液质联用

Full-Scan Mass Spectrometry
Scanning Pass All Pass All

Advantage Provides MW Information

Disadvantage

Low duty cycle
Full-Scan MS of Buspirone
100
(M+H)+
ESI离子源质谱图
090905-taoyang-3 #39 RT: 0.55 AV: 1 T: + c Q1MS [ 400.00-1500.00] 605.08 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 400 503.10 500 600 563.19 621.07 662.26 663.26 767.28 700 800 855.00 896.70 966.00 1000 1081.65 1100 1187.72 1200 1326.69 1300 583.09 606.08 NL: 1.44E7

ESI离子源的检测条件
ESI一般用于极性物质的检测 碱性化合物(-NH2) (M+H)+ 酸性化合物(-CO2H, -OH) (M-H)正离子方式–分析碱性化合物用有机酸调 整pH 值如：甲酸或乙酸 负离子方式–分析酸性化合物用碱调整pH 值如：氨水
扫描类型选择
Full-Scan Mass Spectrometry Single Ion Monitoring (SIM) Selected Reaction Monitoring (SRM)
定性分析（混合物）样品中的物质：分子 量、分子结构、相对含量
定量分析样品中的物质含量 精密质量数的测定

高分辨质谱进行元素组成分析
任何一种同位素的质量并不是正好的整数。 = 12.00000000 ， 1H = 1.007782506， 14N = 14.00307407， 16O = 15.99491475

TSQ 质谱组件
Detection System
Ion Source Interface
QOO QO
Q1 Hyperquad
Q3 Hyperquad
Heated Capillary
Mass Analyzer
Q2 Collision Cell
Dynode
Turbo
Q3
Q2
Q1
Q0
仪器主要功能


Advantages


Disadvantages


Targeted Analyte Monitoring High Duty Cycle Simple

Can suffer from interferences Not as sensitive or selective as SRM (see below)
反相色谱的流动相

反相色谱法的流动相的极性大于固定相， 通常是用甲醇、乙腈或四氢呋喃等极性溶 剂与底剂水组成二元或多元流动相。
在反相色谱中，由于固定相是非极性的， 所以溶剂的极性增加，分离结构相近Βιβλιοθήκη Baidu组 分时，极性大的组分先出柱。

液相色谱的检测方法



紫外－可见光检测器 光电二极管阵列检测器 荧光检测器 电化学检测器 化学发光检测器 红外光谱检测器等
0.2-2 ml/min 5-300 μl/min routinely (1 ml/min possible)
离子化方法选择
根据样品性质确定离子化方式 适合ESI的样品类型： – 高极性化合物、蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物 分子； – 胺类、季铵盐等； – 含杂原子化合物如氨基甲酸酯等 适合APCI的样品类型： – 弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲 酸等 – 含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等 ESI不适合的化合物：极端非极性化合物如苯等； APCI不适合的化合物：非挥发性或热稳定性差的样品
液－固色谱法（liquid-solid chromatography） 反相和正相色谱法 离子对色谱法 离子交换色谱 离子色谱法 空间排斥色谱 亲和色谱法 胶束色谱法 手性色谱法等
HPLC分离原理
最广的色谱法是反相色谱 主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型 化合物，因为键合相表面的官能团不流失，溶 剂的极性可以在很大范围内调整，因此应用范 围很宽。 十八烷基（C18）化学键合相是最常用的非极性 键合相，反相键合相表面具有非极性烷基官能 团，及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性 能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。因此， 分离机制比较复杂。
386
O N N N
N N
Relative Abundance
75
O
Buspirone
50
25
(M+Na)+
408
(丁螺环酮 ) C21H31N5O2
MW = 385
150
200
250
300
350
400
450
500
m/z
Single Ion Monitoring (SIM)
Fixed m/z Pass All Pass All
离子化的方法(Ionisation Methods)
电子轰击电离 EI 化学离子化 CI 场电离，场解吸 FD 快原子轰击 FAB 基质辅助激光解析电离 MALDI 电喷雾电离 ESI 大气压化学电离 APCI

电喷雾电离源 Electrospray Ionization (ESI)
质谱
离子化室
液质联用仪器结构
溶剂瓶箱
PDA检测器 柱温箱 四元泵(包括 真空脱气机)
自动 进样器
高效液相系统
液相色谱流程图
PUMP
Detector W
Data station (Recorder)
or Collection
高效液相系统
储液罐 过滤与脱气装臵 高压输液泵 梯度洗脱装臵 进样系统
液质联用(HPLC/MS/MS)
液质联用(HPLC/MS/MS)
仪器构造
HPLC/MS/MS分析测试原理及功能 仪器适用范围 测试条件的选择 谱图分析
HPLC/MS/MS示意图(**)
自动进样器
色谱柱
离子化室
质量分析器
PDA （阵列二极管检测器）
检测器
计算机
液相色谱
质谱
液质联用仪器结构

常用的脱气方式： 低压脱气法； 吹氦脱气法； 超声波脱气法； 在线脱气。
在线脱气

流动相流经小真空包中的半透膜管路，其 中的气体透过半透膜，由真空泵抽走，从 而达到脱去流动相中溶解空气的目的。
2)梯度洗脱装臵 当一个样品的混和物的容量因子k范围 很宽，等度冲洗时，一则时间太长，二则 后面的峰较宽或扁平不便检测，此时选用 梯度洗脱冲洗可改善样品的分离度，缩短 分析时间，改善峰形和提高样品的最小检 测量。
a 高压梯度洗脱 将溶剂经高压泵加压后再混合的梯度装臵。 洗脱流量精度高，重复性好，不易产生气泡。
混合器
A泵 B泵
梯度程序控制
b 低压梯度洗脱装臵 在常压下，按预先设定的比例混合，再由高 压泵输入色谱柱。重现性好，精度高，仪器组 合简单，但混和前必须高度脱气。
混合器
高压输液
四通
分离方法




