光孔下方,光圈由十几张金属薄片组成,其外侧伸出一柄,推动它可调节其开孔的大小,以调节进光量；遮光器由几个直径大小不同的孔组成,选择某一孔以确定进光量;5. 物像：镜下见到的是完全的倒像,即标本位于玻片右上角时在镜下的左下角位置出现,移动的规律是物象在镜下的左下角时将玻片向左下角移动可以将物象移到视野的中央来;但是物体的运动方向不变,即标本中细胞质是顺时针方向流动的,镜下仍为顺时针流动;6. 污物的位置：在视野中常看到污物,要明确污物不会在反光镜上,因为反光镜的作用是将光源光线反射到玻片标本上；确定污物的位置首先移动玻片如污物随之移动即污物在玻片上；如污物不动,再转动目镜污物也随之转动即污物在目镜上；否则在物镜上;7. 普通光学显微镜下可以见到的细胞结构有：细胞壁、细胞核、液泡、叶绿体、线粒体、核仁,在质壁分离时可见到细胞膜,有丝分裂时可见到染色体;8. 玻片标本：必须是透明的,要使光线能透过标本内部;常用的种类有切片洋葱根尖纵切片；装片洋葱表皮临时装片；压片洋葱根尖临时压片观察有丝分裂；涂片血涂片、自生固氮菌的临时涂片;⑤相关原理例析1. 物像放大问题<1> 放大的对象：放大的是所观察的物体的长或宽即：边长被放大的倍数,不是指面积、体积的放大倍数;<2> 放大倍数=目镜倍数×物镜倍数如：目镜为20×；物镜为10×,则放大倍数为20×10=200倍细胞面积的放大倍数为2002 =40000倍<3> 放大倍数越大,物像越大,视野越小放大倍数越小,物像越小,视野越大如图：左图是放大10倍的物像,右图是放大20倍时的物像,非常明显放大倍数小,细胞物像小,但看到的细胞数目多,视野大；放大倍数大,细胞物像大,但看到的细胞数目少,视野小；<4> 物镜越长,放大倍数越大；目镜越长,放大倍数越小;2. 物像方位问题观察着从显微镜看到的是上下颠倒、左右颠倒的象;①成像原理图解如下：光线→反光镜→遮光器→通光孔→标本一定要透明→物镜的透镜第一次放大成倒立实像→镜筒→目镜再放大成虚像→眼②举例说明载玻片上物体形态与镜中物像之间的对应关系：例一：分析：从例一可以让学生体会显微镜下图像与装片上物体上下颠倒、左右颠倒的位置关系,进而得出判断物像的简便方法：即把纸张旋转1800直接观察;例二：分析：可以先让学生判断装片下的物体状态在镜下的图像,通过此例可以让学生明白镜下观察到的物体旋转的方向与实际旋转方向相同,并不是象部分学生所想当然的相反,而且也符合上下颠倒、左右颠倒的规律;3. 物像明暗问题①光圈小,成像暗；光圈大,成像亮②用平面反光镜,成像相对暗；用凹面反光镜,成像相对亮③高倍镜下视野暗；低倍镜下视野亮注：由于人眼感受物像的明暗是由进入人眼的光照强弱、光线多少决定的,因此对于①②不难理解,但在教学中会有很多师生对于③的理解不是很好,其实就其原因还是由于进入人眼的光线多少造成的;因为低倍镜视野大,看到的细胞多,高倍镜视野小,看到的细胞少,即：高倍镜下只有透过少量细胞的光线进入到人眼中,就感觉视野一些；低倍镜下透过较多细胞的光线进入到人眼中,就感觉视野亮一些;临时装片的制作：1准备：1. 用洁净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净;2. 把载玻片放在实验台上,用吸管在载玻片的中央滴一滴清水2制片3. 用镊子取材;如：从洋葱鳞片叶子内侧的表皮上,撕取一小块透明薄膜4. 把材料如：撕下的薄膜浸入载玻片上的水滴中,用镊子把薄膜展平;5. 用镊子夹起盖玻片,使它的一边先接触载玻片上的水滴,然后轻轻地盖在薄膜上,避免盖玻片下面出现气泡;典型例题例1 观察细胞中染色体行为并计数时,使用光学显微镜的正确方法是A. 低倍镜对焦,将观察目标移至视野中央,转用高倍镜并减少光量,调焦观察B. 低倍镜对焦,将观察目标移至视野中央,转用高倍镜并增加光量,调焦观察C. 低倍镜对焦,换用高倍镜,将观察目标移至视野中央,增加光量,调焦观察D. 