第四章 酶的固定化和固定化酶反应动力学
高级生化题库——第四章酶
⾼级⽣化题库——第四章酶第四章酶⼀、名词解释1、固定化酶⼆、是⾮题1、酶的最适pH与酶的等电点是两个不同的概念，但两者之间有相关性，两个数值通常⽐较接近或相同。
（－）2、对于⼀个酶⽽⾔，其过渡态的底物类似物与底物的物相⽐较，是更有效的竞争性抑制剂。
（＋）3、在结构上与底物⽆关的各种代谢物有可能改变酶的Km值o4、如果加⼊⾜够的底物，即使存在⾮竞争性抑制剂，酶催化反应也能达到正常的Vmax。
5.、酶反应最适pH不仅取决于酶分⼦的解离情况,同时也取决于底物分⼦的解离情况( )6、反竞争性抑制剂(I)⾸先与酶结合形成EI，EI再与底物(S)结合形成EIS，EIS不能分解成产物，I因此⽽起抑制作⽤。
7、Km的物理意义是指当酶反应速率达到最⼤反应速率⼀半时的底物浓度。
为使某⼀反应的反应速度从10%Vmax提⾼到90%Vmax，其底物浓度应提⾼9倍。
8、推导Michaelis-Menten⽅程时，假设之⼀是随底物转变为产物，酶-底物复合物的浓度不断下降。
9、⼀种酶有⼏种底物时，就有⼏种Km值。
10、别构酶对温度的反应很特殊，有的在0℃时不稳定，在室温时反⽽稳定。
三、填空题1、酶容易失活，如何保存酶制品是⼀个很重要的问题。
通常酶制品的保存⽅法有＿＿＿和＿＿＿等。
2、有⼀类不可逆抑制剂具有被酶激活的性质,被称为_________型不可逆抑制剂,⼜可被称作酶的_____________3、抗体酶既具有专⼀结合抗原的性质，⼜具有酶的催化功能。
4、胰蛋⽩酶原__________端切去6肽后变成有活性的胰蛋⽩酶。
5、于1953年⾸先完成了胰岛素的全部化学结构的测定⼯作。
⽽⽜胰核糖核酸酶是测出⼀级结构的第⼀个酶分⼦，由⼀条含124个残基的多肽链组成，分⼦内含有__________个⼆硫键。
6、胰凝乳蛋⽩酶原受到胰蛋⽩酶作⽤后，在______________与_______________之间的肽键断开，成为有活性的π-胰凝乳蛋⽩酶，再失去两个⼆肽_________________和________________⽽形成酶的稳定形式α-胰凝乳蛋⽩酶。
[生物学]第4章四 固定化酶的性质
![[生物学]第4章四 固定化酶的性质](https://img.taocdn.com/s3/m/bd4e825602768e9951e7386d.png)
可能是偶联过 程中酶得到化 学修饰．或固 定化过程提高 了酶的稳定性。
(二)固定化对酶稳定性的影响
稳定性实际
30 25 20 15 10 5 0 提高 不变 降低 12 8 固定化酶数 30
应用
大多数情况下酶经过 固定化后其稳定性都 有所增加。
Merlose选择50种固定化 酶测试稳定性
稳定性提高方面:
热稳定性提高 保存稳定性好 对蛋白酶的抵抗性提高,不易被蛋白酶水解 对变性剂的耐受性提高,可耐受尿素、有机 溶剂和盐酸胍等蛋白质性剂的作用。 对不同pH稳定性提高
A 热稳定性
B有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高
提高固定化酶对各种有机溶剂的稳定性， 使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成 为可能。固定化酶在有机合成中应用会进 一步发展。
1、固定化后最 适pH升高了 2、pH稳定性增强
最适pH偏移的原因
载体带电荷影响酶所在微环境
结果
•带负电荷载体(阴离子聚合物)制备的固定化 酶，其最适pH较游离酶偏高。 •使用带正电荷的载体其最适pH向酸性偏移。
产物对最适pH的影响 主要是由于固定化载体成为了扩散障碍， 使反应产物向外扩散受到一定限制。
催化反应产物为酸性（H+）， 则最适pH比游离酶高（需 OH-中和）反之则偏低，中性 则不变。
+ + +
+
（五）底物特异性
由于存在空间位阻，可能不再作用于分子 量较大的底物，只对小分子量底物有效。 例：胰蛋白酶可作用于高分子的蛋白质， 又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在 羧甲基纤维素上后，对二肽或多肽作用保 持不变，但对酪蛋白的作用仅为游离酶的 3%左右。
《酶工程》 课后习题答案
① 酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或者服务于其它目的地一门应用技术。
② 比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或者 RNA 所拥有的酶活力单位数。
③ 酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。
其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。
④ 酶活国际单位 : 1961 年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件 )下，每分钟内能转化1 μmol 底物或者催化1 μmol 产物形成所需要的酶量为 1 个酶活力单位，即为国际单位(IU)。
⑤ 酶反应动力学:指主要研究酶反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。
酶的研究简史如下：(1)不清晰的应用：酿酒、造酱、制饴、治病等。
