心肌细胞培养方法详述
心肌细胞培养
新生大鼠心肌细胞培养技巧原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下：1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长大量观测表明，选择1~3d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1g・L1,我们使用的为0.8gL1.胶原酶最好现用现配.3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意:(1)转速一般控制在60~80rmin1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％上的心肌细胞.7 换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实此外，去血清后可用ITS和0.1gL1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.8抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会 .(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：(1)pH值会在过滤后上升0.1~0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH上升.每次配好的培养液尽量在2wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用.1，取心脏：起初取心脏的听说可以“剪开胸骨，就可以挤出来”但是找不到合适的剪开点。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种重要的研究对象，分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是进行相关研究的基础工作。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养方法。
1. 大鼠心肌细胞的分离方法：a. 准备消化液：将含有0.1%胰酶和0.05%胰蛋白酶的耗氧培养液(如DMEM/F12)预先加热至37℃。
b. 杀死大鼠：快速杀死大鼠，并立即进行心肌细胞的分离。
c. 开胸取心：通过剖开胸腔，将心脏暴露，并迅速取出。
d. 剪开心脏：用剪刀切开心脏的心室部分，将其放入预先加热的消化液中。
e. 贴壁处理：将心室组织液搅拌均匀，并放置在37℃培养箱中酶解。
每隔10分钟，用吸球轻轻吸取上清液，反复操作3-4次。
2. 大鼠心肌细胞的鉴定方法：a. 形态学观察：用显微镜观察分离得到的心肌细胞的形态，心肌细胞呈长条状，具有明显的纵纹和横纹。
b. 钙离子荧光染色：使用荧光染料如Fluo-4 AM来标记细胞内的钙离子，并观察细胞内钙离子的动态变化。
c. 免疫荧光染色：使用心肌细胞特异性标记物如肌球蛋白进行免疫荧光染色，观察标记物的染色情况。
3. 大鼠心肌细胞的培养方法：a. 培养基准备：将DMEM/F12培养液加入10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素溶液和1%胎牛血清补充物。
b. 细胞接种：将分离得到的心肌细胞加入培养基中，浓度为1 * 10^5 cells/ml，并将细胞悬浮液加入培养皿中。
c. 培养条件：将培养皿放入恒温培养箱中，温度设定为37℃，CO2浓度设定为5%。
d. 培养液更换：一般情况下，每2-3天更换一次培养基，同时可添加适量的生长因子和激素。
e. 心肌细胞传代：当心肌细胞达到80-90%的密度时，可以进行细胞传代。
传代方法与培养方法相似，注意细胞的保持适当的密度。
大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是大鼠心肌细胞研究的关键步骤。
通过合适的操作和条件，可以获得纯度较高的心肌细胞，并进行相关研究。
需要注意的是，心肌细胞的分离和培养过程需要在无菌条件下进行，以避免细菌和其他微生物的污染。
心肌细胞或肝细胞原代培养的方法
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大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏组织的重要细胞之一，对于心脏疾病的研究和治疗具有重要意义。
在进行心脏细胞的研究和培养过程中，对大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是非常关键的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一关键技术。
一、大鼠心肌细胞的分离大鼠心肌细胞的分离是进行心肌细胞培养的第一步，其关键在于有效地分离心肌细胞，保证细胞的纯度和活力。
以下是常用的大鼠心肌细胞分离的方法：1. 心脏采集：首先需要从大鼠体内取出心脏组织，最好选择小鼠、大鼠等小型动物，以便于获取足够数量和较为纯净的心肌细胞。
2. 心室组织的分离：将心脏组织置于含有氧气的离心纯化液中，迅速剪下心脏，并去除心包膜、心尖等结缔组织，然后将心室组织切成小段。
3. 细胞的分离和纯化：将切成小段的心室组织放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%重组胰岛素的胰酶溶液中进行消化，去除结缔组织和细胞外基质，然后用离心分离出心肌细胞。
4. 心肌细胞的过筛和纯化：经过离心后，得到的上清液中含有大量的心肌细胞和其他细胞。
通过过筛的方法，可以进一步提取纯净的心肌细胞，并将其进行鉴定和培养。
1. 形态鉴定：观察分离得到的心肌细胞在显微镜下的形态特征，包括细胞形状、大小、结构等。
正常的心肌细胞应该呈长条形、有交叉条纹，并具有丰富的胞浆。
2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术，使用与心肌细胞特异蛋白相关的抗体标记心肌细胞，如肌动蛋白、肌钙蛋白等，观察其在心肌细胞中的表达情况，以确定其纯度和特异性。