高倍镜对焦,将观察目标移至视野中央,增加光量,调焦观察答案：B解析：正确使用低倍镜：正确使用低倍镜的操作程序是：取镜、对光、安装片、下降镜筒、调焦;下降镜筒时,必须双眼注视镜和装片的距离,以免压坏装片和碰坏物镜;高倍显微镜的使用：1在低倍镜下将物像调到最清晰；2将所要放大的部位移至视野中央；3转动转换器,换高倍物镜；4调整反光镜和光圈,使视野亮度适宜；5左眼注视目镜内,同时转动细准焦螺旋约半圈,使镜筒缓缓上升直到看清物像; 例2 小华观察同一标本4次,每次除调整放大倍率外,其他条件都未变动,结果如图问：视野亮度最弱的是哪一个答案：B解析：低倍镜换成高倍镜后的视野变小,亮度变暗,细胞变大,数目变少；例3 使用显微镜观察水中微小生物,若发现镜中生物往图7中圆圈内所示方向游走,请问你该把载玻片往哪个方向移动才不至于使微小生物从视野中消失A. 甲B. 乙C. 丙D. 丁答案：C解析：显徽镜下看到的是倒像例4 在光照明亮的实验室中,用白色洋葱表皮做质壁分离实验;在显微镜视野中清晰地看到细胞壁,但看不清细胞是否发生了质壁分离,为了解决这一问题应A. 改用凹面反光镜,放大光圈B. 改用凹面反光镜,缩小光圈C. 改用平面反光镜,放大光圈D. 改用平面反光镜,缩小光圈答案：D解析：显徽镜的用光1对于折光性较强的材料,观察视野光线过强,往往易看清结构,却极易造成眼睛疲劳,影响实验效率;观察洋葱表皮细胞结构时,由于原生质层较薄,故在视野较暗时,观察效果较好;2观察视野过暗,也会看不清物像,影响效果;对比较厚的材料或颜色较深的材料,应增大通光量;观察视野的明暗程度应以眼睛感到舒适为宜;模拟试题1. 下图表示光学显微镜的一组镜头,目镜标有5×和15×字样,物镜标有10×和40×字样;请看图回答：1要仔细观察叶绿体的形态时,显微镜的目镜、物镜及其与盖玻片间距离的组合为___________用标号作答;此时放大的倍数为 ;2在观察中,③和④的显微视野中比较明亮的是 ;3若在低倍镜视野中发现有一异物,当移动装片时,异物不动,转换高倍镜后,异物仍可观察到,此异物可能存在于A. 物镜上B. 目镜上C. 装片上D. 反光镜上2. 观察叶绿体时,下列哪种材料不能直接放在载玻片上A. 葫芦藓的叶片B. 黄杨叶横切片C. 南瓜叶片D. 沾有少数叶肉细胞3. 下列关于叶绿体在细胞中的分布,正确的是A. 在强光下,叶绿体以其较小的面对着光源,以利于接受较多的光B. 在弱光下,叶绿体以其较大的面对着光源,可以接受更多的光C. 在弱光下,叶绿体会较多地聚集在背光一侧D. 在一般的叶片,背光面的细胞中含有较多的叶绿体4. 用小麦根尖成熟区表皮细胞观察细胞质流动时,由于根细胞的细胞质无色透明,难于观察到细胞质的流动,这时需采取的措施是A. 缩小光圈,用弱光线B. 开大光圈,用弱光线C. 缩小光圈,用强光线D. 开大光圈,用强光线5. 在观察细胞质流动时,把叶绿体等颗粒作为细胞质流动的标志物是因为A. 光学显微镜下看到的细胞器只有叶绿体B. 如果没有标志物,细胞质的流动就难以察觉C. 只有叶绿体等颗粒可以移动,细胞质基质不流动D. 细胞质基质是流动的,细胞器是随细胞质基质的流动被动运动的6. 在观察显微镜时,经常遇到以下4种现象：1视野太亮；2只见视野不见图像；3图象结构不完整;试分析出现这些现象的可能原因,并提出排除方法;7. 用显微镜观察同一材料的同一部分时,高倍镜视野与低倍镜视野相比前者A. 亮,看到的细胞数目多B. 暗,看到的细胞数目少C. 亮,看到的细胞数目少D. 暗,看到的细胞数目多8,. 用显微镜观察葫芦藓叶的装片时,为使视野内看到的细胞数目最多,应选用A. 目镜5×,物镜10×B. 目镜10×,物镜15×C. 目镜5×,物镜40×D. 目镜10×,物镜40×9. 光学显微镜所能分辨的最小长度单位是A. 厘米cmB. 毫米mmC. 微米μmD. 纳米nm10. 用显微镜观察装片时,要将物像从视野的左方移到正中,装片的移动方向应是A. 向右方B. 向上方C. 向左方D. 向下方11. 某学生在显微镜下观察落花生子叶的切片,当转动细准焦螺旋时,有部分细胞看得清晰,另一部分细胞较模糊,这是由于A. 反光镜未调节好B. 标本切得厚薄不均C. 细准焦螺旋未调节好D. 显微镜物镜损坏12. 