(2)酶学的产生： 1777 年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验； 1822 年，美国外科医生 Beaumont 研究食物在胃里的消化； 19 世纪 30 年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。
1684 年，比利时医生Helment 提出 ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素(酵素)；1833 年，法国化学家 Payen 和Person 用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶； 1878 年，德国科学家 K hne 提出 enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”(希腊文)。
(3)酶学的迅速发展(理论研究)： 1926 年,美国康乃尔大学的”独臂学者”萨姆纳博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质;1930 年，美国的生物化学家 Northrop 分离得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。
I.酶工程发展如下：①1894 年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化：②1908 年，德国的Rohm 用动物胰脏制得胰蛋白酶，皮革软化及洗涤；③1911 年， Wallerstein 从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清；④1949 年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕；⑤1960 年，法国科学家 Jacob 和 Monod 提出的控制子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量；⑥1971 年各国科学家开始使用“酶工程”这一位词。
04酶促反应动力学
(二) 前稳态动力学与稳态动力学的比 较
时间 反应速度 反应步骤 前稳态动力学 稳态动力学 0~t1 t1~ t2 d P d S d ES 常数 dt dt dt k1 k2 ES E S ES E P k -1
二、单底物酶促反应稳态动力学
k2 E S ES E P k1 k -1
ES(酶-底物复合物)生成速度 d S k1 E S dt ES分解速度= k 1 ES k 2 ES ES净生成速度
d ES dt
=ES生成速度-ES分解速度
t=0, [ES]=0, [P]=0, [S]最 大,ES生成速度最大, 0~t1内, [S] ↘, [P] ↗, [ES] ↗, 到t1时,达到恒定. ES生成速度↘, ES分解速 度↗, ES净生成速度↘ t1~ t2内, [S] ↘, [P] ↗, [ES] → (稳态或恒态) ES生成速度= ES分解速度, ES净生成速度→ T2后, [ES] ↘
零级反应
混合级反应 一级反应
S K m , S
K m ,
（1）酶反应的反应速度和底物浓度直接相 关； （2）底物浓度决定着酶系统的反应级别； （3）衡量这种关系的尺度是Km；
米氏方程概括的这些规律和绝大多数实验结 果一致，但少数情况下产生异常。例如，1/v 对1/[S]作图时，一般应该得到线性图形，但 有时也会产生偏差，原因可能为：
K m S
V S
或
（二）米氏方程的物理意义 1.提供了两个极为重要的酶反应动力学常数Km和可擦他kcat 并通过他们表达了酶反应性质、反应条件和酶反应速度之间 的关系。 Km的物理意义： ⑴特定的反应，特定的反应条件下，Km是个特征常数，可部 分描述酶反应性质、反应条件对酶反应速度的影响。故可用 来鉴别不同的酶。 ⑵1/Km表示酶与底物的亲和力，Km越大，亲和力越小，反之 越大。 ⑶当v=V/2时，Ks=[S]。表明Km相当于反应达到最大速度一 半时的底物浓度，或者说，相当于要使反应系统有一半的酶 分子参加反应所必须具有的底物浓度。 ⑷通过Km可判断酶的最适底物，因为最适底物具有最大的 V/Km。 ⑸通过Km可了解酶的底物在体内可能具有的浓度水平。一般 酶<<Km,那么v<<V,大部分酶处于浪费状态; 反之,如果[S] >>Km,那么v≈V，[S]将失去其生理意义。 ⑹通过体外测定某些物质对Km的影响，可以推断出该物质可 能有的生理效应，如作为抑制剂或活化剂等。
固定化酶
⑧充分考虑到固定化酶制备过程 和应用过程中的安全因素。
固定化载体的选择标准
① 载体的形式 ② 载体的结构 ③ 载体的性质
④ 酶偶联量或装载量和实效系数
二、固定化酶的制备方法
结晶法 分散法 物理吸附法 离子结合法 网格法
非化学结合法
包埋法
微囊法 交 联 法
化学结合法
共价结合法
1、物理吸附法
(physical adsorption)
第一节
第二节
酶的固定化
辅酶的固定方法
第三节
第四节
固定化细胞
固定化酶的性质及其影响因素 Nhomakorabea
第五节
固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
解决办法??