3. 功能鉴定：通过检测心肌细胞的功能特性，如心肌收缩力、电生理特性等，来判断心肌细胞的活性和健康程度。
可以通过贴壁法、钙离子荧光示踪等技术手段来进行功能鉴定。
通过以上的鉴定方法，可以全面地评估分离得到的心肌细胞的纯度和活性，为后续的心肌细胞培养和实验奠定基础。
在分离和鉴定得到的心肌细胞可以进行培养，为心脏疾病的研究和治疗提供重要的实验材料。
心肌细胞
心肌细胞培养实验方法[基本原理]心肌细胞培养用机械方法及酶消化法，将心肌细胞分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件下使之生长繁殖，并保留其结果与功能特性。
[设备及试剂]1 仪器设备：超净工作台、二氧化碳培养箱(可用恒温培养箱代替)、离心机、电磁搅拌器、恒温水浴、PH值测定仪、普通及倒置显微镜等,以及一般实验室设备.2 常用试剂有以下几种：培养基：常用Eagle、199、1640、F10、F12、PuckN-16B SM20等。
其中国产的Eagle培养基（MEM)较为常用，根据实验的特殊要求，可选用无糖、缺氧，不同浓度的各种无机离子等特殊培养基。
平衡盐溶液：常用磷酸缓冲盐溶液（P、B、S），无钙镁磷酸缓冲盐溶液（CMF-PBS）及Hank’S液等。
消化液：常用胰蛋白酶（Difco 1:250)，必要时加用胶原酶，弹性蛋白酶等。
抗菌素溶液：取青霉素100万单位，链霉素1g，用双蒸馏水或磷酸缓冲液100ml，配成双抗液备用。
[操作步骤]1 心肌组织的选择：选择乳鼠的心脏。
2 心肌组织块的制备：乳鼠用75％乙醇或1％新洁尔灭消毒皮肤，固定四肢，胸部向上，再用2％碘酊及75％乙醇分别消毒胸腹部皮肤，用虹膜剪剪开胸部皮肤，暴露皮下组织，再用碘酊及乙醇消毒皮下组织，更换剪子及镊子，开胸取心，在盛有磷酸缓冲液或Hanks 液的瓶皿中洗涤后，剪去心房，将心室放入另一平皿中，用吸管吸取磷酸缓冲液反复冲液三次，洗净残留积血。
将一定数量的心室放入三角瓶或离心管的侧壁上，用虹膜剪剪成1mm3碎块，以备消化。
3 心肌细胞悬液的制备：根据实验要求，可选用一次或分次消化法制备细胞悬液。
后者较为常用，在大离心管中放入组织碎块及0.06~0.25% 的胰蛋白酶溶液8~15ml，加入磁棒两根，在磁力搅拌器上，37℃水浴中消化10分钟，自然沉淀，弃去上清，再加入胰蛋白酶液8~15ml，消化10分钟，再用吸管吹打组织块1分钟，自然沉降后，将上清液及沉淀物分别处理。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种可供研究心脏疾病和相关生理学过程的重要模型细胞。
分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞对于心脏病研究具有重要意义。
本文将详细介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定方法以及培养步骤。
1. 动物准备根据实验需要选择2-3个月大的健康雄性大鼠。
提前饲养大鼠，使其适应实验环境，避免压力引起心肌细胞损伤。
实验前一天，禁食12小时但允许饮水。
2. 心肌细胞分离将大鼠按麻醉操作，使用90mg/kg的琥珀胆碱或90mg/kg的乙酯进行麻醉。
确认大鼠麻醉后，通过软组织剪刀取出心脏，将其置于冷却的Buffer A中。
(Buffer A: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES的PBS液)将心脏移至工作台上，用毛刷清洁心脏表面的血液和附着物。
然后将心脏转移至10cm 培养皿内，将血管外壁剪除。
将心房和心尖切掉，将心脏切割成小块，并转移到15 mL离心管中。
加入5 mL Buffer A，并使用移液器缓慢混合。
使用1000 rpm进行梯度离心 (5 min)。
根据实验需要，可以选择制备低密度（20%离心液缓冲液）或高密度（50%离心液缓冲液）梯度离心。
将上清液去除，将沉淀与Buffer A混合。
将混合液过滤，去除残留的大块异物。
可使用0.22 μm的滤膜将上清液过滤。
收集上清液至50 mL离心管中，离心10 min(1000 rpm)。
去除上清液，保留沉淀。
再次挤压沉淀，使其成为小碎片。
将沉淀与37°C的Buffer B液混合。
(Buffer B: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES, 10 mM taurine, 10 mM BDM的PBS液)以500 rpm离心5 min，去掉上清液，保留沉淀。
心肌细胞培养
原代培养的心肌细胞的准备
将出生1-3天的Wistar乳鼠浸泡75%的酒精中消毒，开胸后取心室肌，用Hank's液清洗2次，剪碎，放入10ml离心管中；离心管中装有5倍体积的0.25%胰酶，37℃消化10分钟后，加等体积的DMEM全培养液终止消化，自然沉淀；取出沉淀物，放入另一盛有胰酶的离心管中，重复上述消化过程4次，每次37℃20分钟；收集除第一次以外的上清液，1500 r/min 离心15分钟，弃上清，用含10％胎牛血清及青霉素和链霉素(终浓度均为100U/ml)的高糖DMEM培养液充分而轻柔地吹打成单细胞悬液，经 200目筛网过滤去除未消化组织块。
然后按差速贴壁分离法37℃、5%CO
孵育 1-1.5小时，去除贴壁的非心肌细胞，纯化心肌细胞。
细胞计
2
条件下培养。
于培养后12h即可见部数，相同密度接种于培养瓶中，37℃，5%CO
2
分细胞收缩,24h后换液,此时心肌细胞约90%以上都在收缩, 速率达70/min～120/min。
细胞培养72h后用于实验。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心脏疾病和心肌细胞功能的重要模型细胞。
分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是心血管研究的基础工作之一，本文将介绍关于大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）取得3-5天大的小鼠；（2）取得适合的心肌分离培养试剂盒，如Worthington试剂盒；（3）取得离心机和培养箱等实验设备。