下面①—⑤是用普通光学显微镜观察时的几个操作步骤,在显微镜下要把视野中的物像从如图中I转为II,正确简便的操作步骤一般是①转动粗准焦螺旋②调节光圈③转动细准焦螺旋④转动转换器⑤移动标本A. ④→⑤→③→②B. ②→①→⑤→④C. ⑤→④→②→③D. ①→②→③→④13. 用显微镜的一个目镜分别与4个不同倍数的物镜组合起来观察已发生质壁分离的细胞装片;当成像清晰时,每一物镜与载玻片的距离如图6-3所示;如果载玻片位置不变,用哪一物镜在一个视野中看到的细胞最多14. 一个细小物体被显微镜放大50倍,这里“被放大50倍”指放大该细小物体的A. 体积B. 表面积C. 像的面积D. 长度或宽度15. 当显微镜的目镜为10×,物镜为10×时,在视野直径范围内可看到相连的8个细胞;若目镜不变,物镜换成40×时,则在视野中可以看到这8个细胞中的A. 2个B. 4个C. 16个D. 32个16. 显微镜视野中用于指示的“指针”是用头发制作的,这根头发应安放在A. 物镜内B. 目镜内C. 镜筒内D. 装片上17. 在光学显微镜下观察细胞质流动的实验中,你看到细胞内正在流动的结构是A. 内质网B. 叶绿体C. 高尔基体D. 液泡18. 某同学做洋葱根尖细胞有丝分裂实验时,高倍镜下观察到一个呈正方体的细胞,染色体形态和数目非常清晰,但是染色体颁在整个细胞中;按形态和数目的清晰程度,此细胞应为中期；按染色体分布位置,此细胞应为前期;请你分析一下此细胞应为哪一时期,为什么19. 如图为黑藻细胞的细胞质环流示意图,视野中的叶绿体位于液泡的右方,细胞质环流的方向为逆时针,则实际上,黑藻细胞中叶绿体的位置和细胞质环流的方向分别为A. 叶绿体位于液泡的右方,细胞质环流的方向为顺时针B. 叶绿体位于液泡的左方,细胞质环流的方向为逆时针C. 叶绿体位于液泡的右方,细胞质环流的方向为逆时针D. 叶绿体位于液泡的左方,细胞质环流的方向为顺时针20. 用普通光学显微镜观察切片时,当用低倍物镜看清楚后,转换高倍镜却看不到或看不清原来观察的物体.不可能的原因是A. 物体不在视野中央B. 切片放反,盖玻片在下C. 低倍物镜和高倍物镜的焦点不在同一平面D. 未换目镜21. 某学生在实验时,先用一块洁净纱布揩拭镜头,再在一干净载玻片中央滴一滴清水,放入一小块植物组织切片,小心展平后,放在显微镜载物台正中央,并用弹簧夹片压住;然后在双眼侧视下,将物镜降至距玻片标本约1cm~2cm处停止;用左眼朝目镜里观察,同时转动粗调节器,缓缓上升镜筒;请指出该生操作中不正确的地方;。
研究光声显微成像的原理与方法
研究光声显微成像的原理与方法光声显微成像是一种将光学和声学相结合的新型成像技术，被广泛应用于生物医学、材料科学和纳米科学等领域。
它能够实现高分辨率、无损伤的成像，为研究微观结构和功能提供了一种强有力的工具。
本文将介绍光声显微成像的原理和方法，并探讨其在不同领域的应用。
一、光声显微成像的原理光声显微成像的原理基于光声效应，即光能转化为声能的过程。
当被激发的样品吸收激光脉冲后，会发生热膨胀，产生声波信号。
通过检测和分析这些声波信号，可以重建样品的图像。
光声显微成像结合了光学的高分辨率和声学的深部成像能力，因此可以实现对生物组织和材料的高分辨率成像。
二、光声显微成像的方法1. 脉冲光源：光声显微成像常用的脉冲光源是飞秒激光器，它能提供高能量、短脉冲宽度的激光束。
这种脉冲光源可以在短时间内产生足够的热膨胀和声波信号，从而实现高分辨率的成像。
2. 光学和声学系统：经过光学透镜的聚焦，激光束被聚集在待测样品上。
样品吸收激光能量后，产生声波信号。
声波信号经过高频超声探测器接收和放大，然后被转化为电信号，并通过数据采集系统记录下来。
3. 数据处理和图像重建：采集到的声波信号需要进行数据处理和重建，以得到高质量的图像。
常用的方法有倒数滤波和延迟和和相加方法。
通过这些方法，可以有效地抑制噪声，提高图像的对比度和分辨率。
三、光声显微成像的应用1. 生物医学领域：光声显微成像在生物医学领域应用广泛。
它可以成像生物组织及其内部结构，实现对肿瘤、血管、神经等病理变化的检测和诊断。
