鹅细小病毒YG株的鉴定及在器官中的分布_邵周伍林

Ｔｅｌ：１８９４６０６６０６７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｎｚｈａｎｇ０３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ
第９期 邵周伍林等：鹅细小病毒 ＹＧ 株的鉴定及在器官中的分．１ 病 料 来 源 病料来自黑龙江省某养鹅场的疑似小鹅瘟患病 雏 鹅 ，该 养 鹅 场 的 ５ 日 龄 雏 鹅 出 现 精 神 委 顿 、食 欲 减 退 、排 黄 绿 色 稀 粪 等 临 诊 症 状 ；死 亡 雏 鹅 经 剖 检 后 发 现 肝 、肾 瘀 血 肿 大 ，肠 黏 膜 充 血 、出 血 ，小 肠 下 段 极 度 肿大，剖检可见坏死 脱 落 的 肠 黏 膜 和 纤 维 素 性 渗 出 物所形成的栓塞。 １．２ 细 胞 、抗 体 和 实 验 动 物 鹅胚成纤维细胞（ＧＥＦ）按照常规方 法 制 备 。 ［４－５］ 抗鹅细小病毒 ＶＰ３ 蛋 白 单 克 隆 抗 体 为 本 实 验 室 制 备 。 ［６］ 无母源抗 体 的 １ 日 龄 雏 鹅 及 １１ 日 龄 鹅 胚 均 购自哈尔滨新立养殖场。 １．３ 试 剂 和 主 要 仪 器 ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＰＣＲ 试 剂 盒、ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、ｐＭＤ１８－Ｔ 载 体 均 购 自 宝 生 物 工 程 （大 连 ） 有限公司。 胎 牛 血 清 购 自 Ｇｉｂｃｏ 公 司。ＤＭＥＭ 购 自 ＨｙＣｌｏｎｅ公司。异硫氰 酸 荧 光 素 （ＦＩＴＣ）标 记 的 山羊 抗 小 鼠 ＩｇＧ 抗 体 购 自 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公司。ＡｘｙＰｒｅｐ质粒 ＤＮＡ 小量 试 剂 盒 购 自 爱 思 进 生物技术 （杭 州）有 限 公 司。 Ｗ５２１１ 柱 式 小 量 胶 回 收试剂盒 购 自 上 海 华 舜 生 物 工 程 公 司。ＥＶＯＳ Ｆ１ 荧 光 倒 置 显 微 镜 为 美 国 ＡＭＧ 公 司 产 品。ＣＫＸ４１ 型光学显微镜为日本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公司产品。 １．４ 病 毒 的 分 离 无菌采集送 检 雏 鹅 的 肝、脾、肠 道 及 其 内 容 物， 将 病 料 剪 碎 后 ，使 用 玻 璃 匀 浆 器 研 磨 制 成 组 织 匀 浆 。 反复冻融３次 后，以 ３ ０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ３０ｍｉｎ，取 上 清，向 病 料 上 清 液 中 加 入 工 作 浓 度 为 １ ０００Ｕ／ｍＬ 的青 霉 素 和 ０．１ｍｇ／ｍＬ 的 链 霉 素。 病 料 上 清 液 按 １∶１００的 比 例 用 灭 菌 ＰＢＳ 稀 释 后，经 尿 囊 腔 接 种 １１日龄鹅胚，每枚接种０．２ｍＬ，另 一 组 接 种 等 量 的 灭菌 ＰＢＳ设为对照。接种后的鹅胚置 于 ３７ ℃ 的 孵 化 器 内 继 续 孵 育 ，每 天 照 胚 ２ 次 ，观 察 鹅 胚 的 生 长 发 育 及 死 亡 情 况 ，弃 去 ２４ｈ 之 内 死 亡 的 鹅 胚 ，收 集 ２～ ５ｄ 内 死 亡 的 鹅 胚 ，并 置 于 ４ ℃ 冰 箱 内 过 夜 后 收 集 尿 囊液。 １．５ ＰＣＲ 检测 取 鹅 胚 尿 囊 液 ２００μＬ，采 用 ＳＤＳ 和 蛋 白 酶 Ｋ 的方法 提 ［７］ 取病毒基因组 ＤＮＡ，利用本实验 室 建 立 的 ＧＰＶ ＰＣＲ［８］对鹅胚尿囊液中的 ＧＰＶ 进行检测。 １．６ ＩＦＡ 检测 将调整好浓度的 ＧＥＦ 细胞悬液加入６孔板内， 并且 采 用 同 步 接 毒 的 方 法，向 细 胞 悬 液 内 按 １∶２０