2. 心肌细胞的分离（1）将小鼠处死，取出心脏放置在含有生理盐水的培养皿中；（2）迅速将心脏移至足够的胶原酶/胶原酶B混合液中，加入2-3ml的混合液，用剪刀将心脏切成小块；（3）将含有心肌切块的培养皿放入37度水浴箱中37±1度水浴中消化，酶解30-50min，要不断观察；（4）将消化液收集至15ml离心管内，并逐渐加入适量的生理盐水；（5）将含有细胞的离心管放入离心机，1500rpm离心去沉淀心肌细胞；（6）吸去上清液，加入足够的DMEM/F-12培养基，轻轻振动混匀；二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 细胞形态鉴定（1）将培养皿内心肌细胞移至显微镜下观察细胞形态；（2）通过显微镜观察细胞的形态、大小、颜色等；（3）正常大鼠心肌细胞呈长条形，且贴附于培养皿底部。
2. 免疫荧光染色鉴定（1）将培养皿内的细胞进行PBS溶液洗涤；（2）加入4% paraformaldehyde固定细胞，洗涤；（3）加入常用的抗心肌肌动蛋白抗体，孵育；（4）洗涤后加入FITC标记的二抗或荧光素进行荧光染色；（5）用荧光显微镜观察细胞的荧光情况，确定心肌细胞的特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）将DMEM/F-12培养基加入10%的胎牛血清、1%的青霉素和链霉素，混匀；（2）将培养基过滤灭菌后，置于4度冰箱储存备用。
2. 心肌细胞的培养（1）将心肌细胞悬液加入到预先涂覆明胶的培养皿中；（2）将培养皿放入CO2培养箱中37度培养，第二天更换新的培养基；（3）每2-3天更换一次培养基，直至细胞形成充分的单层。
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。
2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。
3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。
4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。
5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。
封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。
第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。
之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。
放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。
这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。
（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。
5只鼠铺一个培养瓶。
4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。
心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。
注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏肌肉的主要细胞类型，具有重要的生理功能。
研究大鼠心肌细胞具有重要的意义，可以探究心血管疾病的发生和发展机制，以及开发相关的药物治疗。
大鼠心肌细胞的分离可通过以下步骤进行：1. 预处理：取出大鼠心脏，迅速放置在冷却的维生素-free Hanks盐溶液中。
然后，用冷却过的Hanks盐溶液洗涤心脏，去除血液和杂质。
2. 细胞分离酶处理：将心脏切成小块，并放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%胆汁酸的预温化酶解缓冲液中。
在37℃的恒温摇床上进行酶解处理。
3. 细胞分离：酶解后的心脏组织经过轻微的摇晃，并用玻璃棒将组织块轻轻破碎。
将破碎的组织悬浮液通过细胞筛过滤器，并用高离心力离心收集上清液。
4. 细胞沉降：将上清液经过离心，去除上清液，留下细胞沉淀。
再次加入含有0.1%胰蛋白酶的预温化酶解缓冲液，并摇动细胞沉淀，使细胞悬浮。
5. 细胞富集：采用密度梯度离心法，将细胞悬液慢慢加入含有离心液的离心管中进行离心。
心肌细胞将沉积在密度梯度的底部。
6. 细胞培养：将心肌细胞的上清液去除，留下沉积的心肌细胞，加入预先准备好的心肌培养基中。
将细胞培养于37℃恒温孵化箱中，并提供适当的营养物质。
1. 形态学鉴定：使用显微镜观察细胞的形态结构。
正常的心肌细胞呈长条状，具有交叉纹理的横纹。
如果细胞形态发生变化，如变形、伸长或成球状，则可能表示细胞出现异常。
2. 免疫细胞化学鉴定：使用免疫荧光染色或免疫组化染色的方法，检测心肌细胞特异性标记物，如肌球蛋白（myosin）等。
正常的心肌细胞应表达这些标记物。
3. 功能鉴定：利用心肌细胞的特殊功能特点，如收缩、钙离子跨膜转运等，进行鉴定。
可通过记录细胞的膜电位变化、细胞的跳动频率等指标来评估细胞功能。
心肌细胞的培养需要特别注意以下事项：1. 培养基的选择：根据不同研究需求选择适当的培养基，如DMEM、Dulbecco改良的培养基等。
培养基应添加适量的血清、营养物质和生长因子，以提供细胞所需的营养和生长环境。
原代心肌细胞培养
原代心肌细胞培养
取Wistar乳鼠，经酒精对体表消毒后在超净台中开胸取心脏。将心脏剪成直径0.5 mm左右大小均一的小块，并去除心脏中残余的血及主动脉。将组织块移入离心管中，在37℃水浴条件下于胰蛋白酶溶液中消化（2-3）min，将浑浊的消化液置于DMEM培养基中终止消化。重复加入胰蛋白酶溶液直至组织块消失。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是心脏组织中最主要的细胞类型，其具有重要的研究价值和应用前景。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和技巧，以供需要的研究者参考。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 质子化心肌细胞将雄性大鼠（体重200-250g）置于无菌条件下，去毛、消毒，然后迅速取出心脏，置于含有生理盐水的培养皿中。
