实验2荧光显微镜的使用

一、光源
工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气
压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气
压力，这一过程一般约需5～15min。 超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解 离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和 蓝紫光，足以激发各类荧光物质。
超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良
口腔上皮细胞
口腔上皮细胞 荧光
松树茎部横切面
松树茎部横切面 荧光
松树茎部横切面
松树茎部横切面 荧光
向日葵茎部横切
向日葵茎部横切 荧光
头发
头发 荧光
五、注意事项
1. 荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观察。 2. 使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激 发光源，保护眼睛。
实验报告
实验目的 实验用品 实验原理（荧光显微镜的原理） 实验方法（荧光显微镜的操作方法） 思考题
用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜；
高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启 动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。
荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：
1. 照明方式通常为落射式，即光源通过物镜
投射于样品上；
2. 光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通 显微镜； 3. 有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可 见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护
人眼。
荧光素的特性
荧光素 DAPI AMC A Hoe chst 33258 FITC Acridine O range Acridine Ye llow C Y3 TRITC Propidium Iodide 激发波长 发射波长 372 350 365 490 490 470 552 541 530 456 450 465 520 590 550 565 572 615
一、光源
超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包 括变压、镇流、启动几个部分。 在灯室上有调节 灯泡发光中心的系统，灯 泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有 集光透镜。 由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因 此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发 生爆炸时造成操作。
二、滤色镜系统
细胞生物学实验
任课教师：齐云峰
实验二
荧光显微镜的使用
实验目的
掌握荧光显微镜的结构、原理
Baidu Nhomakorabea
及其使用方法。
实验用品
荧光显微镜及荧光装置附件。
人口腔上皮细胞装片，植物茎部组
织装片。
实验原理
荧光显微镜是一种较为常用的光学显微镜。它
是由光源、滤色镜系统和光学系统等主要部件组成
。
其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进
滤镜一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后 面字母代表玻璃，数字代表型号特点。 如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是 蓝色的第一个字母，G是玻璃的第一个字母； 我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于 BG12的蓝色滤镜名为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个 字母，B是玻璃拼音的第一个字母。 不过有的滤镜也可以透光分界波长命名，如K530，就 是表示阻挡波长530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有 的厂家的滤镜完全以数字命名，如美国Corning厂的NO.5-58 ，即相当于BG12。
其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大
倍数增加其荧光减弱，所以对观察较大的标本材料 较好。
透射荧光显微镜原理
目镜
透射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
物镜
暗场聚光镜 汞灯
激发滤色镜
透射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 汞灯箱
暗场聚光镜 激发滤色镜
2．反射式荧光显微镜
这是近代发展起来的新式荧光显微镜，是激发
光从物镜后部进入物镜，向下落射样品，激发出荧
2．反射式荧光显微镜
如换用不同的激发滤片／双色束分
离器／阻断滤片的组合插块，可满足不
同荧光反应产物的需要。 此种荧光显微镜的优点是视野照明 均匀,成像清晰,放大倍数愈大荧光愈强 。
透射式
落射式
四、荧光显微镜使用方法
1．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最
亮点。
2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所
光，荧光反射向上再进入物镜。
反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
汞 灯
分色镜 物 镜 激发滤色镜
标 本
反射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 激发滤色镜
孔径光栏（FS） 视场光栏（AS）
紫外线 保护罩 分色镜
汞 灯
反射式荧光显微镜原理
落射光激发的荧光法是近代显微镜检术中 新发展出来的一种强有力的反差增强法。 它将激发荧光用的光源改在物镜的上方， 光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品， 从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿透反光 镜而由目镜观察。
二、滤色镜系统
3、二向色镜（DM）
二向色镜位于汞灯激发滤色镜构成的平行光轴与目镜 和物镜构成的竖直光轴的两轴垂直相交处,斜向安装于光路之中 。与照明光路成45°角，承担色光的分流作用。
二向色镜对激发光波长的光（即透过激发滤光片的光）
，有很高的反射率。 而对由标本发出的荧光波长区的光，则有很高的透射率
实验原理
某些物质经波长较短的光照射后，分子被激 活,吸收能量后呈激发态。 其能量部分转化为热能或用于光化学反应外 ，相当一部分则以波长较长的光能形式辐射出来， 这种波长长于激发光的可见光称为荧光。 荧光显微镜是利用一定波长的光激发标本发 射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧 光图像。
什么是荧光 ?