流动相的选择


流动相中加入甲酸、乙酸等可提高正离子化效 率 (**)液质联用中，流动相有时需要加入缓冲盐 A CH3COONH4 B HCOONH4 C KH2PO3 是否加酸不是绝对的，具体应根据LC的分离情 况、样品在酸性条件下的稳定性等决定 (**)通常pH值低时，[M+H]+比率高； pH值高 时，[M+Na] + 、[M+K] +，或[M+NH4] +比率高

反相色谱分离原理

疏溶剂理论：当一个非极性溶质或溶质分子中 的非极性部分与极性溶剂相接触时，相互产生 斥力，自由能（G）增加，熵减小，不稳定性增 加。根据热力学第二定律，系统不稳定到稳定 是自发的。因此，为了弥补熵的损失，溶质分 子中的非极性基的取向，将导致在溶剂中形成 一个“空腔”，这种效应称为疏溶剂或疏水效 应。该理论认为，在键合相反相色谱法中溶质 的保留主要不是由于溶质分子与键合相间的色 散力，而是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥 力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔 合。
▼
仪器适用范围
仪器配备决定其适用范围

液相色谱的条件（色谱柱） 离子源的类型
仪器测试条件的选择

液相色谱条件
质谱条件

HPLC条件的选择(流动相)
根据化合物类型选择流动相组成，甲醇-水，乙 腈-水或甲醇-乙腈-水（**DMF、DMSO、 DCSO、THF ） 某些化合物只有某种流动相体系才出峰 一般正离子方式用甲醇，负离子方式用乙腈好 些 梯度的设定：梯度变化太快对离子化效率影响 很大，相应源参数也应该改变，所以恒定比例 流动相能满足分离分析要求时，尽量不用梯度， 尤其定量分析时

1)过滤与脱气装臵（**） 洗脱液进入高压泵前应充分脱气， 不脱气的影响：气泡留在泵中影响泵的正 常工作，使洗脱液压力不稳定，增加基线 的噪声；洗脱液中溶解的氧能破坏样品， 同时氧在190－230nm有弱的吸收，从而减 小检测器的灵敏度；当洗脱液流出色谱柱 进入检测器样品池时由于洗脱压力下降生 成气泡影响检测器的正常工作。
色谱柱的选择
LC流速一般根据色谱柱规格 和电离方式来确定
Flow Rate 1.0 mL/min 0.5 mL/min 0.2 mL/min 50 mL/min < 10 mL/min
APCI ESI
Column I.D. 4.6 mm 3.0 mm 2.1 mm 1.0 mm Capillary
[M+Na]+
[M+H]+
MW=582
[M+K]+
900 m/z
离子源的选择
质量分析器
将离子源产生的离子按其质量和电荷比 （m/z）的不同进行分离，得到按质荷比 （m/z）排列而成的质谱图 质量分析器的种类很多：有磁质量分析器， 四级质量分析器（四级杆滤质器），飞行 时间质量分析器，离子阱质量分析器等 三重四极杆（串联质谱）
大气压化学电离源
**ESI和APCI的异同
离子产生的方式 1.APCI利用电晕放电离子化，气相离子 化。 2.ESI利用液相离子化，带电液滴溶剂蒸 发形成离子。 能被分析的化合物类型不同 1.APCI 弱极性，小分子化合物，且具有 一定的挥发性 2.ESI 极性化合物和生物大分子。

ESI和APCI的异同
电喷雾电离
在强电场下溶液带电 形成带电液滴
带电液滴体积不断缩小 （溶剂蒸发，不断发生库仑爆炸）
离子逸出表面，蒸发进入空间
电喷雾电离的实质：电荷浓缩效应 电喷雾电离的实质：电荷浓缩效应
电喷雾电离(ESI)***
带电液滴 蒸发 + + + _ + _ __ + + + + + 小液滴
+
+ +_ + + _ _ + _ ++ ++ +
12C
m=43.0184Da的离子 必定是C2H3O+， 不可能是C3H7+(m=43.0058) 或 C2H5N+(m=42.9984)， 或CH3N2+(m=43.0296)。
为了区分这四个离子，测量的质量的准确度需达 到130 ppm。即小数点后第四位是准确的。 ▼ 元素组成信息随着质量的增加而呈指数地上升， 对质谱质量的测定准确度要求更高。
++ + +
+ ++++
++
+ ++ ++ +
+ + ++ + +
+ + +
+
+
ESI离子蒸发机理
大气压化学电离源
Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) APCI 离子化过程 1. 高电压放电针与载气和溶剂反应产生初级的离子 O2 + e → O2+ + 2e N2 + e → N2+ + 2e 2. 通过一系列复杂的反应初级离子与溶剂分子反应生 成溶剂离子 H3O+ and CH3OH2+ 3. 溶剂离子与待分析物分子形成(M+H)＋或者 (M-H)H3O+ + M → (M+H)+ + H2O OH• + M → (M-H)- + H2O **比较ESI EI APCI电离源
流速 1.ESI 0.001到0.25 ml/min。 2.APCI 0.2到2 ml/min。 多电荷 1.APCI不能生成一系列多电荷离子，所以不适 合分析大分子。 2.ESI 能生成一系列多电荷离子，特别适用于 蛋白，多肽类等生物分子。 都属于软电离方式，能够提供分子量的信息

EI离子源质谱图