鹅细小病毒 ＹＧ 株的鉴定及在器官中的分布
邵 周 伍 林 ，李 晨 曦 ，刘 明 ，张 云 ＊
（中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室 ，黑龙江 哈尔滨 １５０００１）
摘要：本研究从黑龙江省某养鹅场送检的小鹅瘟疑似病例中分离到一病原 ，采 用 鹅 胚 接 种、ＰＣＲ 检 测、 ＩＦＡ 检测、病毒效价测定和动物致病性试验等方法对该病原进行鉴定 。结果显示，所分离到的病原为鹅细小 病毒（ＧＰＶ），将其命名为 ＹＧ 株；ＹＧ 株的 ＴＣＩＤ５０为１０４．０／０．２ｍＬ；对 ＹＧ 株 全 基 因 组 进 行 扩 增 和 序 列 分 析 后发现，ＹＧ 株与标准毒株 Ｂ 株的核苷酸同源性最高，高 达 ９８．３％；病 理 学 观 察 显 示，ＧＰＶ 对 感 染 后 的 雏 鹅 具有明显的组织损伤，主要侵害易感雏鹅的消化系统；免疫组织化学法检测结果 表 明，抗 原 主 要 分 布 在 雏 鹅 的 小 肠 、肝 、肾 及 脾 中 ，其 中 小 肠 中 的 抗 原 含 量 最 高 。
（体积比）接入鉴 定 为 阳 性 的 ＹＧ 株 鹅 胚 尿 囊 液，置 于３７ ℃、５０ ｍＬ／Ｌ ＣＯ２ 培 养 箱 内 培 养。 培 养 ５ｄ 后，弃去细胞培养液，用 ＰＢＳ清洗 ２ 次，每次 ５ｍｉｎ。 之后用４０ｇ／Ｌ 多聚甲醛在室温下固定３０ｍｉｎ，再用 ＰＢＳ 清 洗 ３ 次。 加 入 含 有 １％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ 的 ＰＢＳ，置于４ ℃ １０ｍｉｎ 后，用 ＰＢＳ 清 洗 ３ 次。 然 后 加入含４０ｇ／Ｌ ＢＳＡ 的 ＰＢＳ，置 于 ３７ ℃ ３０ｍｉｎ 后， 用 ＰＢＳ清 洗 １ 次。 加 入 １∶５ ０００ 稀 释 的 抗 ＧＰＶ ＶＰ３蛋白单克隆抗体，３７℃孵育２ｈ后，ＰＢＳ清洗 ３ 次。然后加入１∶５０稀释的 ＦＩＴＣ 标记的山羊抗小 鼠ＩｇＧ 抗体，３７℃孵育１ｈ后，ＰＢＳ清洗３次。同时 设立未接毒的 ＧＥＦ 作为对照，并在荧光显微镜下观 察有无特异性绿色荧光。 １．７ 病 毒 组 织 培 养 半 数 感 染 量 （ＴＣＩＤ５０）的 测 定 采用同步接毒法，将 ＹＧ 株在 ＧＥＦ 上连续传代 培养５代，收 获 病 毒 培 养 物。 用 ＤＭＥＭ 将 收 获 的 待检病毒液在灭菌 ＥＰ 管内做 １∶１０ 系 列 稀 释。 取 １０－１至 １０－５ 共 ５ 个 稀 释 度 分 别 接 种 于 铺 满 单 层 ＧＥＦ 的４８孔板内，每个稀释度 设 ６ 个 孔，剂 量 为 每 孔２００μＬ，同时设立正常 ＧＥＦ 为 对 照，置 于 ３７ ℃、 ５０ｍＬ／Ｌ ＣＯ２ 培养箱内感作 ２ｈ，之 后 吸 去 病 毒 液， 换为含有２０ｍＬ／Ｌ 胎 牛 血 清 的 细 胞 培 养 液 继 续 培 养５ｄ。按１．６ 所 述 方 法，进 行 ＩＦＡ 检 测。 将 病 毒 抗原检测为阳性的细胞孔及阴性细胞孔按所稀释的 病 毒 效 价 进 行 统 计 ，列 出 累 计 表 格 ，计 算 出 阳 性 细 胞 孔占细胞孔总数的百分比，按照 Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法 计 算病毒的 ＴＣＩＤ５０。 １．８ ＧＰＶ ＹＧ 株全基因组序列扩增及分析 采用 ＳＤＳ和 蛋 白 酶 Ｋ 的 方 法 提 ［７］ 取 ＹＣ 株 病 毒 ＤＮＡ，利 用 本 实 验 室 已 设 计 好 的 扩 增 引 物 对 ［９］ ＹＧ 株的全 基 因 组 序 列 进 行 扩 增。 