酶联免疫方法的原理及详细操作步骤共55页文档
酶联免疫吸附法步骤
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酶联免疫吸附法步骤（大纲）一、酶联免疫吸附法（ELISA）概述1.1ELISA的定义及原理1.2ELISA的分类及应用二、实验准备2.1试剂与材料准备2.1.1主要试剂2.1.2主要材料2.2仪器设备准备2.2.1温度与湿度控制设备2.2.2混合与振荡设备2.2.3其他仪器设备三、实验步骤3.1微孔板的包被3.1.1包被抗原/抗体3.1.2包被后处理3.2封闭3.2.1封闭液的选择3.2.2封闭处理3.3样本及标准品的加入3.3.1样本稀释3.3.2加入标准品与样本3.4抗原/抗体结合3.4.1结合时间与条件3.4.2洗涤3.5酶标二抗的加入3.5.1酶标二抗的稀释3.5.2酶标二抗的结合3.6洗涤3.6.1洗涤次数与条件3.6.2洗涤液的选择3.7显色反应3.7.1底物的选择3.7.2显色条件3.8终止反应3.8.1终止液的选择3.8.2终止反应操作四、结果与分析4.1光密度值（OD值）测定4.2标准曲线的制作4.3结果计算与判断五、实验注意事项及质量控制5.1实验操作注意事项5.2质量控制措施5.2.1试剂质量控制5.2.2设备与操作规范5.2.3数据处理与分析六、实验结果的临床应用与意义6.1ELISA在临床检测中的应用6.2ELISA结果的临床意义及局限性6.3检测结果与临床诊断的关联分析一、酶联免疫吸附法（ELISA）概述酶联免疫吸附法（ELISA），是一种常用于检测和分析生物样本中蛋白质、多肽、抗体等生物大分子的分析技术。
酶联免疫吸附法原理
酶联免疫吸附法原理酶联免疫吸附法（ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物制药等领域。
它通过酶与抗原或抗体的特异性结合来检测样品中特定的蛋白质分子，具有高灵敏度、高特异性和简便易行的特点。
下面将详细介绍酶联免疫吸附法的原理。
首先，酶联免疫吸附法的基本原理是利用酶标记的抗体或抗原与待检测的抗原或抗体结合，再通过酶底物的作用来间接或直接检测样品中的特定蛋白质。
整个实验过程可以分为固相吸附、特异性结合、非特异性结合和酶底物反应等步骤。
固相吸附是酶联免疫吸附法的第一步，通常将待检测的抗原或抗体通过物理吸附或共价结合的方式固定在固相载体（如微孔板）上。
这样做的目的是为了使待检测的抗原或抗体能够与酶标记的抗体或抗原发生特异性结合。
特异性结合是酶联免疫吸附法的关键步骤，它是指将酶标记的抗体或抗原与待检测的抗原或抗体发生特异性结合。
在这一步骤中，酶标记的抗体或抗原将与待检测的抗原或抗体形成免疫复合物，而非特异性结合则会被洗涤去除。
非特异性结合是指除了特异性结合外，固相载体上还可能存在一些非特异性结合的情况。
为了减少非特异性结合的干扰，需要通过洗涤的方式将非特异性结合的物质去除，以保证后续的酶底物反应的准确性和特异性。
最后，酶底物反应是酶联免疫吸附法的最后一步，当酶标记的抗体或抗原与待检测的抗原或抗体发生特异性结合后，加入酶底物后，酶将催化底物的变化，产生可测量的信号。
通过测定信号的强度或颜色的变化，可以间接或直接检测样品中特定蛋白质的含量或存在情况。
总的来说，酶联免疫吸附法是一种基于酶与抗原或抗体的特异性结合来检测特定蛋白质的技术。
它通过固相吸附、特异性结合、非特异性结合和酶底物反应等步骤，实现对样品中特定蛋白质的高灵敏度、高特异性的检测。
在实际应用中，酶联免疫吸附法已经成为生物医学研究和临床诊断中不可或缺的重要技术手段。
酶联免疫操作方法
酶联免疫操作方法
酶联免疫操作方法是一种用于检测和定量分析特定蛋白质的技术方法。
以下是一般的酶联免疫操作方法的步骤：
1. 杂交：将待检的抗原或抗体固定在固相载体上，如微孔板或膜。
可以通过直接插入法或被动吸附法将抗原或抗体与载体结合。
2. 阻断：在固相载体上，加入一种非特异性蛋白质（如牛血清蛋白，BSA）或洗脱缓冲液来阻断未被固定的表面；这样可以减少非特异性结合。
3. 反应：加入待测样品，使其与固相上的抗原或抗体结合。
待测样品可能是抗原，也可能是抗体。
4. 洗涤：用洗涤缓冲液彻底洗涤固相载体，以去除未结合的物质，尤其是非特异性结合。
5. 标记：加入与待检测物质相匹配的标记物，如酶标签，荧光标记或放射性标记。
6. 反应：与酶标签或其他标记物相互作用，生成底物反应产物。
这种反应可用于颜色变化、荧光或放射性计数等信号读取。
7. 终止反应：加入终止试剂停止底物反应。