第一节
酶的固定化
一、固定化酶（Immobilized Enzyme）
定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的 酶，能连续地进行反应，反应后的酶可回收 重复使用。
固定化酶的优缺点
固定化酶优点：
(1)简化了提纯工艺 (2)可以装塔连续反应
固定化酶缺点：
①酶活力有损失 ②工厂初始投资大 ③只能用于可溶性底物， 对大分子底物不适宜 ④与完整菌体相比，需 要辅助因子的催化反应 不适宜于多酶反应
法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很 麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基 丙烯酸甲酯等。
界面聚合法
化学方法。将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合， 形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。所得的微 囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中 发生化学反应而失活。
4.11第四章酶与细胞的固定化
3. 交联法
借助双功能或多功能试
酶
剂在酶分子间、酶分子与
载体间进行交联反应，形成网状结构的固化酶常用试剂：戊二醛、己
二胺等
合成胶：聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂
1. 凝胶包埋法 (gel entrapment)
② 制备方法 以合成胶为载体（易失活，强度高）： 聚丙烯酰胺凝胶包埋法： ➢ 丙烯酰胺单体和N,N’-甲叉双丙烯酰胺溶于水 中，加入酶液混合均匀聚合 ➢ 加入TEMED和AP，静置至聚合完全 ➢ 将凝胶切成小块，生理盐水清洗残余游离酶。
不能 低 不变
较难 强 中等
不能 中等 可变
二、固定化酶的性质
影响酶的性质的因素： 构象改变和立体屏蔽 微扰效应、分配效应和扩散限制效应
1. 固定化酶的活力
不变/下降 解决办法：避免损害或屏蔽酶的活性中心，加入
抑制剂、底物或产物以保护酶的活性中心；引入 连接臂。 例：乳糖酶的固定化就采用在其抑制剂葡萄糖-内酯存在下进行聚丙烯酰胺凝胶的包埋，如此可 获得高活力的固定化乳糖酶。 固定化后活力会否提高？？
提交
强生稳豪倍易血糖仪
工作原理: 利用试纸上的固定化酶 (葡萄糖氧化酶, Glucose oxidase , GOD) 与血液中的葡萄糖反应产生 的电流来测血糖值。
葡萄糖氧化酶电极
半透膜 酶胶层
感应电极
酶电极示意图
ß-D-葡萄糖＋O2
D-葡萄糖酸-1, 5-内酯＋H2O2
第四章 酶与细胞的固定化
（1）物理吸附法 ➢ 常用载体
酶与细胞的固定化
（二）包埋法
原理
– 将酶包埋于格子(Lattice)内，格子的结构可以防止蛋白质 渗出于周围基质中，但是底物仍能渗入格子内与酶相接 触
优缺点
– 优点：酶分子本身不参加水不溶性格子的形成、方法较 为简便、酶分子未受到化学作用、活力较高
– 缺点：不适用于大分子底物
根据使用包埋剂分类
– 聚丙烯酰胺凝胶包埋法、辐射包埋法、卡拉胶包埋法、 大豆蛋白质包埋法、微囊法等
– 利用聚丙烯酰胺凝胶或胶原膜包埋谷氨酸棒杆菌，用分批法或装柱 法连续由葡萄糖合成
L-苹果酸
– 利用聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌
35
（五）生产 a-淀粉酶
方法
– 利用聚丙烯酰胺凝胶包埋枯草杆菌
特点
– 凝胶中的细菌在保温过程中仍在生长
36
二、固定化技术需要考虑的重要因素
本征速率和动力学参数
– 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂凝胶、骨胶原、海藻酸钙 凝胶，K-角叉菜聚糖等
26
常用包埋剂的优缺点
K-角叉菜聚糖
– 制法简单，机械强度好，稳定性高，不影响细胞的代谢 活力
– 国内来源困难
海藻酸钙
– 钙离子容易被培养基中的磷酸根离子夺走而使凝胶解体
聚丙烯酰胺凝胶
– 孔径控制容易，机械强度好，富有弹性，细胞的活性高
抗生素
– 利用固定化细胞可以由单一营养物生成杆菌肽， 比传统发酵法（用淀粉-肉汤培养基）优越
33
（三）生产酒精和啤酒
酒精
– 传统酒精发酵需要大型发酵罐，不但设备繁杂， 操作困难，而且耗费一部分糖以供酵母生长之用 – 应用固定化细胞进行连续发酵后，酒精发酵时间 由传统方法的36h缩短至3h以下，乙醇生产能力 每小时为20～50g/L，而传统方法仅为2g/L – 细菌固定化的研究也颇为活跃
酶的固定化
13
吸附法 包埋法 共价结合法通过载体表面 和酶分子表面间的次级键相 互作用而达到固定目的的方 法. 只需将酶液与具有活泼 表面的吸附剂接触,再经洗 涤除去未吸附的酶便能制得 固定化酶.是最简单的固定 化技术,在经济上也最具有 吸引力.
