仪器分析作业

仪器分析作业

生命科学学院 11硕

王峰

201111602

液相色谱和电泳结合分析蛋白YdiV 与FlhDC 之间相互作用

生命科学学院11硕 王峰 201111602

摘要: 转录因子FlhDC 是鞭毛三级合成中的关键调控子，它是鞭毛一级合成中的转录因子，它的表达水平对鞭毛以后的合成起关键作用。YdiV 蛋白是含有EAL 结构域蛋白中具有抑制菌体移动性的蛋白,可能结合FlhDC 抑制其活性。而这个过程的具体机制还不清楚。我的研究课题就是用大肠杆菌异源表达这两种蛋白，若表达出的蛋白有相互作用，那么在纯化后将这个复合物结晶，希望通过X 射线衍射的方法获得相互作用蛋白复合物的结构，从而进一步的研究军团菌的侵染机制。研究中的关键就是异源表达的两种蛋白是否有相互作用。为此，本文设计一个利用液相色谱和SDS 凝胶电泳相结合的分析方案来验证两种蛋白的相互作用。

关键词: 蛋白间相互作用 HPLC SDS-PAGE

一．实验背景

1.1 第二信使C-di-GMP

C-di-GMP(图1.1a)是近年来发现的广泛

存在于细菌中的一种第二信使分子, 被

认为与细菌的致病性, 毒性, 活动性以

及生物膜(Biofilm)的形成有关[1]。

C-di-GMP 在细菌中的浓度水平改变导

致细菌相应表型出现, 而C-di-GMP 的

浓度受两种酶的调控：鸟苷酸环化

酶

(DGC)和磷酸二酯酶

(PDE)（图1.1b ）。目前已知DGC 活

性一般由具有GGDEF(GGEEF)保

守序列的蛋白提供, PDE 活性由具

有EAL 或者是HD-GYP 保守结构域的蛋白提供[2]

1.2 YdiV 、FlhDC 简介

YdiV 是大肠杆菌内17个含EAL 结构域的蛋白之一，与沙门氏菌中的同源蛋白CdgR 有52%的序列相似性。并且YdiV 只含有一个单一的EAL 结构域，具有其特殊性(图1.2a)。

图 1.1a 图1.1b

图1.2a YdiV的保守结构域搜索结果

目前研究表明，YdiV的表达同时受到SdiA和来自费氏弧菌的AI-1分子的上调，不过后者发挥作用需要依赖SdiA。同时研究者发现YdiV和cAMP在两个QS系统之间交联的过程中起着重要作用[3]。

flhDC基因影响细菌运动性和生物膜形成.鞭毛的生成以及细菌的运动需要超过50 个基因的参与,这些基因通常分布在10多个操纵子上,组成一个大的调节子, 通过3个等级进行调控,下级基因的表达必须通过上一级基因的激活.由flhD和flhC 基因单独组成的flhDC操纵子编码调控细菌鞭毛基因表达的主调控因子FlhDC.位于鞭毛运动调节子三级调控系统的最高等级, 其编码产物FlhD和FlhC 共同组成FlhD4C2异六聚体结构转录激活蛋白, 激活第二等级基因的转录。

二．仪器分析方案

本实验的关键是大肠杆菌异源表达的真核蛋白YdiV和FlhDC是否折叠、修饰正确且有活性。得到YdiV与FlhDC的复合物的前提是两种蛋白能够进行相互作用。为了验证这两种蛋白的相互作用，我设计一个利用液相色谱和SDS凝胶电泳相结合的仪器分析方案。

2.1 分析方案步骤

通过几个月的实验，我已经得到了在大肠杆菌中异源表达的真核蛋白FlhDC 以及霍乱弧菌中的YdiV蛋白。这几种蛋白的克隆、表达步骤在本文中就不再赘述。蛋白的纯化首先利用GST或His标签纯化，并且在纯化后将除YdiV的其他蛋白的标签切掉，再分别利用离子交换柱和分子筛层析进行纯化，得到了比较高纯度的蛋白。并用SDS-PAGE电泳验证蛋白纯度均很高，只有目的蛋白条带而不存在其他杂蛋白。

分析蛋白相互作用步骤：

1.将FlhDC-His挂在镍（His）柱上。

2.再依次使过量的YdiV蛋白通过柱子,若存在相互作用，那么这些蛋白会依次与FlhDC--His结合挂在His柱子上。

3.用W ASH Buffer洗一遍，洗掉没有结合的蛋白。

4.向柱子中加入PPase(我们设计的载体在His标签前设计了PPase的切点，加入PPase以后蛋白与His标签被切开，蛋白从柱子上脱落)酶切过夜。

5.加入重旋buffer将蛋白洗下来。

6.稀释后，超滤浓缩到2ML（稀释的目的是除盐，而浓缩到2ML才能使用HPLC和分子筛柱进行分析）

7.将2ML蛋白溶液注入到已经平衡好(平衡步骤略)的使用分子筛柱子的HPLC中。

8.蛋白上柱、洗脱。

9.根据出峰位置取样，跑SDS-PAGE凝胶电泳。

2.1 实验结果预测

根据以上实验中HPLC结果和SDS-PAGE凝胶电泳结果就可以分析出这几种蛋白的相互作用情况。

2.1.1 结果一：三种蛋白形成复合物

如果分子筛层析的结果图只有一个峰（如左图），而电泳结果中有三条带（如右图），那么说明这三种蛋白可以结合成稳定的复合物。

图2.1.1

这是因为如果蛋白能够形成复合物，在分子筛层析时就以稳定的物质存在，在洗脱柱子上的蛋白时，用紫外吸收检测就只有一个峰。而取峰所在位置的蛋白溶液，跑SDS-PAGE，因为SDS-PAGE能够将蛋白间的相互作用分开，如果这时有三条带，那么说明分子筛结果中的那个峰就是蛋白复合物YdiV-FlhD-FlhC。

2.1.2 结果二：两种蛋白形成复合物

若分子筛层析结果只有一个峰，而电泳结果有两条带，那么说明只有FlhC

和FlhD能够相互作用。

图2.1.2

这说明在过His柱的时候YdiV就不能与FlhD-FlhC相互作用，在W ASH 的时候就已经被洗下来了，所以虽然分子筛只有一个峰，但是这个峰是FlhD-FlhC 的复合物。YdiV与FlhD-FlhC没有相互作用或者作用很弱。

2.1.3 结果三：没有形成蛋白复合物

若分子筛层析结果只有一个峰，而电泳结果有一条带，那么这条带就只有Rab1，而不存在蛋白之间的相互作用，这可能是由于蛋白异源表达的活性丧失。