与传统的光学成像技术相比，光声显微成像具有更高的分辨率和更深的成像深度，可以为早期癌症的检测和治疗提供有力支持。
2. 材料科学领域：光声显微成像在表面粗糙度测量、涂层检测和微纳米材料研究等方面有着重要的应用。
通过对材料的声波信号进行成像，可以获得材料的形貌、力学性能等信息，为材料科学的研究和开发提供了新的手段。
3. 纳米科学领域：光声显微成像在纳米科学领域具有潜在的应用前景。
2-2 透射电子显微镜
(a) 物镜和第一中间镜关闭
(b, c) 物镜下的小透镜OM透镜关闭
不同模式下成像透镜系统的光路图
1. 物 镜 用来获得第一幅高分辨率电子显微图像或电子衍射花样的透 镜。电镜的分辨率主要取决于物镜，必须尽可能降低像差。 物镜通常为强励磁、短焦透镜（f = 1-3mm）,放大倍数 100—300倍，目前，高质量的物镜其分辨率可达0.1nm。
3) the necessary electronics (lens supplies for focusing and deflecting the beam and the high voltage generator for the electron source) 4) software
电子光学系统：
统进行调整。
透射电子显微分析模式不同，对入射到样品的电子束要求
也不同。照明透镜系统可以实现从电子束平行照明到大会聚 角电子束照明条件。 主要通过两级聚光镜、汇聚小透镜和物镜的不同组合来实 现，不同的电镜模式不同。
两级聚光镜模式
聚光镜的作用是会聚电子枪发射出的电子束，调节照明强 度、孔径角和束斑大小。一般采用双聚光镜系统，如图所示。 C1—为强磁透镜， M
常用附件： EDAX 能谱仪
FIGURE 1.9. A selection of different commercial TEMs:
(B) Zeiss HRTEM with a Cs corrector and an in-column energy (A) JEM 1.25 MeV HVEM filter and an in-column energy filter
1. 电子照明系统 (电子枪，会聚镜系统） 2. 试样室 3. 成像放大系统 4. 图象记录装置
显微成像技术在生物医学中的应用
显微成像技术在生物医学中的应用随着时代的发展，生物医学领域的技术也在不断进步。
其中，显微成像技术作为生物学领域中不可或缺的技术手段，对于生物医学领域有着巨大的应用价值。
本文将介绍显微成像技术在生物医学中的应用。
一、显微成像技术的概述显微成像技术是指通过显微镜将被观察样本的图像所得到的技术。
它是在对细胞、分子等微观结构的研究过程中，用来观察、研究和分析样本结构和组成的主要工具。
目前，随着微电子技术和计算机技术的不断发展，显微成像技术得到了广泛的应用和发展，成为了研究生物学领域和医学领域的重要技术手段。
二、显微成像技术在生物医学中的应用1. 显微镜下的细胞观察显微成像技术可以通过显微镜来观察细胞构成的内部结构。
通过不同的显微成像技术，可以实现生物组织内和细胞内各种生物大分子（如蛋白质、核酸、脂类等）的高空间和时间分辨率的研究。
在生物医学研究中，可以通过显微成像技术来观察癌细胞的形态、数量、活动状态等信息。
这对于癌症的诊断和治疗具有重要的意义。
显微成像技术还可以观察神经元轴突的细胞内运输，揭示物质在生物体内的运动规律，帮助理解神经系统的功能。
2. 时间分辨显微成像技术时间分辨显微成像技术是一种用于观察生物体内分子、细胞或组织的动态过程的技术。
它可以精确地记录分子运动的时间、位置和强度，从而深入探究分子在细胞内的实时运动状态和交互作用。
在药物研究中，利用时间分辨显微成像技术可以观察药物在细胞内的运输规律和药物分子与受体之间的相互作用，从而加速药物研发的进程。
3. 三维显微成像技术三维显微成像技术是指将生物体内的结构以3D的方式呈现出来，为我们提供了更加清晰直观的观察图像和更多的细节信息。
在蛋白质生物化学和药物研究中，三维显微成像技术能够显示空间结构及构型等信息，帮助研究物质的分子结构，从而找到更好的方法来阻止疾病的产生。