使用显微镊子和显微刀将心脏分割成小块，使得心肌组织充分暴露。
将小块心肌组织转移至含有0.05%的胰酶和0.1%的胰蛋白酶的新鲜培养液中，温育30分钟至1小时。
温育完成后，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基冲洗心肌组织，过滤去除残留的纤维和细胞碎片。
对心肌组织进行胶原酶-胰蛋白酶消化，离心沉淀后获取心肌细胞。
2. 分离和纯化获得的心肌细胞需要经过一定的分离和纯化步骤，以消除其他非心肌细胞的干扰。
常用的分离方法包括稳定梯度离心法、摇床培养法和免疫分选法。
通过适当的分离方法，可以获得较为纯净的大鼠心肌细胞用于后续研究。
1. 形态学鉴定通过显微镜观察大鼠心肌细胞的形态结构，包括细胞形状、大小、核与细胞浆的比例等，进行初步的鉴定。
正常的心肌细胞呈长条状，具有跨膜结构，胞质内含有丰富的线粒体和肌纤维等特征。
2. 免疫细胞化学鉴定通过特异性抗体对心肌细胞进行染色和标记，观察其对特定标记蛋白的表达情况。
常用的标记蛋白包括肌动蛋白、肌球蛋白、心肌肌球蛋白等。
通过免疫细胞化学鉴定，可以明确心肌细胞的特异性。
1. 培养基的选择大鼠心肌细胞的培养通常选用DMEM（Dulbecco's modified eagle's medium）培养基，添加10%的胎牛血清和适量的抗生素。
培养基的pH值应调整在7.2-7.4之间，以及含有必要的营养物质和生长因子。
2. 细胞密度和培养条件将鉴定过的心肌细胞悬浮于培养基中，调整成合适的细胞密度后，接种于预先涂覆明胶质或明胶胱聚糖混合物的培养皿中。
009_心肌细胞培养方法详述
心肌细胞培养方法详述试剂配制1、D-Hanks溶液（pH 7.4）：NaCl 8.00gKCl 0.4 gNa 2HPO4•12H2O 0.134gKH2PO4 0.06 gNaHCO3 0.35 gGlucose 2.0g酚红0.02g定容1L，过滤灭菌，4度保存。
2、胰酶消化液（0.07％，700ug/ml）胰酶0.07gD-Hanks溶液100ml注意调节pH到8.0。
配制的时候先溶解，然后放在4度过夜，过滤除菌。
-20度保存。
3、胶原酶消化液（1％）胶原酶 0.1gDMEM/F12 10ml调节pH值到7.5左右。
过滤除菌。
-20度保存。
4、10% DMEM/F12完全培养基 10％FBS，DMEM/F12，加入双抗。
使用前注意补加谷氨酰铵。
5、用于中和的培养基(10％)：180ml DMEM/F1220ml 国产血清使用前加入双抗和谷氨酰铵。
6、BrdU：5-bromo-2’-deoxyurine；Sigma Cat.No. B5002-100mg -20℃保存；分子量307.10。
BrdU存储液（10mM，100*）：称取BrdU 30.7 mg充分溶解于10m1 DMEM中，浓度即为10mM, 无菌条件下以0.22um孔径的滤膜过滤除菌并分装，-20℃保存。
临用前取10mM BrdU贮液按1: 100加入DMEM培养液中，使BrdU终浓度为0.1mM。
8、Laminin（1MG/ML）sigma lot:L2020：分装每100ul，-80保存。
使用前用PBS稀释100倍，4℃保存。
实验动物准备出生1--3天的小鼠乳鼠，购自北京维通利华公司，一般一次做10只左右的小鼠。
试验前准备：1、高压灭菌解剖器械、弯头吸管、一个烧杯、一个试剂瓶、2个培养皿等，并准备足够的50ml离心管和15ml离心管。
2、D-Hanks平衡液、DMEM/F12、溶解国产胎牛血清及进口血清（在使用前拿出）。
3、0.07％胰酶、0.1％胶原酶。
心肌细胞培养方法详述
心肌细胞培养方法详述配液：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。
取鼠：鼠盆用棉铺好，取鼠。
准备：事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。
其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。
新洁尔灭（0.1％）泡纱布（用10ml5％的新洁尔灭加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液）。
用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
物品：白大衣、饭盒小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]250ml烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸] [一个装0.1％新洁尔灭150ml左右，消毒小鼠]500ml烧杯1个，用作废液缸。
50ml烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）三角烧杯（50ml）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）离心管及帽（12-14个），两个试管吸管（5~8个）大镊子（两把，持物，例夹棉球等）台面：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个250ml烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）1个500ml烧瓶（废液缸）、温度计、PH试纸（事先调PH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml 2个（双抗液）20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml 以上物品均用紫外线照30分钟。
另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机+一把小锁、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。
乳鼠心肌细胞培养
大鼠心肌细胞培养一、乳鼠原代心肌细胞培养（一）、试液配制1．DMEM培养液：配制方法同前。
按每90ml 培养液加入10ml 胎牛血清即为10%DMEM 培养液。
