血虚动物造模方法及四物汤的补血作用研究

血虚动物造模方法及四物汤的补血作用研究

胡怡芳

[摘要]：对近二十年来的血虚动物模型制作方法进行概述，主要集中在60Coγ射线造模法，化学药物造模，放血法，免疫介导法及复合造模法，各种方法均有优缺点，很难找出一种最有效的方法，只能根据研究的需要选择最合适的方法，应不断改进和研究，以找到最接近临床的造模方法。四物汤是临床最常用的补血方，具补血调血功能，近年来，国内外很多学者应用现代科学方法对去进行了多方面的研究。

[关键词]：血虚证，造模法，动物模型，四物汤

[引言]：随着科学技术的日益发展，实验动物学已经成为现代科学的重要组成部分，每一项重大科研成果的取得都与实验动物的应用密不可分。同时中医药的研究也在不断发展，用现代科学方法研究中医基础理论的方法越来越受到重视，除了从临床对人体的直接研究，实验动物的应用也越来越广泛，中医证候模型建立的研究也越来越趋于成熟，现就中医血虚动物造模方法及四物汤的补血效果概述如下：

[正文]：

一.血虚动物造模方法：

1．60Coγ射线造模法通过60Coγ射线照射动物全身，使动物造血干细胞减少，白细胞数量下降和骨髓损伤。多选用C57BL/6J和昆明种小鼠，多为雌性，体重多在18~22g，多为全身一次性照射，距离为4m，剂量为3.5Gy，剂量率在1.27~1.701之间，时间160s左右。[1-5] 刘永学等[6]对经不同剂量（2.5、5.5、7.5Gy）γ射线照射后，小鼠出现不同程度的血虚症作了研究，照后各剂量组小鼠的骨髓和脾脏细胞均出现了典型的凋亡变化，细胞凋亡越明显，小鼠血虚症越严重，但造血细胞凋亡出现的时间与血虚症的程度无关，无论照射剂量大小，调亡都发生在血虚症出现的早期。

2.化学药物造模

2．1乙酰苯肼（APH）：APH为强氧化剂，较专一的对红血球有缓慢的进行性氧化损伤作用，尤其是干扰了红血球内的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，促进血红蛋白变形而形成海氏小体，使红血球易于崩解，最终造成机体的溶血性贫血。红血球数明显减少，血红蛋白，血容量低下。[7]具体有以下几种不同给药方式:

①雄性Wistar大鼠,200±50g首先皮下以1 %APH·NS 注射液,剂量为10ml/kg,接受2次,依次注射期间隔2d ,以后降低浓度与剂量,以0.5 %APH·NS 液,剂量为5ml/kg 体重注射,6 次为1个周期,周期递增1ml/kg[8]

②雌性Wistar大鼠，320±20g，于第1，3，5，7，9d皮下注射2%APH·NS,剂量分别为100、50、50、30、30ml/kg.[9]

③昆明种小白鼠，22±3g，皮下注射2% 乙酰苯肼0.3ml,隔三天再注射一次。[10]

④成年SD大鼠，180~250g，于试验第1、4、7天皮下注射2%APH生理盐水溶液，首次剂量为20毫克/100克体重，后两次的注射剂量减半。[11，12]

2．2环磷酰胺（CTX）:CTX是细胞毒制剂,其作用机制是抑制骨髓功能,使造血细胞生成减少。

①昆明种，BALB／c小鼠,雌性,给药后按200mg／kg腹腔注射环磷酰胺[13 14 17]

②C57BL/ 6J小鼠, 20±2g，给药第四天250mg/kg一次腹腔注射CTX造模[15]

③小鼠灌胃给药后第三天，六天各后肢皮下注射环磷酰胺1次，每只每次1mg[16]

④20±2g小鼠以环磷酰胺100 mg/ kg/ d 腹腔注射,连续2d[18]

此种造模方法简单易行,用量及时间可灵活掌握。但其对红细胞作用不如对白细胞明显,且持续时间较短,如果受试药物显效较慢,模型动物血象即自然恢复,甚至出现反跳现象.