常用的固体吸附剂有活性炭,氧化铝, 活性炭,氧化铝, 活性炭 硅藻土,多孔陶瓷,多孔玻璃,硅胶, 硅藻土,多孔陶瓷,多孔玻璃,硅胶,羟 基磷灰石等. 基磷灰石 操作简便,条件温和,不会引起酶变性 失活,载体廉价易得,而且可反复使用 由于靠物理吸附作用,结合力较弱 结合力较弱,酶 结合力较弱 与载体结合不牢固而容易脱落,所以使用 受到一定的限制.
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂. 世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAE-Sephadex A-25吸附的氨 基酰化酶反应用于 DL-AA的光学分析.
16
2,包埋法(Entrapment) 包埋法(Entrapment)
包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内 包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内,格子的结构 格子 可以防止酶渗出到周围的培养基中, 可以防止酶渗出到周围的培养基中,而底物分子仍能渗 入格子内与酶接触. 入格子内与酶接触. 包埋类型可有:网格型,微囊型及脂质体液膜型. 包埋类型可有:网格型,微囊型及脂质体液膜型.
15
根据吸附剂的特点又分为两种: 根据吸附剂的特点又分为两种:
物理吸附法是通过氢键,疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载
体的方法. 常用的载体有:高岭土,皂土,硅胶,氧化铝,磷酸钙 胶,微空玻璃等无机吸附剂,纤维素,胶原以及火棉胶等 有机吸附剂. 离子结合法是指在适宜的pH和离子强度条件下,利用酶的侧链 解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法 (离子键). 最常用的交换剂有CM-纤维素,DEAE-纤维素,DEAE葡聚糖凝胶等;其他离子交换剂还有各种合成的树脂如 Amberlite XE-97,Dowe X-50等.
酶的固定化..
纤维素
CMC －CH2COOH
+盐酸甲醇
CMC－甲酯 ＋肼 制备酰肼 CMC－酰肼 亚硫酸钠 ＋ 盐酸 CMC－叠氮化物 ＋NH2 酶
重氮化剂、烷化
剂等反应形成共 价键制备固定化
酶。
叠氮化物
固定化酶 －CH2CO-NH 酶
羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序
共价键结合法
4.包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶 固定化的方法。 载体：琼脂、海藻酸钠、明胶聚丙烯酰胺等 包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊法。 凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微
孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多 数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶 有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶 以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。
2)、制备固定化酶遵循基本原则：
（1）必须注意维持酶的催化活性及专一性。 （ 2 ）固定化应该有利于生产自动化、连续化。 （3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨 碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。 （4）酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能 回收贮藏，利于重复使用。 （5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与 废物、产物或反应液发生化学反应。 （6）固定化酶成本要低，以利于工业使用。
微胶囊法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球
内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰 胺膜、火棉胶膜等。
包埋法
凝胶包埋法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）
丙烯酰 胺
氢气
固定化 酶
光照 切 割 聚合反应 凝胶酶块
酶液
N， N－ 双丙烯 酰胺
第四章__酶工程原理及其在食品工业中的应用详解
（2）离子吸附法。通过离子效应，将酶分子固定到 含有离子交换基团的固相载体上。 常见的载体：DEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖凝胶、 CM-纤维素、DOWEX-50等。 优点：操作简单，处理条件温和，能得到酶活回收 率较高的固定化酶。 缺点：酶与载体的结合力较弱，当离子强度高、缓 冲液种类或pH值发生变化时，酶容易脱落。
酶工程一般工艺流程示意图
胞外酶
胞内酶 菌种→基因改造→发酵→发酵酶液→预处理→细胞分离→细 胞破壁→碎片分离→提取→精制→酶制剂及其改造 酶制剂 ↓ 原料→前处理→杀菌→酶反应器→反应液→产品提取→成品