2．0.1%胰酶：移取0.5g 胰酶，加入５00ml 生理盐水，充分溶解后，调pH至７.2~7.4,过滤除菌后，分装冻存于-２０℃。
3．１0mmol/L 5-溴脱氧尿苷：（二）、操作步骤１．取１天龄的新生乳鼠，断头处死，固定于泡沫板上；２．应用碘酊及７０％酒精常规消毒；３．从左侧肋下缘剪开胸腔，用镊子取出心脏，置入含无血清DMEM培养液的平皿中；４．全部心脏取出后，剪去心房及周围血管组织，移入一干平皿中；５．剪碎，用无血清培养液洗１～２遍后，转移入５０ml 离心管中；６．按３０～５０个心脏加１０～1５ml胰酶液，于３２～３５℃，不停搅动１５０～２００rpm,消化１５～２０min;７．让组织块自然沉淀，上清移入另一离心管中，立即加入等量含１０％血清的培养液以终止胰酶的作用。
最初２～３次消化液因含较多的细胞碎片及红细胞，可弃去。
８．组织块可反复加入胰酶消化５～８次，所得细胞悬液在１０００rpm离心５min , 弃去上清，沉淀用少量培养液重悬；９．细胞计数后，将细胞稀释成１×106cells/ml的浓度，转移入培养瓶中，３０cm2的培养瓶加入５ml ，轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分布；10.37℃95%空气－５％CO2条件下培养１h，然后轻轻摇动，将未贴壁的细胞转移到新的培养瓶中继续培养；11.２4h后更换含０.1mmol５－溴脱氧尿苷的培养液，以后每２天更换一次培养液。
心肌细胞全部汇合，自主搏动良好即可用于实验。
（三）、注意事项１．心脏是由多种细胞群组成的，心肌细胞约占５０％。
决定心肌细胞培养成败的关键是：１）不能污染，在整个操作过程中都要注意无菌操作，所用器皿都要严格消毒，所用试液都要预先检验无菌后方可使用。
２）尽量减少非心肌细胞的存在。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是心脏组织的主要细胞类型，对于研究心脏生理和病理具有重要意义。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养。
1.1 心肌细胞分离缓冲液的制备材料：胰酶（Sigma）胆汁酸（Sigma）肝素（Sigma）Krebs氏缓冲液（pH 7.4）制备：将1g胰酶、0.5g胆汁酸和10mg肝素混合后加入50ml Krebs氏缓冲液中，搅拌均匀，过滤，滤液称为酶液。
材料：大鼠心脏酶液Krebs氏缓冲液10% FBS器材：离心机冷藏离心管15ml离心管显微镜步骤：1）将新鲜大鼠心脏取出，迅速放入Krebs氏缓冲液中洗涤，去除残留的血液。
2）用冷Krebs氏缓冲液冲洗心脏3次，每次放入小的离心管中。
3）将心脏移入含有酶液的小离心管中，密封，放在离心机上，以适当的速度进行离心，细胞可保持在液体表面，离心时间约15分钟。
4）取出细胞上清，加入等体积的10% FBS，反复吹打分散心肌细胞。
5）收集细胞悬液，显微镜下观察细胞形态，统计细胞形态和数量。
6）以1×105个细胞/ml的浓度培养心肌细胞。
2. 心肌细胞的鉴定材料：FITC-α-肌球蛋白抗体Dil-α-肌球蛋白抗体显微镜步骤：1）将心肌细胞培养在玻片上，用50%乙醇固定，洗涤3次。
2）将细胞孔洞用Dil-α-肌球蛋白抗体标记，加入1/1000浓度的FITC-α-肌球蛋白抗体，封片，显微镜下观察合适的细胞，记录下为肌细胞转化的细胞数量，计算纯度。
材料：DMEM/F12培养基（Hyclone）10% FBS（Gibco）5% CO2孵育箱步骤：1）将心肌细胞密度调节至1×105个细胞/ml，加入10% FBS的DMEM/F12培养基，离心5分钟，移除上清液，加入完整培养基缓慢培养。
2）培养中周期观察心肌细胞的形态和数量，添加必要的药物，并及时更新培养基。
3）心肌细胞培养时间一般在3-5天，在适当的阶段进行下一步实验。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是心脏的主要细胞类型，负责心脏机械和电生理活动，对心脏健康具有重要的影响。
因此，研究心肌细胞具有重要的应用价值。
在本文中，将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养技术。
1.1 心肌细胞的分离将大鼠心脏取出，用注射器将缓冲液（如PBS）注入主动脉，以清洗心脏内部的血液。
随后，将心脏移至一盛装有酶消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，肌肉组织被消化成单个细胞。
消化时间一般为20-30分钟，消化程度可以调整。
之后用培养液（如DMEM/F12）中和胰蛋白酶的酶消化液，使消化过程终止。
细胞分离后可以使用显微镜进行观察，同时也可以通过显微镜观察细胞形态来判断分离效果。
大鼠心肌细胞通常采用肌钙蛋白T的免疫荧光染色进行鉴定。
此外还可以使用心肌特异性的基因表达来鉴定心肌细胞。
通过PCR扩增，可以检测到只存在于心肌细胞中的基因，如心肌肌钙蛋白T和肌红蛋白等。
在培养前，需要先将心肌细胞分离、鉴定和计数。
以下是大鼠心肌细胞的培养方法：2.1 培养基适用于大鼠心肌细胞的培养基包括：DMEM/F12、M199、MEM、RPMI 1640等培养基，其中DMEM/F12和M199为常用培养基。
大鼠心肌细胞通常以静态培养为主，营养液一般为12%胎牛血清、5%马血清混合的DMEM/F12培养基。
细胞应在涂有胶原质的培养皿中培养。
培养室温度为37℃，5% CO₂的有利条件下培养。
此外，需要注意的是，心肌细胞对缺氧和低氧非常敏感，因此在培养过程中应始终维持培养皿内的氧气浓度。
通常情况下，大鼠心肌细胞的培养状态可以分为初代培养和传代培养。
初代培养的心肌细胞生长很快，但失去了心肌特异性表达，而传代培养中将保留心肌特异性的表达。
在传代培养时，需要定期检测细胞数量，并在细胞繁殖至80-90%时进行传代。
此外，传代时应注意保持培养基的组成和浓度的稳定，避免对细胞造成损伤。
总之，大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养对于心血管疾病研究具有非常重要的意义。
原代心肌细胞培养
1 材料1.1动物出生后1-4 天SD 乳鼠15 只。
1.2 试剂低糖DMEM、胰酶(含EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。