2.3环磷酰胺合并乙酰苯肼

①小鼠分别于给药的第2日、第4日皮下注射乙酰苯肼20mg／kg、40mg/kg，从第4日起每鼠腹腔注射环磷酰胺40mg／kg，连续4d.[19]

②小鼠第1天皮下乙酰苯肼40mg/kg,第4天减为20mg/kg, 同时腹腔注射环磷酰胺

40mg/kg, 随后连续3d仅皮下注射环磷酰胺40mg/kg,共14天。[20]

外周血象观察显示小鼠红细胞、白细胞、网织红细胞、血红蛋白、红细胞压积，血小板数目均有不同程度的下降。

3．失血法

①常规：小鼠，体重20±2g，多采取断尾取血，剪去尾端0.3cm，取血0.5ml[21 22 23]

也可采用眼眶静脉取血0.5ml[21 27 28 29]

大鼠，体重230±20g,眼眶放血3ml,每天放血1次，连续放血3天。[21]

兔,耳中央动脉、静脉及耳缘静脉抽血，间日一次，共计7次，每次放血量为全血容量之10%。自造模之日起,家兔改为半量喂养。[24]

股动脉放血，放血量为体重的3%，一天一次放1.5%，总放血量占兔自身总血量的50%左右[30]

制成的血虚证家兔外观体征:精神萎靡、倦卧少动、毛枯蓬松、拱背消瘦、唇色淡白、睑结膜苍白、食欲下降、体重减轻、外周血红细胞计数及血红蛋白含量显著降低、超氧化物歧化酶活性显著降低、过氧化脂质含量显著增加、红细胞变形性显著降低。

②复合放血法：梁毅等[25]采用慢性放血配合饥饿、疲劳法,制作出复合血虚证小鼠模型

具体方法:a.放血:由眼眶后静脉丛放血6～8滴(约0.15ml);隔日一次。

b.控制饮食:自造模之日起改变其正常饮食量,控制在每日50g/kg体重,自由饮水。

c.劳倦:实验组小鼠每天在温水池中强迫游泳2次,每次时间不定,以将下沉于水为限,持续15天。

一般在造模第15天起显现血虚证症状体征:精神萎靡、毛色枯黄蓬松、眼唇鼻苍白无华、鼠尾色淡且血管难以辨认、体重明显减轻等。血液细胞学检测主要表现为红细胞计数明显下降,白细胞、血小板则无明显改变;胸腺指数下降,骨髓有核细胞计数显著增多。

4．免疫介导法

其机制在于Balb/c小鼠经亚致死量照射后,机体的免疫功能严重受损,再输入同基因H-2,但Mhs抗原不同的DBA/2小鼠的胸腺和淋巴结混合细胞,这些免疫活性细胞在宿主体内生存,使宿主出现造血抑制细胞和血浆CF-GM抑制活性,从而导致造血干细胞数量明显减少并出现缺陷,使自身复制的速率低于分化率,最终引起全血细胞减少[26]。

梁毅等[25]取DBA/2小鼠,断颈处死,95%乙醇浸泡消毒后,无菌条件下取出胸腺及颈、腋下、腹股沟淋巴结,加RPMI1640培养液,除去表面血污及黏附的结缔组织后,制成单细胞悬液,细胞计数,调节细胞浓度为1×106/ml ,其胸腺细胞与淋巴结细胞比为1∶2,并鉴定细胞活性应在95%以上。Balb/c小鼠经X射线6.0Gy/3min亚致死剂量照射后1～4h内,立即经尾静脉输入上述细胞悬液,每只0.2ml。

5．复合造模法

①乙酰苯肼+60Co：于第4天用60Co照射(4.0GY),第7天及第10天分别给APH(0.1mg/kg)[31]

②环磷酰胺+乙酰苯肼+60Co造模：第1天给予APH 80 mg／kg，皮下注射，第2天给予2cGy 剂量的60Co—γ射线照射处理，照射后第3天CTX50 mg／kg-次性腹腔注射[32]。

③放血+环磷酰胺：使用wistar大鼠,分别于实验第1，3，5，7，9天，每鼠尾部放血1ml/180g，于第2天腹腔注射环磷酰胺生理盐水溶液40mg/kg，于第4,6,8,10,12天腹腔注射环磷酰胺

20mg/kg，造气血双虚模型。[33]

二.四物汤的补血作用：

1. 60Coγ射线造模法

马增春等[2]对60Co射线全身照射小鼠造成血虚证的模型通过二向电泳、图象分析、质谱鉴定等蛋白质组学技术，测定四物汤对血虚证小鼠血清中有影响的蛋白。结果发现四物汤可使血虚证小鼠血清中12个下调和4个上调的蛋白质有所恢复，进一步质谱鉴定其中4个蛋白质可能是DNA依赖蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase catalytic sub—unit，P97313)，肌细胞增强蛋白(dystrophin，Pl1531)，马达蛋白(KIF13A，Q9EQW7)，肌动蛋白结合蛋白(dys—tonin，QgQx2o)。它们的功能是参与DNA双链损伤的修复，与AP-1结合将6一磷酸甘露糖受体从高尔基体转运到胞浆膜上，将细胞骨架铆定在胞浆膜上等。从而得出结论：四物汤可能通过对血虚证小鼠血清中蛋白的影响而促进骨髓造血、减轻辐射引起的损伤。