8. 测量：测量反应产物的信号强度，通过比较标准曲线或对照样品来定量待测物质的浓度。
以上是一般酶联免疫操作方法的步骤，不同的实验可以根据需要进行适当的调整。
酶联免疫吸附技术的原理及应用
酶联免疫吸附技术的原理及应用引言酶联免疫吸附技术是一种常用的免疫学实验方法，通过标记酶的抗体来检测特定的抗原。
它具有高灵敏度、高特异性的优点，在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域得到广泛应用。
本文将详细介绍酶联免疫吸附技术的原理和应用。
原理酶联免疫吸附技术是基于免疫反应的原理进行设计的。
主要原理包括免疫反应、酶标记和酶促反应三个方面。
1.免疫反应–酶联免疫吸附技术是基于抗原-抗体反应的原理，特异性抗原与其对应的抗体结合形成免疫复合物。
–免疫反应的特异性保证了酶联免疫吸附技术能够准确检测目标抗原。
2.酶标记–在酶联免疫吸附技术中，为了使免疫复合物形成可检测的信号，常用酶对抗体进行标记。
–常用的酶标记物包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
这些酶具有较高的特异性和灵敏度。
3.酶促反应–酶联免疫吸附技术利用标记酶的催化作用，将底物转化为可见的色素或荧光信号。
–常用的底物包括TMB（3,3’,5,5’-四甲基苯基亚硝基态苯胺）、ABTS（2,2’-氨基二乙基三甲基苯并噻唑磺酸盐）等。
应用酶联免疫吸附技术在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域有着广泛的应用。
1.生物医学研究–酶联免疫吸附技术可以用于研究抗原与抗体的相互作用，进而研究疾病的发生机制。
–可以检测细胞因子、生长因子、蛋白质等生物分子的含量和表达水平。
2.临床诊断–酶联免疫吸附技术在临床诊断中常用于检测病原微生物、肿瘤标志物等。
–可以用于快速、准确地诊断疾病，对临床诊断起到重要作用。
3.药物开发–酶联免疫吸附技术在药物开发中可以用于筛选药物候选化合物的特异性和亲和性。
–可以评估药物的药效和毒性，加快药物研发的进程。
总结酶联免疫吸附技术是一种重要的实验方法，其原理简单、灵敏度高，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。
随着科学技术的不断进步，酶联免疫吸附技术将继续发挥重要作用，为人类的健康和医学进步做出贡献。
酶联免疫方法原理与详细操作步骤
对照 标本 结果
第三十一页，共56页。
原理 3.2.4 结合物的保存来自类型试剂 准备
酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年 左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉 素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠）。
对照 标本 结果
第二十页，共56页。
原理
类型 试剂 准备
不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质 较多的抗原也可采用捕获包被法。
亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的
原理
类型 试剂 准备
3.1.4 包被用抗体 IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。 取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。 腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下， 用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
3. ELISA的试剂(A、B、C三部分)
ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液
原理
2.2.3 间接法测抗体
类型
试剂 准备
对照
标本 结果
传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
酶联免疫的操作方法
酶联免疫的操作方法酶联免疫是一种常见的免疫测定方法，常用于检测抗原或抗体的存在和浓度。
其操作方法如下：1. 抗原包被：首先，将待检测样品中的抗原加入到含有特异性抗体的孔或固相载体表面，通过吸附或共价键结合的方式，将抗原固定在孔或固相载体上。