0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精。
培养液：培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。
1.3 手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。
2 方法2.1 将胰酶用D-Hank's 液配成0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。
2.2 解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。
然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's 液中。
重复以上过程。
取材完毕后，撤掉取材的手术器械。
注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。
2.3 用第二套手术器械进行下列操作。
用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。
原代心肌细胞培养方法探讨[1] 3
![原代心肌细胞培养方法探讨[1] 3](https://img.taocdn.com/s3/m/cf240a10b7360b4c2e3f64e4.png)
心肌细胞的分离及培养器械：饭盒、烧杯、弯头解剖剪（2）、小镊子（2）、平皿（4）、毛玻片、滤网、离心管（15ml）、移液管、培养瓶、废液缸、PE手套、橡胶手套、冰盒溶液：PBS、DMEM（含血清）、DMEM（free）、胰酶动物：小鼠准备：用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束，提前半小时将培养液、胰酶37℃温浴。
培养过程：1、两个圆皿中加入5ml的PBS培养液，将小鼠浸入70％酒精<5min，用小剪子及小镊子开胸取心。
2、取出的心放在一个装有PBS的平皿中，剔除心脏周边的血凝及纤维组织。
3、PBS再冲洗后，转移至另一个预先装好5ml胰酶的平皿中，用剪子将平皿中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入15ml离心管中，加入3-5ml胰酶冲洗平皿转移到离心管中。
4、放入水浴锅中，温和摇动，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血红细胞、细胞碎屑和死细胞。
5、再将8-10ml胰酶加入盛有组织的离心管，吸管轻轻吹打1min，消化10min，小心转移上清+2ml DMEM至另一离心管中，细胞悬液离心，1000转×10min，弃上清，加培养基为管1。
6、重复第5步，3-8次，直至至组织块消化为止。
7、将多次细胞悬液经100目滤网过滤，混合。
8、加入1ml DMEM重悬，显微镜下观察并计数。
9、培养1-1.5小时，收集培养液中的非贴壁细胞，小心不要晃动。
10、显微镜观察并计数，细胞密度调至5×105-6×105细胞/ml。
11、4-6小时后，用培养基轻轻冲洗2次，加入培养基继续孵育过夜。
或从第5步起，加胰酶10-15ml，30min 37℃水浴，每5min用吸管吹打5ml完全培养基终止。
原代心肌细胞培养方法探讨1邵伟（山东省千佛山医院山东济南250014）周苏宁邵建华（山东大学医学院山东省立医院山东济南250021）摘要探讨培养Wister新生大鼠心肌细胞的可靠方法。
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心肌细胞培养方法详述配液：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。
取鼠：鼠盆用棉铺好，取鼠。
准备：事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。
其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。
新洁尔灭（0.1％）泡纱布（用10ml5％的新洁尔灭加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液）。
用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
物品：白大衣、饭盒小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]250ml烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸] [一个装0.1％新洁尔灭150ml左右，消毒小鼠]500ml烧杯1个，用作废液缸。
50ml烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）三角烧杯（50ml）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）离心管及帽（12-14个），两个试管吸管（5~8个）大镊子（两把，持物，例夹棉球等）台面：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个250ml烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）1个500ml烧瓶（废液缸）、温度计、PH试纸（事先调PH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml 2个（双抗液）20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml 以上物品均用紫外线照30分钟。
另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机+一把小锁、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。
事先把显微镜、离心机、磁力搅拌器电源插好。
检查酒精灯是否有酒精，碘酒和酒精棉球是否够用。
先把物品递入，后穿大衣、帽子和口罩。