三、显微成像技术的前景与展望随着我国生物医学领域的不断发展，显微成像技术在生物医学研究中的作用和应用也日益重要。
光学显微成像实验报告
一、实验目的1. 了解光学显微成像的基本原理及操作方法。
2. 掌握光学显微镜的使用技巧，包括光源调节、物镜和目镜的选择、调焦等。
3. 通过实验，观察不同样品的显微结构，提高对生物组织结构的认识。
二、实验原理光学显微成像是一种基于光学原理的成像技术，通过光学显微镜对样品进行观察和分析。
实验中，光源发出的光线经过物镜、样品和目镜等光学元件，最终在目镜处形成样品的放大像。
光学显微镜的成像质量受到多种因素的影响，如光源的稳定性、物镜的分辨率、样品的制备质量等。
三、实验仪器与材料1. 光学显微镜2. 物镜：4倍、10倍、40倍、100倍（油镜）3. 目镜：10倍、20倍4. 光源：卤素灯5. 样品：细胞、组织切片、矿物等四、实验步骤1. 打开显微镜，调整光源亮度，使视野明亮。
2. 选择合适的物镜和目镜，使放大倍数适中。
3. 将样品放置在载物台上，用夹具固定。
4. 调节粗调和微调旋钮，使样品清晰地出现在视野中。
5. 观察样品的显微结构，记录观察结果。
6. 重复步骤4-5，观察不同样品的显微结构。
五、实验结果与分析1. 观察细胞样品，发现细胞具有明显的细胞核、细胞质和细胞膜等结构。
2. 观察组织切片，发现组织具有层次分明、结构复杂的特征。
3. 观察矿物样品，发现矿物具有独特的晶体结构和颜色。
六、实验讨论1. 光学显微镜的成像质量受到多种因素的影响，如光源的稳定性、物镜的分辨率、样品的制备质量等。
在实验过程中，应尽量保证这些因素处于最佳状态，以提高成像质量。
2. 不同类型的样品需要选择合适的物镜和目镜进行观察。
例如，观察细胞时，可以选择4倍或10倍的物镜和目镜；观察组织切片时，可以选择40倍或100倍的物镜和目镜。
3. 实验过程中，应保持显微镜的清洁，避免灰尘和油污影响成像质量。
七、实验总结本次实验通过观察不同样品的显微结构，使我们更加深入地了解了光学显微成像的基本原理和操作方法。
在实验过程中，我们学会了如何选择合适的物镜和目镜、如何调整显微镜的焦距等。
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LSM 510系统光路图
1.Optical fibers conducting laser light 2.Collimators 3.Beam combiner 4.Main dichroic beamsplitter 5.Scanner 6.Scanning lens 7.Secondary dichroic beamsplitter 8.Secondary dichroic beamsplitter 9.Secondary dichroic beamsplitter
光谱串扰
激发串扰和发射串扰
以GFP和DsRed为例，说明如何避免激发串扰。
假如细胞内同时转入了GFP和DsRed，可以458nm激发GFP的荧光，543nm激发DsRed
的荧光，此时检测到的基本是单个探针的荧光。 如果以488nm或514nm激发，则会同时激发二者的荧光。
传统的解决串扰的方法是通过滤光片的选取来检测某一探针的最强荧光光谱区段，以 与光谱上相邻近的探针的荧光区分开。 例如，同时被GFP和YFP标记的细胞，以488nm激发时，同时可检测到GFP和YFP两者 的荧光。为区分二者的荧光，可用500-520nm滤光片收集GFP的荧光，而用535-545nm 滤光片收集YFP的荧光。虽然这个方法不能完全清除相邻探针的荧光串扰，但主要贡 献还是来自所检测的探针。
有效观测时间长。荧光染料的光致漂白(即染料分子会因激发次数过多结构受到破 坏而失效)是制约实验观测、影响实验结果准确性的主要因素之一。对于共聚焦显 微镜, 由于整个激光照射区域内的染料分子都会被激发, 导致非焦点区域的染料过 早漂白。而双光子激发只产生在焦点附近的一个极小区域中, 从而大大减少了对非 观测区荧光染料的破坏，使实验能够在保持生物体活性的前提下长时间进行。