（二）酶工程的发展历程 1.20世纪50～60年代早期的酶工程技术，主要是从 动物、植物和微生物原料中提取、分离、纯化制造各种 酶制剂，并将其应用于化工、食品和医药等工业领域。 2.20世纪70年代后期，酶的固定化技术取得了突破， 使固定化酶、固定化细胞、生物反应器与生物传感器等 酶工程技术迅速获得应用。 3.目前，各种酶工程技术已用于制造多种精细化工 产品和医药产品，并且在食品工业、化学检测和环境保 护等各个领域中得到了有效的应用。
（二）非机械破碎法 1.酶溶法 加酶法:常用的有溶菌酶、蛋白酶、糖苷酶等，它们 对细胞壁或细胞膜进行酶解，使细胞破碎。 自溶法：在微生物生长代谢过程中，控制一定条件， 诱发微生物产生少量的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力， 以达到细胞自溶的目的。 2.化学渗透法 用有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素或金属 螯合物等处理，使细胞壁或膜的通透性（渗透性）改变， 从而使胞内物质有选择地渗透出来。
（三）根据酶分子电荷性质的方法 1.离子交换层析 根据被分离物质与分离介质（离子交换剂）间异种电 荷的静电引力的不同来进行物质分离的。不同离子交换剂 上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同物质 分离。 离子交换剂根据活性基团的性质分为阳离子交换剂和 阴离子交换剂。酶具有两性性质，可用阳离子交换剂，也 可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。
生化工程原理复习题及答案
生化工程原理复习题及答案一、名词解释1、生化工程：将生物技术的实验室成果经工艺及工程开发，成为可供工业生产的工艺过程，常称为生化工程。
2、灭菌：是指用物理或化学方法杀灭物料或设备中的一切生命物质的过程。
3、惯性冲撞机制：气流中运动的颗粒，质量，速度，具有惯性，当微粒随气流以一定的速度向着纤维垂直运动时，空气受阻改变方向，绕过纤维前进，微粒由于惯性的作用，不能及时改变方向，便冲向纤维表面，并滞留在纤维表面。
4、细胞得率：是对碳的细胞得率。
=生成细胞量某细胞含碳量或=消耗基质量某基质含碳量。
5、生物反应动力学：是研究在特定的环境条件下，微生物的生长、产物的生成、底物的消耗之间的动态关系及规律，以及环境因子对这些关系的影响。
生物反应工程：是一门以生物反应动力学为基础，研究生物反应过程优化和控制以及生物反应器的设计、放大与操作的学科。
6、返混：反应器中停留时间不同的物料之间的混合称为返混。
7、细非结构模型：8、非结构模型：如果把菌体视为单组分，则环境的变化对菌体组成的影响可被忽略，在此基础上建立的模型称为非结构模型。
结构模型：在考虑细胞组成变化基础上建立的微生物生长或相关的动力学模型。
9、限制性底物：是培养基中任何一种与微生物生长有关的营养物，只要该营养物相对贫乏时，就可能成为限制微生物生长的因子，可以是C 源、N源、无机或有机因子。
10、绝对过滤介质：绝对过滤介质的孔隙小于细菌和孢子，当空气通过时微生物被阻留在介质的一侧。
深层过滤介质：深层过滤介质的截面孔隙大于微生物，为了达到所需的除菌效果，介质必须有一定的厚度，因此称为深层过滤介质。
11、均衡生长:在细胞的生长过程中，如果细胞内各种成分均以相同的比例增加，则称为均衡生长。
非均衡生长:细胞生长时胞内各组分增加的比例不同，称为非均衡生长。
二、问答1、试述培养基灭菌通常具有哪些措施？灭菌动力学的重要结论有哪些？答：培养基灭菌措施有：（1）使用的培养基和设备需经灭菌。
最新[理学]食品酶学课件本第四章固定化酶幻灯片
![最新[理学]食品酶学课件本第四章固定化酶幻灯片](https://img.taocdn.com/s3/m/71f187bbaf1ffc4fff47ac9f.png)
特点：菌体本身既是酶供体同时也是载体，所以方 法简便。但需注意的是，热处理会引起酶的热变性
失活，因此，该法只适用于目标酶热稳定性较好时，
而且进行热处理时还需严格控制好热处理强度，即 严格把握加热温度和时间。热处理法也可与其它固 定化方法配合使用，进行双重固定化。
1/9/2021
18
各固定方法的特点与比较
以上四种固定化酶方法各有其优缺点（见表4-1）。往往一 种酶可以用不同方法固定化，但没有一种固定化方法可以 普遍地适用于每一种酶。在实际应用时，常将两种或数种 固定化方法并用，以取长补短。
⑤1973年，千畑一郎等人又采用固定化微生物细胞连续化生
产L—天冬氨酸，后来又发展到固定化增殖细胞即固定化活
细胞。 1/9/2021
7
三、酶和菌体的固定化方法
（一）吸附法 （二）包埋法 （三）结合法 （四）交联法 （五）热处理法 各固定方法的特点与比较
酶固定化方法示意图
1/9/2021
1/9/2021
2
固定化酶示意图
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
1/9/2021
3
（三）固定化酶的发展简史
①1916年Nelson和Griffin就曾经将转化酶吸附在炭和氧化 铝上，并且证明这种吸附的酶（即固定化酶）具有活性。
②1953年，Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为 载体，经重氮化法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白 酶、核糖核酸酶等结合，制成了固定化酶。
[理学]食品酶学课件本第四章固 定化酶