然后把酒精灯打开，把瓶皿摆好，再用一个瓶皿装酒精棉球。
培养过程：1. 把两个5ml注射器分别插入DMEM和胰酶中，分别向两个圆皿中加入5ml的DMEM培养液。
用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后2~3天的SD大鼠，放入0.1％新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用针头把鼠固定（位置摆正），用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘，取一把小剪子及小镊子开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，后换另一把小剪子和镊子在剑突处正中线稍偏左开胸取心。
2. 取出的心放在刚才准备的一个装有DMEM的圆皿中再取下一只。
重复以上过程。
（鼠全部杀死后，把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿出台面。
消毒、清洁，铺纱布、换手套。
3．用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好DMEM的圆皿中。
抽取5ml的胰酶，然后将其中少许放入50ml的小烧杯中，大部分倒入三角烧瓶中。
用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入三角烧瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰酶刷净烧杯。
4．把温度计和三角烧杯放入250ml烧瓶中，（事先调好水量，多会没过三角烧杯，少温度会不均匀）。
打开磁力搅拌器电源，调温度（使-缓慢加到34~35℃）和转速（转速不可过快，否则会打碎细胞，基本上标志为平行）。
一定要注意监控。
5．温度达到34℃时开始计时，第一次为10分钟，以后可为8分钟，事情况而定。
在此期间，在试管架上摆上5、6个离心管，标上1、1，2、2。
其中在1号两管事先加入DMEM液各2毫升6．10分钟后，把三角烧瓶取下，磁力搅拌器关上，用一个吸管轻轻吹打（使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来），这个吸管（1）用后固定放在一个离心管中，以后每次消化后取下都用其吹打几下，第一次上清弃去，然后向两个1号管分别倒入2ml上清（尽量不要把组织倒出，也不要剩液太多，以免消化下的细胞重复消化造成损伤），用另一个吸管（2）混匀配平两个管（即两个管水平高度相同），轻轻吹打，以免损坏细胞。
7．接着把这两个离心管放入离心机中，调10分钟，800或1000转，垫小锁，打开关。
8．同时向三角烧瓶中加入5ml胰酶，继续消化8分钟，注意控制温度。
此时向两个2号管中分别加入2mlDMEM液。
9．取下三角烧瓶，仍用1号吸管吹打，后静置片刻向两个2号管分别倒入2毫升的上清，取出两个离心后的1号管，把上清液沿细胞贴壁一方慢慢倒掉，后向其中一管加入4ml的DMEM液，用2号吸管取少量液体加入另一个离心管中，把管底的沉淀细胞洗下来，把液体全部移入其中一管，三个管（1个1号管，两个2号管）配平，放入离心管中，离心十分钟。
同时仍加5ml的胰酶，放入三角烧瓶中，继续消化（注意控制温度，达34℃时计时）。
10．消化到4次左右，吹打均匀后，吸一滴滴在载玻片上，拿到镜下观察消化情况，决定消化次数。
11．离心2次的吸管，放在试管架上，待离心过程全部完事后，把各管上清液倒掉，在各管加上3ml（不用精确，大致这样）DMEM液，记住共加入多少DMEM液的量，换吸管（3号）把各管底细胞块吸下吹打均匀后，移入50ml烧杯中，然后用注射器抽取余量的DMEM加入烧杯中，加入小牛血清及抗生素，换吸管（4号）吹打均匀。
12．取出24孔培养板，一个人吹打，另一个人用加样器加药。
封盖时过火，盖上盖，放在CO2孵箱。
24小时后观察是否贴壁。
（24孔板，每孔最多加2ml，一般加液时每孔加1~1.5ml）配药：天平、量筒、烧杯、玻璃棒、二蒸水、硫酸纸。
NE：加样器1000μL 大头一个或1ml注射器一个，50μL小头一个。
量筒100ml，烧杯100毫升。
配法：抽取0.85mlNE液，放入烧杯，再加二蒸水99.15ml补足至100ml，备用。
在工作台内，用针头滤器滤过（仪器：针头滤器及膜，先试膜，再高压消毒，注意压力），在一个新的100ml烧杯内。
取4个50ml的烧杯，分别标号1、2、3、4。
然后用加样器（100μL）分别取0.1mlNE放入3、4杯内。
小牛血清：先配初液，即0.4ml/10ml（用低糖DMEM配，0.4ml牛血清需500μL加样器一个）。
配成后即为4％的浓度。
分别取0.1ml放入1、2、3、4号的50ml的烧杯内。
抗生素：分别取0.1ml放入1、2、3、4号的50ml的烧杯内。
分别向1、2、3、4号的50ml的烧杯内加入DMEM。
各为9.7ml、9.7ml、9.6ml、9.6ml。
用4个吸管吹打均匀，然后用加样器每组加1.0ml。
另一人用吸管吸出培养液。
每组换一个大头。
吡格列酮：取吡格列酮0.2克，溶于2ml甲醇中，针头滤器滤过用，二蒸水稀释至5ml，分别取0.2ml加入50ml烧杯内。
最后，在各个烧杯内配至10ml水平。
500μL加样器一个）。
配成后即为4％的浓度。
分别取0.1ml放入1、2、3、4、5、6、7、8号的50ml的烧杯内。
抗生素：取初液1ml，分别取0.1ml放入1、2、3、4、5、6、7、8号的50ml的烧杯内。
NE：用加样器（100μL）分别取0.1mlNE放入3、4、7、8杯内。
吡格列酮：取吡格列酮0.2克，溶于2ml甲醇中，针头滤器滤过用，二蒸水稀释至5ml，分别取0.2ml加入5、6、7、8烧杯内。
1、3、5、7号低糖，2、4、6、8号高糖。
H9C2心肌细胞系的特性首先，它肯定不同于原代细胞系的，最大的区别，原代的心肌细胞基本不能分裂，而H9C2可以分裂，最大的区别了吧！原代心肌细胞会跳动，你的H9C2不会吧。
虽然都是梭形的，但是H9C2来源于胚胎期心脏，而心肌细胞一般用新生大鼠分离获得。