物的荧光信号，并可较好地消除荧光串色的影响、最大限度减少样品荧光信号的损失。
META 技术在共聚焦显微镜的应用是荧光检测技术的重大突破，适合目前不断发展 的新荧光标记技术的应用（如多荧光蛋白标记等），使得对细胞荧光信号的动态分析 更方便和高效，如 FRAP，FRET 分析等，为生命科学研究提供了更加灵活、多样的 手段和方法。
3. Main dichroic beam splitter wheel (8 positions)
4.Projection lens D detector 6.Camera mirror
7. Auxiliary beam splitter wheel (8 positions)
8.Channel 1of the emission filter wheel (6+1 posotions) 9.Pinhole channel 1 (motorized in x, y and z) 10.Detector channel 1: fiber-coupled APD 11.Channel 2 of the emission filter wheel (8 posotions) 12.Pinhole channel 2 (motorized in x, y and z) 13.Detector channel 2: fiber-coupled APD
荧光互相关函数得到的信息：两种成分有没有发生相互作用， 函数的幅度与结合成分的比例成正比。
用荧光互相关FCCS识别和检测凝血酶
ConfoCor2荧光相关谱实验装置
ConfoCor 2系统光路图
1.Optical fiber of the laser module 2.Motorized collimato
制，如果想提高收集效率，就需要扩大孔宽度，而这将导致分辨率下降，反之亦然。
对探测光路的要求低。由于激发光与发射荧光的波长差值加大以及自发的三维滤波 效果，多光子显微镜对光路收集系统的要求比共聚焦显微镜低得多，光学系统相对 简单。
Байду номын сангаас
适合多标记复合测量。许多染料荧光探针的多光子激发光谱要比单光子激发谱宽阔， 这样，可以利用单一波长的激发光同时激发多种染料，从而得到同一生命现象中的 不同信息，便于相互对照补充。例如，EGFP 和DsRed 的单光子激发波长分别为488 nm 和568 nm，无法实现利用一束单波长激光同时激发。Jakobs 等利用双光子技术， 用925 nm激光同时激发了两种荧光蛋白，观察了它们在Escherichia coli 内的表达情 况。
分光谱的原理
1. 获取λ-Stacke
使用LSM 510 META系统的META通道获取样品的λ-Stacke。这个通道包括分光光 栅和 32 个高灵敏度 PMT 检测器。每个探测器的最小光谱带宽为10.7nm。
2. 参考光谱的定义
不同探针定域于样品的不同区域。
不同探针在样品中交错存在，空间上无法严格区分开。
FCS技术的优点
FCS 测量与传统的其他方法相比其主要优点在于：很高的灵敏度(甚至达到单分子探 测的水平)、测量时不破坏研究体系的平衡状态、可以进行实时监测。FCS 技术通过 对微小体积内荧光分子激发荧光的涨落做相关分析，可以得到产生荧光涨落过程的
信息。在传统的方法中，样品的体积由聚焦激光束和针孔确定，荧光通过一个高数
多光子激发的光源
发生双光子吸收的概率依赖于两个光子在荧光基团内吸收截面的空间位置重叠和到达 时间重叠。双光子激发需要非常高的局部瞬时强度，为得到该强度，激光脉冲峰与基
底之比可达106。但如此强的能量只集中在极短的激光光脉冲宽度(1 飞秒= 10- 15秒)内，