一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在载体上并在一定空间范围内进行催化 反应的酶。示意图
酶的固定化是指通过某种方式将酶和水不溶性载体相结合， 使酶被集中和限制，从而在使用时不再扩散。固定化酶具 有稳定性增加、可反复使用并易于和产物分开等优点，克 服了游离酶的不足之处。
第四章 固定化酶
第四章固定化酶固定化酶的是指是具有催化活性蛋白质的固定化，因此固定化酶一般为具有各种性状的颗粒，其反应过程必须在颗粒水平上进行描述和表达。
它的显著特征是：在描述其反应过程动力学时，必须包含有反应物系从液相主体扩散到颗粒内、外表面的传递速率的影响。
第一节固定化酶概论酶的催化作用具有高选择性、高催化活性、反应条件温和、环保无污染等特点，但游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等稳定性较差，易失活，并且反应后混入催化产物等物质，纯化困难，不能重复使用。
为了克服这些问题，20世纪60年代酶固定化技术应运而生。
它是模拟体内酶的作用方式（体内酶多与膜类物质相结合并进行特有的催化反应），通过化学或物理的手段，用载体将酶束缚或限制在一定的区域内，使酶分子在此区域进行特有和活跃的催化作用，并可回收及长时间重复使用的一种交叉学科技术。
固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971年酶工程会议上被推荐使用的。
Trevan在1980年给出了固定化酶的定义：酶的固定化就是通过某些方法将酶与载体相结合后使其不溶于含有底物的相中，从而使酶被集中或限制在一定的空间范围内进行酶解反应。
其实，固定化酶并不是新的物质，例如，胞内酶是在细胞内起作用的，类似于用包埋方法制成的固定化酶。
因此，固定化酶研究一定程度上可以认为是为了使酶在更接近其原始状态下进行的反应。
对各种酶的固定化技术进行积极的研究与开发始于20世纪50年代，通过重氮化共价结合法将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶等固定在聚氨基苯乙烯树脂上；1963年，利用聚丙烯酰胺包埋法固定了多种酶；1969年，日本的一家制药公司首次将固定化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。
通常的生物催化剂，如酶或细胞同其它溶质一样，分散在溶剂或溶液中，可以自由移动，称为游离酶或游离细胞。
若通过固定化技术将酶固定于载体表面或其内部，则与液相主体相分离，形成了固定化生物催化剂，即固定化酶。
酶的固定化
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。
1）离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。
常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
2）共价键结合法载体基质通常是水不溶性的，这些载体包括：（1）天然载体：琼脂、琼脂糖、几丁质、纤维素、胶原蛋白等；（2）有机合成聚合物：聚亚胺酯、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、尼龙等（3）无机载体：玻璃、氧化铝、硅胶、磁铁矿、氧化镍等。
用于连接载体的酶蛋白氨基酸残基上的反应功能基团有：Asp Glu侧链的—COOH、C-末端的—COOH；Tyr的苯酚基；Cys的—SH；Lys的ε-NH2、N-末端—NH2；Thr、Ser的—OH；His的咪唑基。
在酶的固定化过程中，由于疏水性氨基酸通常被掩藏在酶蛋白分子的内部，所以疏水性氨基酸通常不参与形成共价键。
载体活化方法：（1）重氮化法（2）叠氮法（3）溴基化法（4）烷基化法等。
4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子之内、酶与惰性载体间进行相互交联，制成网状结构的固定化酶的方法，称为交联法。
常用的双功能试剂有戊二醛、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮联苯等。
其中戊二醛最为常用，酶表面含有不止一个—NH2，戊二醛与酶上的-NH2发生Schiff反应，形成席夫碱，形成一个复杂的酶交联网络。
交联酶法借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。
可视为一种无载体的固定化方法。
如木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度，2.3%戊二醛，pH5.2～7.2，0℃下交联24h，可制成固定化酶。
共交联法共交联法是指酶分子在双功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶载体之间发生交联，可降低单纯酶分子之间交联反应所引起的活性丧失。
通常选用的惰性蛋白有牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原蛋白、血红蛋白等。
如一定量的脲酶加入到2.5mL含6%牛血清蛋白、0.2%戊二醛的0.02mol/L 磷酸缓冲液中，混合均匀后降温至-30℃，再升温至4℃，静置4h，形成泡沫状聚合物，冷冻干燥后，即为固定化酶。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2 共价交联法
双功能试剂与酶蛋白质中的氨基酸残基作用，使
酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶.