这样做是为了使抗原与特异性抗体充分结合，形成抗原-抗体复合物。
2. 洗涤：将包被好的板子或固相载体进行洗涤，去除非特异性结合物，减少误差的发生。
3. 反应：将与抗原-抗体复合物结合的二抗（或识别抗体）加入孔或固相载体中，与复合物发生特异性结合。
该二抗预先被连接上与酶（通常是辣根过氧化物酶HRP）结合的分子，因此称之为辣根过氧化物酶标记的二抗。
4. 洗涤：将孔或固相载体进行洗涤，去除非特异性结合物。
5. 底物添加：将染色底物加入孔或固相载体中，底物在酶的作用下，发生可见的颜色反应。
该底物通常是染色体底物或亚硝酸4-硫酸钠。
6. 反应停止：通过加入酸或碱，停止底物的反应，并阻止底物继续发色。
7. 反应评估：测量底物反应产生的颜色强度或发光强度，使用光度计或发光仪等设备进行测定。
酶联免疫方法优点如下：- 高灵敏度：酶标记可提供较强的信号，使检测到的目标物浓度可达到可靠的程度。
- 特异性：通过使用具有特异性的抗体或抗原，酶联免疫能够准确检测目标物。
- 简单易行：操作相对简单，无需复杂的实验条件和设备。
- 可量化：根据底物反应的强度，可以定量测定目标物的含量。
- 高通量：酶联免疫可同时处理多个样品，提高工作效率。
然而，酶联免疫也有一些局限性，例如：- 检测范围受限：传统的酶联免疫方法通常只能在较低至中等浓度范围内进行可靠的检测，对于高浓度的目标物可能不敏感。
- 受干扰物影响：某些样品中可能含有干扰物质，如脂质、乳糖、硫醇等，它们可能影响酶的活性或干扰底物的测定。
- 特异性限制：一些高度相似的抗原或抗体可能导致交叉反应，从而降低特异性。
总的来说，酶联免疫是一种常用的免疫测定方法，通过将抗原或抗体固定在固相载体上，并利用酶的催化反应使其产生可见的颜色或发光信号，从而实现对目标物的检测和定量。
酶联免疫吸附试验的原理、操作方法及注意事项
影响实验结果 。 因此 ， Ｅ ＩＡ试验实际操作 中除了 在 ＬＳ 选 择优 良仪器设 备和试 剂外 ，正确 的操 作是保 证
ＥＩ ＬＳ Ａ检测结果准确可靠的必要条件。 必须熟知试验
每 次 加样 必 须 更 换 吸头 ，做 到 １ 样 品 １个 吸 个
振动 ３ 秒 ， Ｏ 使底物与终止液充分混合再读数 。
４７酶标仪读数 环节 ．
使 用 前 应 先 预热 仪 器 １～ ０分 钟 ，并 调 整 到 试 ５３
验要求 的波长 ， 使测定结果更稳定。 最 好 先 擦拭 微 孔 板底 部并 压 平 板条 ，避 免 反 应 板底划痕 、 不平 、 印或 液面高度差异造成 干扰 ， 指 致 使读数结果不准确 。因此要保持酶标板干净， 不能用 手触 摸板 底 留下指 印 。
４５ 洗 涤 反 应 板 环 节 ．
ＥＩ ＬＳ Ａ试验是靠洗 涤来达到分离游离 和结合 的 酶标记物。 酶联免疫 吸附板每次洗涤要充分。 通过洗 涤 以消除残 留在板孔 中没能与固体抗原或抗体结合 的物质 ，以及在反应过程 中非特异吸附于固相载体 上的干扰物质 。如果洗涤不充分 ， 应该除去的杂质没 有洗 掉 ， 这样 就会 影 响试验 结果 。 洗板时需保证微孔板平放 ， 将洗涤液注满各孔 ， 尽量避免漏液 、 溢液现象。
Ｅ ＩＡ反应终 止 后需 要在 １ ＬＳ Ｏ分钟 内读 数 ，否则
头 ，以免发生交叉 污染。每次加样应加在板孔的底
部 ， 免加在孔壁上部 ， 注意不可溅 出 ， 可产生 避 并 不 气泡 ， 以免加 样 不 准确 ， 响 试验结 果 。 影
酶联免疫反应的原理
酶联免疫反应的原理
酶联免疫反应（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）
是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析目标物（例如蛋白质、抗原或抗体）在样本中的存在和浓度。
酶联免疫反应的原理基于特定抗原与其对应的抗体的高度特异性结合。
典型的酶联免疫反应包括以下步骤：
1. 固定：首先，在固相（例如试管、酶标板等）表面上，直接或间接地固定特定抗原或抗体。
直接固定指将抗原或抗体直接吸附在固相上，而间接固定则需要先加入一种可与抗原或抗体结合的二抗。
2. 绑定：样本中的目标物与固定的抗体或抗原结合形成复合物。
如果样本中含有目标物，则目标物将与固定的抗体结合；如果样本中含有抗体，则抗体将与固定的抗原结合。
3. 洗涤：通过洗涤步骤去除未结合的物质，以减少非特异性背景信号。
4. 信号发生：添加与目标物结合的检测抗体。
检测抗体通常会与目标物不同的部位结合。