H9C2与原代心肌细胞有那么大区别，当然不能替代它，所以在研究方向上，你要根据自己的实验需求选择自己合适的细胞，一般来讲呢，如果你研究与心脏相关的信号通路，我建议你还是选用细胞系，因为它可以分裂，获得细胞容易，而且，因为H9C2展现一些成肌细胞特性，所以一般文章都说H9C2做实验最后说什么什么模拟心肌细胞，他只敢说模拟却不敢说那就是原代心肌细胞，呵呵，这个时候原代心肌细胞的有点就体现出来了，虽然每次要残忍的杀害10只鼠崽才获得4大盘，但是人家是会跳动的，是真正的心肌细胞，所以更接近在体，更能说明问题，如果你的实验要涉及到在体实验，比如说心脏回植，最好用原代心肌细胞！H9C2细胞系，好像是从美国ATCC细胞库中能查到的一种心肌细胞的细胞系，尽管购买比较贵（大概5000元人民币左右，当然国内要便宜一些），但由于已经是细胞系，具有永生化的特点，所以比原代细胞好养，也方便、实验稳定、不同批次实验间的差异较小。
但其培养基条件不同于普通的DMEM(具体去查ATCC)。
上述三种类型的细胞应该是最好的、能较为真实反应心肌功能的细胞系。
其他尚有一些心肌细胞的替代细胞系，这些都是骨骼肌来源，如常用的是C2C12肌原细胞系，但与心肌细胞相比，更好养，但特性相差较远，从严格意义上讲并不能代替心肌细胞。
Comments: H9c2(2-1) is a subclone of the original clonal cell line derived from embryonic BD1X rat heart tissue by B. Kimes and B. Brandt and exhibits many of the properties of skeletal muscle. Myoblastic cells in this line will fuse to form multinucleated myotubes and respond to acetylcholine stimulation.Fusion occurs faster if the serum concentration in the medium is reduced to one percent.Propagation: ATCC complete growth medium: Dulbecco's modified Eagle's medium with 4 mM L-glutamine adjusted to contain 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose, 90%; fetal bovine serum, 10% Temperature: 37.0CAtmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5%Subculturing: Protocol: The myoblastic population will become depleted rapidly if the cultures are allowed to become confluent.To prevent loss of myoblastic cells, cultures should be subcultured before they become confluent, and the line should be recloned periodically with selection for myoblastic cells.Remove and discard culture medium.Briefly rinse the cell layer with 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA solution to remove all traces of serum which contains trypsininhibitor.Add 2.0 to 3.0 ml of Trypsin-EDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope until cell layer is dispersed (usually within 5 to 15 minutes).Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to facilitate dispersal.Add 6.0 to 8.0 ml of complete growth medium and aspirate cells by gently pipetting.Add appropriate aliquots of the cell suspension to new culture vessels.Incubate cultures at 37°C.Subcultivation ratio: A subcultivation ratio of 1:2 to 1:4 is recommendedMedium renewal: Every 2 to 3 daysPreservation: Freeze medium: Complete growth medium supplemented with 5% (v/v) DMSOStorage temperature: liquid nitrogen vapor phaseRelated Products: Recommended medium (without the additional supplements or serum described under ATCC Medium): ATCC 30-2002 recommended serum: ATCC 30-2020References: 1062: Kimes BW , Brandt BL . Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Exp. Cell Res. 98: 367-381, 1976. PubMed: 94330232970: Levy AP , et al. Post-transcriptional regulation of vascular endothelial growth factor by hypoxia. J. Biol. Chem. 271: 2746-2753, 1996. PubMed: 8576250还有一种是HL-1心肌细胞系，不常用。