常用的是戊二醛
O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
发生作用的氨基酸残基
：
酪氨酸的酚基 胱氨酸的SH巯基 N－末端的a－氨基。
常用的双功能或多功能试剂：
戊二醛 聚甲叉双碘乙酰胺 双重氮联苯胺
共价结合
• 通过共价键，把与酶蛋白活性无关的氨基 酸功能基团连接在不溶于水的载体上。
（1）酶与载体反应的主要功能基团
游离羧基：肽链C－末端的α –羧基，天冬氨酸 ，谷氨酸的β－γ羧基 游离氨基：肽链N－末端的δ －氨基， 赖氨酸ε －氨基 巯基：半胱氨酸 羟基：丝氨酸，苏氨酸 酚基：酪氨酸 咪唑基：组氨酸
第四章 酶的固定化与 固定化酶反应动力学
内容
• 酶的固定化 • 辅酶的固定化 • 细胞的固定化 • 固定化酶促反应动力学 • 固定化酶的应用
第一节 酶的固定化
• 酶在使用中的不足
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸、碱、有机溶剂 有影响）， 2.不能回收，无法自动化、连续化生产， 3.产物分离纯化增加困难。 对其
叠氮化物
固定化酶 －CH2CO-NH 酶
羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序
d.烷化法
• 一般常用三氯三嗪基试剂活化纤维素，然后偶联 酶,与酶的氨基、酚羟基、巯基反应，产生固定化 酶（交联葡聚糖，琼脂糖，多孔玻璃等）。
优缺点
优点：酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长
时间使用。
缺点：制备条件复杂；酶蛋白活性中心易破坏
• 将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。 • 根据结合的方式不同，又可分为物理吸附、离子 结合和共价结合三种。
物理吸附
• 作用力：氢键、范德华力 、疏水键等 • 吸附剂
无机吸附剂（高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等） 有机吸附剂（纤维素、胶原等）比较受重视。
特点
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶的高级 结构变化少，操作简便。 • 缺点：酶与载体的结合力弱，酶易脱落。 • 吸附技术：
一、什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 间歇 固定化
吸附
包埋
间歇
交联
连续
化学偶联
固定化酶的源流
固定化酶是1971年在美国举行的第一次世界酶会议 上推荐确定的。又称水不溶性酶、固相酶。 50年代开始。将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，再与羧 肽酸、淀粉酶等结合制成最早的固定 化酶 1969年。 用固定化氨基酰化酶拆分DL-氨基。 第一个工业生产的固定化酶。
a. 重氮法
a.将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸处 理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8—9)条件 下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。
b.溴化氰法
• 含有羟基的载体(如纤维素、葡聚糖、琼脂等)在碱性条件下， 与CNBr反应，生成活泼的亚胺碳酸基，在弱碱条件下，可 与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。 • 此方法固定化后相对酶活力比较高，且相当稳定，同时操作 也简便。是最受欢迎的一种方法.
例子
• 氨基酰化酶20mL固定化，反应后滤液及洗涤液 共50mL。若原酶活力1000u/mL，洗涤液活力 20u/mL。0.5g固定化酶活力为100u（共得50g 固定化酶）。问固定化酶的相对活力是多少？回 收率及结合率是多少？
一 固定化对酶活性及酶反应的影响
1.构象改变、立体屏蔽
出现于吸附和共价结合法
引聚剂：
过硫酸铵、核黄素
（3）制备的固定化酶
凝胶或膜 聚丙烯酰胺凝胶
淀粉 琼脂
酶 α、β－淀粉酶 葡萄糖氧化酶 乳酸脱氢酶 胆碱酯酶 青霉素酰胺酶
2 微型胶囊法 （1）原理 把酶包在超薄半透性 的聚合物膜中，制成 球状含酶微型胶囊。
（2）特点
微囊直径几微米～几百微米。 低分子底物可以自由通过并进入微囊内。 与酶反应后的生成物被排除在微囊外， 酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中， 外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内
包埋法制备固定化菌体应用举例
包埋材料 琼脂
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
菌种 大肠杆菌 大肠杆菌
酶系
用途
明胶－戊二醛 短乳杆菌 链霉菌 聚丙烯酰胺 大肠杆菌
醋酸纤维素 大肠杆菌
谷氨酸脱羧酶 制造γ-酪蛋白 青霉素酰胺酶 生产6-氨基青霉烷酸 (6-APA) 葡萄糖异构酶 从葡萄糖生产高果糖 浆