这个检测抗体可以是已标记的抗体，其标记物可以是酶（例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）等，也可以是免疫荧光、生物素/亲和素等。
5. 洗涤：再次通过洗涤步骤去除未结合的检测抗体。
6. 信号测定：将适合于检测的底物（例如染色底物、荧光底物或发光底物）添加到反应体系中，底物在酶的作用下产生可测量的信号。
酶标板读板仪等设备可测量这种信号的强度。
通过测量光学信号的强度，可以确定目标物在样本中的存在和浓度。
由于酶标记的检测抗体产生的信号可被放大，酶联免疫反应具有高灵敏度和特异性，被广泛用于医学诊断、生物学研究以及药物研发等领域。
酶联法_精品文档
酶联法酶联法：原理、应用和发展趋势摘要：酶联法是一种常用的生物分析方法，通过酶和底物之间的反应来检测目标物质的存在和浓度。
本文将介绍酶联法的原理、应用领域以及其在生物技术研究中的发展趋势。
引言酶联法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种利用酶与抗原或抗体之间的特异性反应来检测目标物质的方法。
ELISA的发展与应用在免疫学、临床诊断、药物研发等领域中得到了广泛的应用。
它的优势在于高灵敏度与高特异性，可以同时检测大量的样本，且操作简便、快速。
一、酶联法的原理酶联法的原理是基于酶与底物之间的特异性反应。
一般而言，ELISA 可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA以及间接竞争ELISA等常用的类型。
以间接ELISA为例，其主要步骤包括涂布、封闭、孵育、洗涤、二抗结合、酶标记物共价结合、洗涤和染色等步骤。
通过测定酶标记物与底物的反应来检测目标物质的存在和浓度。
二、酶联法的应用1. 免疫学研究酶联法在免疫学研究中得到了广泛的应用。
通过酶联法可以检测和定量研究抗原和抗体之间的相互作用。
通过测定酶标记物的活性，可以了解抗原或抗体的浓度、亲和力以及免疫反应的强度等。
酶联法在疫苗研发、抗体工程以及疾病诊断方面具有重要的应用价值。
2. 临床诊断在临床诊断中，酶联法是一种常用的检测方法。
它可以用于体液样本（如血清、尿液等）中特定蛋白质的检测。
例如，酶联法可以用于肝炎病毒、艾滋病病毒等病原体的检测，有助于早期诊断和治疗。
此外，酶联法还可以应用于甲状腺功能、肿瘤标志物等的检测，为医生提供准确的诊断依据。
3. 环境监测酶联法在环境监测中也有着重要的应用。
例如，它可以用于检测水体中的有害物质、重金属离子以及农药残留等。
采用酶联法进行环境监测可以在一定程度上提高检测的灵敏度和准确性。
三、酶联法的发展趋势随着生物技术的发展，酶联法也在不断的创新与发展中。
以下是酶联法未来的发展趋势：1. 自动化与高通量随着技术的进步，自动化技术被广泛应用于实验室中。
酶联免疫吸附试验(双抗夹心法)原理
酶联免疫吸附试验（ELISA），又称酶联免疫吸附测定法，是目前广泛用于生物化学和免疫学领域的一种重要实验方法。
该技术结合了免疫学和生物化学的原理，能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，对临床诊断、生物医学研究以及生物制药等领域有着广泛的应用。
在本文中，我们将深入探讨酶联免疫吸附试验的原理、方法和应用。
一、酶联免疫吸附试验原理酶联免疫吸附试验的原理主要是利用酶标记抗体、抗原和底物的相互作用来检测特定物质的存在。
在双抗夹心法中，试验基本步骤如下：1. 用待测抗原溶液在固相酶标记抗体包被的微孔板上，充分接触和结合。
2. 经洗涤后，底物溶液被加入，并与酶标记抗体包被的复合物结合。
3. 底物受酶催化分解后，生成有色产物，通过比色法测定其光密度，间接测定抗原的含量。
在实验过程中，我们不能忽视的是标本处理、试剂选用、仪器操作等一系列实验细节，这些都对实验结果的准确性和重复性有着重要的影响。
二、酶联免疫吸附试验的方法不同类型的酶联免疫吸附试验方法包括间接法、夹心法、竞争法和直接法等。
在这次我们重点讨论的是双抗夹心法。
该方法通过将待测抗原与固相酶标记抗体和液相抗体结合，从而提高了对待测抗原的灵敏度和特异性。
这种方法在免疫学研究、传染病诊断和药物检测等方面具有重要的应用价值。
除了双抗夹心法，间接法通过检测待测抗体也是常用的酶联免疫吸附试验方法。
在实验设计中，根据不同的研究目的和样本特性，我们可以选择不同的方法来进行实验设计和操作。
三、酶联免疫吸附试验的应用酶联免疫吸附试验在临床诊断、疫苗研制、传染病监测、生物药品开发等领域有着广泛的应用。