好的散热条件，工作环境温度不宜太高。
一、光源
200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的 情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命 愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。 因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用 过程中其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却 才能重新启动。 点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完 全而损坏电极，一般需要等15min。
尼康所提供的滤光块种类很多，按客户要求选
择配套。
三、荧光显微镜的光路
荧光显微镜按激发光对样品的激发方向 或方式，分有两种： 1．透射式荧光显微镜 2．反射式（落射式）荧光显微镜
1．透射式荧光显微镜
激发光束通过聚光器穿过标本材料来激发荧
光的，诱发的荧光从物镜前方进入物镜。这是比较
旧式的荧光显微镜。
，即二色向镜起着反射激发光和透过荧光的重要作用。
二、滤色镜系统
一个滤光镜系统（即一个滤光块）由激发滤色
镜、二向色镜、阻挡滤色镜（三部分组成。
通过以上激发滤光片、二向色镜、阻挡滤光片 的相应组合，可以形成多种不同的激发方法，如紫 外（UV）、紫（V） 、兰（B）和绿（G）等（这些 名称是以激发光主波长的颜色而定的）。
滤色镜按用途或功能，主要分为两类： 1、激发滤色镜（exciter filter） 对于光源发出的混合光，选择透过能使标本产 生荧光的特定波长的光，同时阻挡对激发荧光无关的 光。 荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰值）， 利用滤色镜对光线选择吸收的能力，选用其透射光谱 ，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激发峰值）的激发 滤色镜，以便从汞灯发出的广谱光波中，选择透过最 宜波段的光线供用。
物质中的电子吸收光的能量由低能 状态转变为高能状态，再回到低能状态 时释放出的光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光
。
荧光的性质
保持固有的荧光特性
荧光波长＞激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、
荧光效率
荧光光源的作用
荧光光源不是作为照明的，而是
二、滤色镜系统
2、阻挡滤色镜（barrier filter）
阻挡滤色镜是用来阻挡掉没有被标本吸收的激 发光和某些波长较短的光线以及没有被选择透过的荧 光，以防伤害眼睛。 阻挡滤色镜的选用，应视荧光染料的荧光光谱 而定，要能够最大限度的透过所需荧光并阻断短波光 以及不需要波长的荧光。
二、滤色镜系统
要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻
断滤片。 落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要 求的激发滤片／二向色镜／阻断滤片的插块。
四、荧光显微镜使用方法
3.用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调 整光源中心,使其位于整个照明光斑中央。 4.放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意： 未装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼损伤；
荧光显微镜的基本结构组成
一、光源
由于标本发出的荧光和激发光相比，是非常微弱的，
因此荧光显微镜的光源强度必须很高，所以对于荧光显微 镜的光源我们通常采用高压汞灯。 汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光 ，且光亮度大，光度稳定。它是用石英玻璃制作，中间呈 球形，有两个钨电极，内充一定数量的汞和少量氩氖混合 气体。
行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样 品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。
透射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 汞灯箱
暗场聚光镜 激发滤色镜
透射荧光显微镜原理
目镜
透射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
物镜
暗场聚光镜 汞灯
激发滤色镜
反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
汞 灯
分色镜 物 镜 激发滤色镜
标 本
作为荧光色素产生荧光的激发光
。
实验原理
荧光有两种类型，一种是标本自身的原有荧光（自发 荧光），另一种是利用荧光色素和细胞的特定部分反应所产 生的荧光（次生荧光）。 自发荧光：在生物的某些组织中，经紫外线照射后能 直接发射出荧光的称为自发荧光（或直接荧光）。如植物组 织中的叶绿素，经紫外线照射后，即可发出红色荧光。 次生荧光：有些生物组织经紫外线照射后，并不能发 出荧光，但是当它吸收荧光染料后也可以产生荧光，称为次 生荧光（或间接荧光）。如吖啶橙，DAPI均可检测细胞内的 核酸。
六、思考题
1、什么是荧光？它是怎样发生的？ 2、荧光显微镜为什么要以汞灯为光源？ 3、激发滤色镜和阻断滤色镜的功能及区别？ 4、描述样品在荧光显微镜下与光学显微镜下 观察效果的差异。