采 用 Ｗ５２１１ 柱 式小量胶回收试剂盒对 ＰＣＲ 产物进行纯化，纯化后 的 ＰＣＲ 产物与 ｐＭＤ１８－Ｔ 载 体 连 接，连 接 产 物 转 化 至 ＤＨ５α 感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的 ＬＢ 琼脂平 板 上，倒 置 于 ３７ ℃ 温 箱 内 过 夜 培 养。 用 ＡｘｙＰｒｅｐ质 粒 ＤＮＡ 小 量 试 剂 盒 提 取 质 粒，质 粒 经 过 鉴 定 后 ，送 北 京 华 大 基 因 科 技 有 限 公 司 进 行 测 序 。 采用 ＤＮＡＳｔａｒ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ Ｖ ７．１）软 件 进 行 序 列 拼 接，并与 ＧｅｎＢａｎｋ中 收 录 的 其 他 ＧＰＶ 毒 株 的 基 因 序列进行比对分析。 １．９ 易 感 雏 鹅 致 病 性 试 验 将２０只无母源 抗 体 的 １ 日 龄 雏 鹅 适 应 性 饲 养 ２ｄ 后 ，随 机 分 为 ２ 组 ，每 组 １０ 只 。 试 验 组 每 只 雏 鹅 腿部 肌 肉 注 射 ＹＧ 株 细 胞 培 养 物 ０．２ ｍＬ，其 ＴＣＩＤ５０为 １０４．０／０．２ ｍＬ，另 一 组 注 射 ＰＢＳ 设 为 对
成栓塞［３］。该病自１９６１年在我国首次被发现 以 来， 一直在全国范围内 广 泛 蔓 延 和 流 行，对 我 国 水 禽 养 殖业造成重大的经济损失。 本研究对新分离到的 ＧＰＶ ＹＧ 株进行了 鉴定， 对其全基因组序列 进 行 了 测 定 和 比 对 分 析；通 过 致 病性试验，对 感 染 ＧＰＶ 的 雏 鹅 进 行 免 疫 病 理 学 观 察。本研究首次报 道 了 ＧＰＶ 在 被 感 染 雏 鹅 各 组 织 器官中的 分 布，为 ＧＰＶ 的 致 病 性 研 究 提 供 了 新 的 科学资料。
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｇｏｏｓｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｏｒｇａｎｓ
鹅细小病毒（ｇｏｏｓｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＧＰＶ）属于 细 小 病毒 科 （Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、细 小 病 毒 属 （Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ） 的成员。鹅细 小 病 毒 为 单 股 线 性 ＤＮＡ 病 毒，病 毒 粒子的 直 径 为 ２０～２２ｎｍ，无 囊 膜，呈 二 十 面 体 对 称 。 ［１］ 鹅细小病 毒 感 染 也 称 “小 鹅 瘟”，是 一 种 主 要 感染１月龄以内雏 鹅 和 雏 番 鸭 的 高 发 病 率、高 死 亡 率的高度接触性传染病 。 ［２］ 患病雏鹅解剖可见 小 肠 呈卡他性或纤维素 性 坏 死 性 炎 症 变 化，小 肠 中 下 端 肠黏膜呈坏死性脱 落，并 与 纤 维 素 性 渗 出 物 一 起 形
收 稿 日 期 ：２０１５－０５－２０；修 回 日 期 ：２０１５－０７－２９ 基 金 项 目 ：现 代 农 业 水 禽 产 业 技 术 体 系 岗 位 科 学 家 专 项 （ＣＡＲＳ－４３－１０）；国 家 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目 （３１０７２１３２） 作者 简 介：邵 周 伍 林 （１９９０－），男，云 南 昆 明 人，硕 士 生，研 究 方 向 为 水 禽 病 毒 病。 ＊ 通 信 作 者，副 研 究 员，硕 士 生 导 师，
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｈａｒｂｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ１５０００１，Ｃｈｉｎａ）