测定细菌数量的方法

测定细菌数量的方法

1、计数器测定法：

即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。

本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。

2、电子计数器计数法:

电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。

该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。

3、活细胞计数法

常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。

广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。

4、比浊法

比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。

此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。

5、测定细胞重量法

此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。

此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。

6、测定细胞总氮量或总碳量

氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。

7、颜色改变单位法（colour change unit,简称CCU）

这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支原体固体培养很困难，用cfu法也不容易计数，因此需要用特殊的计数方法，即CCU法。它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲原体为例，简单介绍其操作：

（1）.取12只无菌试管，每一管装1.8ml解脲脲原体培养基。

（2）.在第一管加入0.2ml待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2ml加入第二管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到最末一管

（3）.于37度培养，以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的最大代谢活力，比如第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是10的6次方CCU/ml.

一般来说，比浊法和菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数，但是对支原体这样比较特

殊的微生物，用CCU法比较合适。

测定微生物生长的方法很多，各种方法均有其优缺点，也不是在任何情况下都适用。在微生物学工作中一般常用的是平皿菌落计数法、计数器法和比浊法。至于哪种方法比较适合你，得根据你的具体条件而定。

分离和纯化

一、目的要求

掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化物的基本操作技术。

二、基本原理

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其包括两个方面：

1.选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；

2.微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等计数来完成的。

纯培养的确定：

1.确定其菌落观察特征；

2.结合显微镜检测个体形态特征的确定。

三、器材

1.菌种迷曲霉；

2.培养基高氏Ⅰ号培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基；

3.溶液或试剂 10%酚盛9ml无菌水的试管盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂；

4.仪器或者其他用具无菌玻璃涂棒无菌吸管接种环无菌培养皿链霉素和土样显微镜血细胞计数板等。

四、操作步骤

1. 稀释涂布平板法

(1) 倒平板将肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏Ⅰ号琼脂培养基；马丁氏琼脂培养基加热溶化，待冷至55~60℃，高氏Ⅰ号琼脂培养基加入10%酚数滴，马丁氏琼脂培养基加入链霉素溶液。混匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿；

(2) 制备土壤稀释溶液称取土样10g，放入盛有90ml无菌水并带入玻璃珠的三角烧瓶，振动约20min，使土样与水分混合，将细胞分散.用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释的土壤溶液；

(3) 涂布将上述每种培养基的三个平板地面分别用记号笔写上10-4，10-5，10-6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4，10-5，10-6三管土壤稀释液中各取0.1ml对号放入已写好室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基；

(4) 培养将高氏Ⅰ号琼脂培养基平板;马丁氏琼脂培养基平板倒置于28℃温室中培养3~5day，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2~3day；

(5) 挑菌落将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室培养，大菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获