天门冬氨酸酶 青霉素酰胺酶 生产6－APA （裂解） 青霉素酰胺酶 生产半合成青霉素 （合成）
(3)采用疏水载体时，底物是极性物质，Km固定化 后会升高。采用疏水载体时，底物是疏水物质， Km固定化后会降低。
3 扩散效应
•外扩散：底物从液相主 体向固定化酶的外表面 扩散，或产物沿相反途 径扩散 •外扩散发生在催化反应 之前或之后 •内扩散：对有微孔载体 的固定化酶，底物从固 定化酶外表面扩散到微 孔内部，或产物沿相反 途径扩散。 •内扩散与催化反应同时 进行
一、什么是固定化细胞？
• 通过各种方法将细胞与水不溶性载体结合，制备固定化细 胞的过程 • 细胞固定化包括：
1.微生物细胞固定化 2.植物细胞固定化 3.动物细胞固定化 4.原生质体固定化
固定化细胞特点
1.优点:
(1)省去了酶的分离手续．为多酶系统，无须辅因子再生。 (2)细胞生长快、而且多、反应快。 (3)可以连续发酵，节约了成本，排除产物抑制和消耗。 (4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定。
（2）所用载体
重氮化法：具有氨基的不溶性载体（R－NH2）。 以稀盐酸和亚硝酸钠作用形成重氮化合物。 多糖类衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃 烷 化 法：卤族的乙酰衍生物（氯乙酰纤维素、溴乙酰纤 维素、碘乙酰纤维素） 含卤族的高聚物（氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）
（3）方法
载体的活化：通过一定的方法，在载体上引进一个活泼基团
二 载体结合法（吸附、离子结合法）
1 原理
将细胞在适当的条件下与载体吸附或形成络合物 固定在载体上。
2 常用载体
硅藻土、多孔玻璃、离子交换纤维素、离子树脂 、DEAE－纤维素。
3 优缺点
优点：方法简单、载体易于再生。 缺点：结合力弱，细胞易脱落。
载体结合法制备固定化菌体举例
载体 菌体 酶 用途 离子交换纤维 丝状菌孢子 转化酶 蔗糖的转化 素 阴离子树脂 放线菌 葡萄糖异构 制造果糖 酶 DEAE-纤维素 巨大芽孢杆 青霉素酰胺 制造6APA 菌 酶
强
交联法
包埋法
难 中 易变 强
难 高
底物特异性
结合能力
不变
中
不变
弱
再生
可能
可能
不可
不可
不可
第二节 辅酶的固定化
1. • • • • 辅基的固定化 对于必需辅基的酶，固定化酶时一般将辅基同时固定。 一般辅基分子和载体之间要接入0.5～1.0nm长的间隔基。 将辅基共价结合于载体上之前，要考虑在辅基分子的适 当位置引入功能团，如引入羧基或氨基，使之易与载体 偶联。 磷酸吡哆醛，FAD、FMN、TPP、生物素、硫辛酸、卟 啉等可利用分子本身所具有的功能团。 将具有功能团的辅基先与间隔基结合，再与活化的载体 偶联；或先使间隔基与活化载体结合，再与辅基偶联。
•
2、辅酶的固定化
• 辅酶与酶蛋白的结合是松弛的，在固定时要保证能与两种 酶都能有最恰当的结合。 • 将辅酶固定于一高分子上，然后用微囊法将辅酶和两种酶 一同包埋于微囊内。 • 高分子化一般的顺序是先在辅酶的一定部位引入适当的功 能基团或间隔基，生成辅酶的衍生物，然后再与水溶性高 分子共价结合。
第三节 细胞固定化
二、 酶固定化后的性质变化
酶固定化后，原有的某些性状会产生一定变化。 1 对底物的特异性。对低分子底物作用变化不大，而对 高分子底物的催化作用明显减弱。是由于载体的空间位 阻引起的。
2 酶反应最适PH值的改变 与载体性质有关
（2）反应机理
载体的作用： ▼保持酶的立体结构 ▼保护酶的活性中心 ▼保证酶的连续催化反应
制备原则
化学方法、物理方法、物理与化学结合法三种。
（1）保护酶蛋白的立体结构不变。 （2）避免不溶性载体与酶的活性中心发生作用 （3）在温和条件下进行，避免高温、高压、强酸 碱等
二、酶的固定化方法
1.载体结合法
（3）微型胶囊法优缺点
优点： A 制备条件温和，制得的胶囊不易变化。
B 能很好地保存天然酶的活性和特性。 C 大小可任意调节，制备时间短。
缺点： 单体很活跃。在胶囊化过程中要充分注意防
治酶的失活和变性。
固定化酶的制法及其特性比较
特性
物理 离子 吸附法 结合法 制法 酶活力 易 低 不变 弱 易 高 制备方法 共价键 结合法 难 高 易变
出现于包埋、吸附和共价结合法
2.分配效应
• 固定化载体亲水、疏水性质影响底物、产物在微 环境和宏观体系之间的分配，最终影响酶反应速 度
⑴ 载体与底物带相同电荷，Km’>Km 固定化酶降 低了酶的亲和力。 ⑵ 载体与底物电荷相反，静电作用，Km’<Km • 上面的效应可以通过调节离子强度减弱而消除
a. 混合浴或振荡浴吸附法 b.反应器中直接吸附法 c. 电沉积法
物理吸附法固定化酶举例 载体 活性炭 固定化酶
α －淀粉酶、β －淀粉酶 蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶
多孔玻璃
氧化铝
核糖核酸酶、木瓜蛋白酶 脂肪酶、葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶 亮氨酸氨肽酶
胰蛋白酶、核糖核酸酶 Β－淀粉液化酶 磷酸化酶
碳酸钙凝胶
纤维素 麸素 硅胶
离子结合