占空比很小，对生物样本并不会造成很大的伤害。双光子显微镜使用高能量锁模脉冲 激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度 只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80 至 100 兆赫。例如使用76MHz重复率的100飞秒的 激光脉冲，单脉冲能量只有纳焦耳量级。利用多光子激发，对原本必须用紫外波长(例 如350nm)单光子激发的样本可改用红光波长的双光子(700nm)激发，大大减小了对样本 的伤害。而且，多光子激发可以使用调谐激光器，例如可调谐兰宝石激光器，可输出 700-1000nm波长的激光。
多光子激发原理示意图
(1)荧光分子的多光子激发需要的激光波长比
多光子激发的特点
单光子长。例如, 双光子激发需要的激光波
长大约是单光子激发所需激光波长的二倍。 因此多光子激发能够用红外或者近红外光代 替紫外光作为激发光源。 (2)多光子激发只产生在焦点附近的一个极小 区域中。单光子吸收截面R1=10-17-10-18cm2,
穿透深度深。生物体(细胞、组织等)一般都是高散射体。由于散射系数反比于入射
光波长的四次方，多(N )光子成像将散射系数减弱到原来的1/N 4，使大部分入射光
强能到达样品焦平面，提高了穿透深度，有利于获取深层次组织的清晰荧光图像。
荧光收集率高。与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器(针孔)，提高了 荧光收集率。收集效率提高直接导致图像对比度提高。而共聚焦显微镜受到小孔限
单光子与双光子荧光激发比较 (样品为罗丹明B水溶液)
这是多光子激发的一个基本点。而单光子激
发区域为两个锥形区, 在整个照明区均产生 荧光。
双光子激发与单光子激发的比较
多光子激光扫描显微镜的特点
对生物样品的光损伤小。克服了共聚焦显微镜在活体细胞和组织观测中的主要缺陷, 减少了焦点外的光学损害和背景光强度, 极大地降低了紫外光对生物体正常生理活 动的破坏和影响, 为活体观测和研究提供了有利条件。
3. 光谱分离
为了分离光谱，需要样品的λ-Stacke和样品中各个探针的参考光谱。 Linear Unmixing软件通过线性运算来实现光谱分离，即计算每个像素点各个探针 发射信号的强度。因为每一个像素点对应样品的一点，此点检测的光谱S(λ)sum是 各个探针在此点发射信号的累积，可以下式表示。
所以，已知各个探针的参考谱S(λ)dyeA，B and C，就可计算出各个探针的荧光强度 intensitydyeA，B and C。
钛宝石锁模飞秒激光器（MIRA-900F，美国Coherent公司） 输出脉冲宽度：120fs 重复频率：76MHz 平均输出功率：1.3W 可调谐波长范围：700-980nm
荧光相关谱技术
荧光相关谱(Fluorescence correlation spectroscopy，简称FCS)技术是一项近年发 展很快的实验技术，在生物学领域研究中、特别是对活体中动态过程的测量显示出广 阔的应用前景。 FCS 技术测量单个粒子或分子经过一个非常小的荧光激发区域(一般小于1μｍ3)时所 发出的荧光，通过分析荧光涨落的自关联函数得到粒子扩散系数、激发区域内的粒子 数等信息。
LSM 510 META系统 META 通道：分光 光栅和 32 个高灵敏度 PMT 检测器）
LSM 510 META系统光路图
1.Optical fibers 2.Motorized collimators 3.Beam combiner
4.Main dichroic beamsplitter
5.Scanning mirrors 6.Scanning lens 7.Objective lens 8.Specimen 9.Secondary dichroic beamsplitter 10.Confocal pinhole 11.Emission filters 12.Photomutiplier 13.META detector 14.Neutral density filters 15.Monitor diode 16.Fiber out
10.Pinholes
11.Emission filters 12.Photomultipliers 13.Neutral density filters