它能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，为疾病诊断和药物研发提供了重要的技术支持。
在临床诊断中，酶联免疫吸附试验被广泛应用于传染病的早期诊断和鉴定。
HIV抗体检测、甲型肝炎抗原检测等都是通过酶联免疫吸附试验来完成的。
酶联免疫吸附试验还被应用于药物和疫苗的开发和监控过程中，能够全面地评价新药和疫苗的免疫原性和保护效果。
简述酶联免疫吸附试验的原理及基本步骤
简述酶联免疫吸附试验的原理及基本步骤酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析样本中的特定抗原或抗体。
ELISA的原理是利用抗原与抗体的特异性结合来检测和测量样本中的目标物质。
ELISA通常分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等几种类型，但它们的基本原理相似。
一般来说，ELISA的基本步骤包括以下几个方面：1. 涂层：将特异性抗体固定在试验板的表面上，通常是通过将抗体溶液加入试验板孔中，然后在适当条件下进行孵育。
固定在试验板上的抗体将被用于捕获待检测的抗原或抗体。
2. 绑定：将待检测的样本加入试验板中，样本中的抗原或抗体与固定在试验板上的抗体发生特异性结合。
样本中的目标物质与固定在试验板上的抗体形成抗原-抗体复合物。
3. 洗涤：洗涤试验板以去除未结合的样品成分。
这一步骤的目的是去除非特异性结合的物质，以减少背景干扰。
4. 检测：加入辅助抗体(常为酶标记的抗体)，该抗体能够与已结合在试验板上的抗原-抗体复合物发生特异性结合。
这些酶标记的抗体可以是与抗体结合的酶，如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)。
然后，添加适当的底物使酶产生可检测的信号。
5. 信号检测：通过所使用酶催化的底物的反应产生的颜色或荧光等信号，可以对样品中目标物质的含量进行定量测量。
这一步骤可以使用吸光度计或荧光分析仪进行信号的测量和记录。
ELISA具有高灵敏度和特异性，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域，用于检测病原体、抗体、激素、药物等物质的存在和浓度。
它不仅可以用于疾病的诊断和监测，还可以用于药物筛选、生物分子的定量分析和研究等。
简述酶联免疫吸附试验的原理及基本步骤
简述酶联免疫吸附试验的原理及基本步骤酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测体内特定抗原或抗体的存在和数量。
其原理基于抗原-抗体的特异性结合作用以及酶的催化作用。
酶联免疫吸附试验的原理：酶联免疫吸附试验主要利用酶作为标记物，将待检测的抗原或抗体与其特异性抗体或抗原结合，再用酶标记抗体或抗原与待检测物结合，形成酶-抗原-抗体或酶-抗体-抗原复合物。
最后通过酶反应产生的色素变化或发光信号，来间接或直接定量分析待检测物的含量。
酶联免疫吸附试验的基本步骤：1.固相抗原或抗体的吸附：在反应板的孔中吸附抗原或抗体。
一般采用多孔吸附板作为载体，将抗原或抗体溶液加入孔中，经过一段时间的孵育后，以使抗原或抗体与孔板表面结合。
2.无特异性位点的封闭：将未被吸附的非特异性蛋白质如牛血清蛋白（BSA）添加到孔中，对未被特异性抗原或抗体吸附的区域进行封闭，防止非特异性结合的发生。
3.加入标记物：加入被标记的抗体或抗原，使其与孔中的特异性抗原或抗体发生特异性结合。
常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。
4.洗涤：用缓冲液洗涤孔中多余的未结合抗体或抗原，降低非特异性背景。
5.底物反应：加入适当的酶底物，酶底物与酶结合发生催化反应，使底物产生颜色或发光等可检测的反应产物。
6.反应终止：加入终止剂，停止底物的反应，防止颜色或发光信号进一步变化。
7.读取结果：使用酶标仪或光度计测定标记物的颜色或发光强度，根据标准曲线计算出待检测物的浓度。
总体来说，酶联免疫吸附试验通过特异性抗原-抗体结合和酶催化反应，可以间接或直接测定体内特定抗原或抗体的含量，具有灵敏度高、特异性强和操作简便等优点，因此在医学诊断、病毒学研究和生物学实验等领域得到广泛应用。
酶联免疫吸附测定法(最全版)PTT文档
05%吐温20的磷酸盐缓冲液。
实验原理 双抗体夹心法
双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测 抗原最常用ELISA，适用于检测分子中具有至少 两个抗原决定簇的多价抗原。 其基本工作原理是：利用连接于固相载体上 的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子 上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶 标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原 的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的 底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测 抗原含量。
1ml，37℃10～30分钟。 AP用NaOH终止 复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。
①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）
在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷 酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 也可测O·D值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2. 具有酶促反应，显示出生物放大作用。
出结果。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附 性增加。
酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产
物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。 在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷 酸酶(alkaline phosohatase, AP)。
酶的底物
酶联免疫吸附测定法
基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待
测物与酶连接，然后通过酶与底物产生 颜色反应，用于定量测定。测定的对象 可以是抗体也可以是抗原。
酶联免疫吸附试验的原理_操作方法及注意事项_李华林
誅卫生防疫酶联免疫吸附（ELISA）试验具有灵敏性、特异性高，且重复性好，检测速度快的特点，尤其适合于大批量血清样品的检测，是国际认可的标准化诊断方法。
我国目前广泛应用该方法进行疫病流行病学调查和免疫抗体监测，评价疫苗免疫效力。
1基本原理将抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
抗原或抗体再与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本（测定的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。
因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
此种显色反应可通过酶标仪进行定量测定。
由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
这就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性相结合，使ELISA方法成为既特异又敏感的检测方法。
2基本类型及用途间接ELISA主要用于检测抗体，双抗体法用于检测大分子抗原，双夹心法用于测定大分子抗原，液相阻断ELISA用于测定抗体，竞争ELISA用于测定小分子抗原及半抗原，抗体捕捉ELISA法主要用于检测IgM抗体。
3操作方法3.1间接酶联免疫吸附方法间接法是检测抗体比较常用的方法。
主要是利用酶标记的抗抗体检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。
操作步骤如下。
将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加稀释的受检血清，其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。
其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。